老年大鼠慢性阻塞性肺疾病模型建立后認知功能的變化

萬朝暉 劉冰 景珩 吳蘇寧

【摘要】 目的：探討老年大鼠慢性阻塞性肺疾病模型建立后認知功能的變化。方法：選擇60只老年雄性SD大鼠，按照隨機數字表法分為COPD組（30只）和對照組（30只）。COPD組大鼠采用氣道內滴注脂多糖和香煙煙熏法建立慢性阻塞性肺疾病模型。模型建立后，采用HE染色法觀察兩組的組織形態學變化。在慢性阻塞性肺疾病模型建立后的第1、7、14、30天，采用Morris水迷宮系統檢測兩組的平均逃避潛伏期。采用t檢驗和重復測量方差分析比較兩組平均逃避潛伏期的差異和變化。結果：實驗期間，COPD組3只大鼠死亡，對照組2只大鼠死亡，其余大鼠存活良好。HE染色顯示兩組間有顯著性差異。干預前，兩組平均逃避潛伏期比較，差異無統計學意義（P>0.05）;慢性阻塞性肺疾病模型建立后第1、7、14、30天，COPD組老年大鼠的平均逃避潛伏期均明顯長于對照組（P<0.05），差異逐漸增大。結論：慢性阻塞性肺疾病模型建立后，老年大鼠的平均逃避潛伏期增加，認知功能下降，隨著時間的推移，老年大鼠的認知功能越來越差，應早期進行臨床干預。

【關鍵詞】 慢性阻塞性肺疾病 老年 認知功能

Changes of Cognitive Function after Establishment of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Elderly Rats/WAN Zhaohui， LIU Bing， JING Heng， WU Suning. //Medical Innovation of China， 2021， 18（33）： 00-008

[Abstract] Objective： To explore the changes of cognitive function of aged rats after the establishment of chronic obstructive pulmonary disease model. Method： A total of 60 aged male SD rats were selected and divided into the COPD group （30 rats） and the control group （30 rats） according to the method of random number table. The COPD group rats were established COPD model by intratracheal instillation of lipopolysaccharide and fumigation. After the establishment of the model， HE staining was used to observe the histopathological changes of the two groups. On the first day and the 7th， 14th and 30th day after the establishment of the COPD model， Morris water maze system was used to detect the average escape latency of the two groups， t-test and repeated measurement analysis of variance were used to compare the differences and changes of the average escape latency of the two groups. Result： During the experiment， 3 rats in the COPD group died， 2 rats in the control group died， and the other rats survived well. HE staining showed that there was significant difference between the two groups. Before intervention， there was no significant difference in the average escape latency between the two groups （P>0.05）; on the first day， the 7th， 14th and 30th day after the establishment of COPD model， the average escape latency time of the old rats in the COPD group were significantly longer than those of the control group （P<0.05）， the difference gradually increased. Conclusion： After the establishment of COPD model， the average escape latency of elderly rats increases and the cognitive function decreases， with the passage of time， the cognitive function of elderly rats becomes worse and worse， so clinical intervention should be carried out early.

[Key words] COPD Elderly Cognitive function

First-author’s address： Jining First People’s Hospital， Jining 272100， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.33.002

慢性阻塞性肺疾病（COPD）具有顯著的肺外合并癥，神經系統功能障礙是COPD的主要肺外并發癥之一，通常表現為感覺運動功能障礙[1]，也有不同程度的短期和長期記憶障礙和注意力障礙[2-3]。認知功能障礙是指患者存在一項或多項功能受損如記憶、視空間覺、執行能力、計算和理解能力等。合并認知功能障礙的COPD患者生活質量明顯下降，再住院率及死亡率升高[4]。COPD患者認知障礙的風險隨著COPD持續時間而增加[5]。當血氧飽和度低于88%時，認知障礙的發生率增加了2.5倍[6]。Hoiland等[7]報道，長期氧療的COPD患者認知功能評分高于未進行氧療患者。因此，認知障礙與COPD嚴重程度存在相關性，但目前有關COPD病程中認知功能變化特征的研究較少。因此，本研究旨在建立老年大鼠COPD模型，同時評估不同時間點老年大鼠認知功能的變化，并與正常老年大鼠進行對比分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究選用60只雄性SD大鼠，月齡18～20個月，體重450～500 g，均購自北京乾信實驗動物有限公司。將大鼠按照隨機數字表法分為COPD組（n=30）和對照組（n=30）。大鼠被飼養在室溫26～28 ℃、每天日照時間為12 h的動物實驗室，所有大鼠能夠自由進食和飲水。在動物實驗室中適應性喂養1周后，對大鼠進行測試。

