I-tip法在海綿微生物分離培養中的應用與改進

張乙宸 張嘉凱 張桓耀 張亦弛 郝正琦

關鍵詞：海洋動物微生物;分離;培養;I-tip技術

一、海洋動物——海綿

海洋動物有很多，其中研究比較廣泛的是海綿。海綿是一種籠統的稱呼，作為一種原始的多細胞動物很早便在地球上存在。淡水產和海產的海綿均存在，多數以固定落著的方式生長。海洋動物來源微生物的分離一般是采用平板分離法。平板分離法存在一定的局限性，對于這種方法，無法完美地對菌落進行分離，而且具有較高的被污染的風險。

二、兩相共流法

用注射器或其他擠壓設備將聚合物溶液滴入交聯劑中，經固化交聯形成具有一定機械強度的、穩定的水凝膠微球的方法稱為銳孔法（或擠出法）。

兩相共流法（Coflowing liquid stream method）：液滴形成裝置的主要部件是一個直徑幾百微米的用于擠出懸浮細胞的海藻酸鈉水溶液的針和一個直徑2.5毫米的海藻酸鈉管，通過這個管，擠出的溶液流人周圍不相容的液體石蠟中。針被放置在同軸小管附近的上游。黏性海藻酸鈉水溶液的液滴直徑可以通過改變內部和外部流體的速度以及針的直徑來控制，從幾十微米到幾百微米不等。利用300μm直徑的針頭，將細胞懸浮的海藻酸鈉溶液以1.2cm/s的速度擠壓到環境液體石蠟中，得到直徑為48±8μm的cho-kl細胞包裹液滴。分裂過程不影響封閉細胞的生存能力，因為封閉過程后超過95%的cho-kl細胞仍然存活。

以上為分散相口與微球制備裝置，該裝置主要由毛細玻璃管（4）、針頭（8）、緩沖池（5）、固定器（6）、恒流泵（2）、微量注射泵（1）等部分組成。

三、I-tip技術

I-tip技術是一種比較先進的分離培養的方法是Jung，Dawoon、Seo，Eun-Young、Epstein，Slava s.等2014年在研究海綿中微生物多樣性時使用的一種技術。

I-tip技術是復刻的原位培養，我們首先取用實驗室中的移取液體的滴液頭，然后對滴液頭進行機械切割處理，將處理好的裝置嵌入到原生動物的體表內部，嵌入深度為1.25～2.25em左右為宜，滴液頭的頂部用透明度較好的塑料薄膜封住，防止空氣的微生物進入原位培養的培養物中感染培養液。兩周之后，將所得到的分離物質接種到原生瓊脂培養皿中進行下一步的分離和培養，觀察所得的菌落數量和種類。

四、改進I-tip技術

在水族箱中培養海綿，用1000txL移液槍槍頭端作為裝置的基本元件，通過機械切片切板機床，將滴液頭按照相同的規格割至1.5em，將所得的原位收取器嵌入到海綿的體表，然后所得到的新型培養液加入原位培養器中，采用膠狀透明薄膜封口，處理好的微球用納米級別的過濾膜包住，然后放入移液頭里，形成有機統一的上下連接裝半密封的整體。培養兩周后，從每個水族箱中取出海綿和原生培養器。將收集的培養器的近寬一端用酒精處理后的機械刀片進行割片處理，再次使用微球，用微球對收集的原生培養器中的提取物再進行第二次的去離，連接方法處理完成后，使用無菌的接種環取出得到的分離溶液，接種培養到新型培養基，加入PA緩沖液進行充分的混合，在培養基底板上培養3～4周后進行觀察。

五、具體實驗方案

（一）試驗目的

從威海近海海域取來買來海綿（多孔動物），通過對照實驗，分別采用I-tip技術，微包埋法以及綜合兩者改進的混合方法對海綿微生物進行分離培養，探究改進后的I-tip技術是否對于篩選分離海綿微生物更加有效。