1.2 建立COPD模型 大鼠COPD模型采用氣道內滴注脂多糖和香煙煙熏法建立[8]。模型在30 d內完成。在第1、14天，將10%水合氯醛注射到大鼠的腹腔中進行麻醉。麻醉成功后，將200 μL脂多糖（1 g/L）注射入氣道。在第2天至第30天（第14天除外），大鼠每天早上和下午接受兩次煙熏，間隔時間超過6 h。將大鼠置于1 m3的密閉房間中，每天連續吸入香煙煙霧2次，每次10支香煙。對照組氣道內注射0.9%氯化鈉溶液。

1.3 觀察指標及判定標準 （1）組織形態學觀察。第31天應用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察兩組支氣管肺組織病理學變化。乙醇脫水、二甲苯透明、蠟杯浸泡、包埋和切片后，將染色的載玻片干燥。在光學顯微鏡下觀察兩組大鼠染色支氣管和肺組織的病理變化，進行形態學分析，確認COPD建模成功。（2）認知功能檢測。采用北京碩林苑科技有限公司設計的Morris水迷宮系統檢測大鼠的認知功能。控制室溫度為25 ℃，內部環境保持低光和安靜。向水池中加入水，水面覆蓋1 cm的平臺，調節水溫到25 ℃，水面被分成四個象限，即1、2、3、4，平臺被放置在第一象限的中心。大鼠分別從四個象限的中央面向池壁放入水中。觀察60 s，記錄大鼠找到并停留在平臺頂部的時間，即為逃避潛伏期，若60 s內未找到平臺或僅發現平臺的被記錄為60 s。取四個象限所用時間的平均值來計算平均逃避潛伏期。干預前，用上述方法訓練大鼠3 d，大鼠在進入水中前平均每次在平臺頂部停留20 s[8-9]。在COPD模型建立后的第1、7、14、30天，根據上述方法檢測并記錄平均逃避潛伏期。

1.4 統計學處理 采用SPSS 26.0統計軟件對所得數據進行處理。計量資料以（x±s）表示。兩組比較采用獨立樣本t檢驗。重復測量的數據采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 老年大鼠肺組織形態學觀察 在實驗過程中，由于建模不當和麻醉劑過量，COPD組有3只大鼠死亡、對照組有2只大鼠死亡。通過HE染色，對照組老年大鼠肺腔通暢、肺泡結構完整、形態正常、纖毛形態正常、支氣管平滑肌未見明顯增厚。COPD組的肺支氣管壁明顯增厚、管腔變窄、肺泡壁破裂并變薄、肺泡融合形成水泡、支氣管內有大量炎癥細胞浸潤、纖毛脫落并虛脫、大量上皮細胞脫落。見圖1。

2.2 兩組老年大鼠平均逃避潛伏期比較 干預前，兩組平均逃避潛伏期比較，差異無統計學意義（P>0.05）。在COPD模型建立后的第1、7、14、30天，COPD組老年大鼠的平均逃避潛伏期均明顯長于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;重復測量設計方差分析結果顯示，隨著時間的推移，COPD組內老年大鼠的平均逃避潛伏期逐漸增加（P<0.05），見表1和圖2。