（二）采用機理

海洋微生物細胞通過具有自由進出能力的天然高分子材料包裹于通透性良好且允許氧氣、營養物質和代謝產物等發育環境之中。選擇良好性能的無毒無害的介質。用注射器或其他擠壓設備將聚合物溶液滴入交聯劑中，經鹽溶液中金屬陽離子的固化交聯形成具有一定機械強度的、穩定的水凝膠微球。本實驗采用的是海藻酸鈉包埋法，一般通過ca2+固化獲得海藻酸鈣微球。將溶液通過針頭滴入一定濃度的氯化鈣溶液中，鈣離子使海藻酸鈉分子內部發生交聯形成網格結構，形成海藻酸鈣凝膠微球。通過兩種方法的有機整合，形成原位生態位培養的培養容器，上寬下窄半密封式的培養條件位，更加有效的分離培養所去離的菌株，對于微生物去離和培育的研究具有的新的含義和用處。

（三）試驗材料

1.樣品來源

威海海域市場針海綿屬海綿，少部分采用威海近海海域沖積平原和人海口處潮間帶以及海底8000米深度的鈣質海綿。通過直接購買或者捕撈公司海底捕撈獲得，帶人實驗室用海水沖洗干凈后放入水族箱中進行培養。

2.儀器設備

注射器，小型擠壓儀器，200μL移液槍槍頭，60μm～100μm玻璃珠，150μm～212μm玻璃珠，超凈操作臺，機械切割臺。

3.試驗藥品

海藻酸鈉溶液，氯化鈣溶液，無菌PBS緩沖溶液，R2A瓊脂平板，瓊脂培養基，培養皿。

制備海藻酸鈉溶液：取用從威海近海岸帶濕的海藻，用海水清洗除雜，然后用去離子水進行2～3次沖洗，采用搗器進行細碎化處理，NaOH溶液萃取后澄清化，經氯化鈣沉淀得到海藻酸鈣微溶物，利用化學方法除去存在的可溶性雜質得到海藻酸沉淀，與碳酸鈉作用得海藻酸鈉，再經干燥和干篩后得到純凈的粉末，將制備好的粉末配置成溶液。

制備無菌PBS緩沖溶液：稱取磷酸二氫鉀（KH2P04）0.27g，磷酸氫二鈉（Na2nP04·12H20）1.42g，氯化鈉（NaCl）8g，氯化鉀（KCl）0.2g，吐溫-20，加去離子水約800mL充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調pH至7.4，最后定容到1L。

瓊脂培養基：馬鈴薯200g，瓊脂20.0g，葡萄糖20.0g，蒸餾水1000mL。將馬鈴薯洗皮，切成碎塊，加入煮沸20min。紗布過濾。濾液中加入葡萄糖和瓊脂，加熱使之溶化。再補足水量至1000mL，分裝，高壓滅菌23。

R2A瓊脂平板通過上海齊源生物科技公司購買。

（四）試驗方法

1.樣品處理

將威海海域市場針海綿屬海綿，少部分采用威海近海海域沖積平原和人海口處潮間帶以及海底8000米深度的鈣質海綿。帶回實驗室，放入水族箱中培養。

2.海綿微生物的分離

在水族箱中培養海綿，用1000μL移液槍槍頭端作為裝置的基本元件，通過機械切片切板機床，將滴液頭按照相同的規格割至1.5cm，將所得的原位收取器嵌入到海綿的體表，然后所得到的新型培養液加入原位培養器中，采用膠狀透明薄膜封口，處理好的微球用納米級別的過濾膜包住，然后放入移液頭里，形成有機統一的上下連接裝半密封的整體。培養2周后，從每個水族箱中取出海綿和原生培養器。將收集的培養器的近寬一端用酒精處理后的機械刀片進行割片處理，再次使用微球，用微球對收集的原生培養器中的提取物再進行第二次的去離，連接方法處理完成后，使用無菌的接種環取出得到的分離溶液，接種培養到新型培養基，加入PA緩沖液進行充分混合，在培養基底板上培養3～4周后進行觀察。

3.菌株的測定

將培養基上長出的菌落進行測定，采用基于分散液液微萃取技術（DLLME）的高效液相色譜法測定，得出菌落的種類，同時與對照組菌落種類，數量進行對比。

（五）預計試驗結果

請列表來表示出可能獲得的數據;數據處理的過程;預計的結論。

用微型觀測法處理所得的原生培養菌落，觀察并記錄新型方法分離下，去離得到的菌落的數量大小和種類情況。（六）實驗示意流程圖