3 討論

COPD是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的慢性炎癥性疾病，且在55歲之后發病率明顯增加[10]。一項基于中國縱向健康長壽調查的隊列研究顯示，COPD與中國老年人認知障礙和癡呆發病率增加獨立相關[11]。核磁共振分析發現，COPD患者進行性腦結構損傷、腦局部自發活動同步性異常、內在的功能樞紐和連接性改變與COPD相關認知障礙有關[12-13]，因此，早期識別COPD患者認知功能的變化對改善其預后尤為重要。Morris水迷宮模型是檢驗嚙齒動物模型學習記憶功能的經典實驗，能夠客觀反映動物模型的認知水平。平均逃避潛伏期越長，動物獲取空間信息的能力越差[14]。本研究采用最經典的Morris水迷宮系統檢測老年COPD大鼠的認知功能，結果表明，老年COPD大鼠的平均逃避潛伏期明顯高于對照組，且Morris等[2]報道，嚴重COPD的動物模型表現出顯著的記憶障礙、焦慮、運動和自主神經障礙，提示COPD模型的建立可導致老年大鼠認知功能障礙。

盡管大量研究證實COPD和認知障礙存在相關性，但目前有關肺功能、低氧血癥、疾病嚴重程度、病程等因素和認知障礙的風險仍不確定[11-12，15]，可能與不同研究方法相關，如評估量表、年齡、樣本量、缺乏適當的參照。一項基于COPD患者的前瞻性研究發現，基線COPD病史>5年患者認知障礙風險顯著增加，但在校正吸煙、糖尿病、高血壓、冠狀動脈疾病等因素后COPD與認知障礙風險增加無顯著相關性，經過認知障礙亞型分析，COPD患者非遺忘性認知障礙風險升高2倍[16]。而且一項對2 000名隨訪25年結果顯示，中年（39～64歲）診斷COPD在晚年（65～80歲）發生認知障礙的風險增加近2倍，反而晚年診斷COPD似乎與認知障礙呈負相關[17]，由此推測，COPD患者的認知障礙可能與COPD的持續時間呈“劑量依賴性”，認知障礙可能開始于慢性氣道損傷的早期階段[18]，但上述研究中COPD診斷來源于患者自我報告或醫療記錄，缺乏肺功能、病理學等依據，且基線和隨訪之間的較長時間間隔可能導致偏倚。因此，本研究通過設立4個觀察時間點客觀評估老年大鼠認知功能，結果發現隨著時間的增加老年大鼠的平均逃避潛伏期也逐漸增加（認知功能越來越差），表明COPD作為認知障礙的危險因素，早期積極治療COPD，對預防或延遲認知障礙的發生和發展有重要作用。

COPD患者的認知障礙獨立于肺部疾病相關危險因素（如年齡和吸煙等），但也受到相關危險因素和/或呼吸限制（如低氧血癥）的影響[7，19]。因此還需進一步研究證實COPD和認知障礙的關系及相關機制，以更好地理解COPD患者認知功能下降的發生發展。目前關于COPD患者認知障礙的潛在病理生理機制包括大腦缺氧、腦結構改變和與炎癥介質相關的神經元損傷[12-13]。研究顯示，COPD低氧血癥和認知障礙存在關系，氧氣療法和肺康復可降低認知障礙的風險[7]。但是COPD患者認知障礙的病理機制復雜多樣，低氧血癥本身并不能解釋COPD中發生的認知變化，也缺乏在大量人群中進行的前瞻性縱向研究。YIN等[13]研究發現，隨著COPD患者的癥狀從輕度到重度，患者腦的白質和灰質也表現出不同程度的損害。海洋生物活性化合物可以通過抗氧化、保護神經元細胞等機制延緩COPD患者認知功能下降[20]。另外，中性粒細胞與淋巴細胞比值與COPD的嚴重程度有關[13]，因此炎癥因子“溢出”可能導致COPD患者的認知障礙，未來的炎癥因子或二氧化碳潴留可能是COPD患者認知障礙的潛在機制。

綜上所述，本研究發現老年COPD大鼠的平均逃避潛伏期較對照組增加，認知功能下降，且隨著時間的推移，老年COPD大鼠的平均逃避潛伏期逐漸增加，老年COPD大鼠認知功能越來越差。因此，在臨床實踐中應注意評估COPD患者認知功能，并盡早進行臨床干預，對于提高COPD患者生活質量和降低死亡率非常重要。

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（收稿日期：2021-08-25） （本文編輯：占匯娟）