間充質干細胞染色體制片技術的優化

夏福祥

摘要：近年來，在細胞醫學方面對于間充質干細胞的有關研究逐漸增多。間充質干細胞作為干細胞的一種，具有較強的分化潛能以及自我調控等特點。在國內外對間充質干細胞應用的諸多研究實踐當中，為能夠迅速擴大我國間充質干細胞品種的商品化生產面積及盡快滿足國內外臨床及應用中的特殊需求，對國內外間充質干細胞染色體的制片與技術問題進行開展了一系列各項深入研究探索與方案不斷得到優化，本文擬對有關間充質干細胞染色體的相關研究成果進行一個總結，并將討論今后在其他各項臨床研究項目中的關于間充質干細胞染色體的制片方面的技術，以期能夠滿足間充質干細胞的應用需求。

關鍵詞：間充質干細胞;染色體制片;細胞遺傳學;技術優化

引言：

間充質干細胞最早于骨髓中被發現，但目前在胚胎中所提取的間充質干細胞由于其活性及分化特性等方面較骨髓間充質干細胞更優良，因此在國內外受到廣泛關注。MSC胚胎也有可能由單獨地在同一病人患者體內或同一患者的體外胚胎直接地受宿主機體各種特定生物代謝活動條件等方面的基因誘導的影響情況下分化并發育增殖為寄主機體上各種功能相關的組織細胞，在進行體內胚胎傳代分化后的培養與增殖過程及經體內低溫冷凍保存和增殖處理后胚胎仍可能依然發育保持并具有表現了其一定或高度發育的各種遺傳功能分化特性和生殖潛能，我國醫學現階段目前對于體外MSC的研究及的一些臨床及應用領域主要是集中在于臨床上與在臨床中用于早期診斷或治療疾病的脊髓骨損傷、腦癱、系統性紅斑狼瘡綜合征后遺癥及小兒脊髓系統性硬化癥綜合征后等多種神經疾病診治中，大部分臨床研究實驗結果都令人滿意，因此逐漸將MSC的生產及應用擴大，并對其進行嚴格的質量控制。

一、間充質干細胞概述

MSC是最早的于哺乳動物骨髓細胞中而被研究發現，但是作為骨髓來源之一的MSC還存在難以制備難以質控、移植骨髓易脫落引起自體免疫反應降低等嚴重問題，2006年，我國科研人員于哺乳動物胎盤內及動物臍帶組織內中均分離培養出了MSC，這種骨髓來源還可永久保持原MSC的生物學特性，并且便于質控，冷凍后細胞損失較小，不易被感染。一般認為骨髓干細胞MSC移植具有很強大的分裂增殖復制能力和胚胎多反向地分化生長潛能，具有細胞免疫功能調節免疫功能，異體細胞移植胚胎排異較輕，在對MSC的質量控制當中大部分在于加強對MSC染色體制片技術等方面。

二、間充質干細胞染色體制片

染色體制片常用于對植物細胞進行制片，一般步驟包括對細胞的處理與固定、解離、染色、壓片等等，需要重點和注意到的這一點尤其是我們在進行染色體制片試驗的時候也特別地需要著重去關注到細胞分裂相數的相對數量多少與染色體形態。首先對于人體骨髓細胞的染色體制片中，常用秋水仙素進行制片前細胞處理，主要原因在于秋水仙素能夠使骨髓細胞保持在分裂中期，在制片后進行觀察時能夠觀察出組織形態良好的細胞組織。所需建議使用的秋水仙素濃度量為10μg/mL，然后放置于在37℃的培養箱環境中培養60min[1]。另外對于干細胞染色體制片還需注意低滲時間及室溫關系、固定液比例及固定次數、離心速度及時間、沖洗過程及制片過程等等。在廖繼東對胎肝干細胞抗原陽性細胞的研究過程中，對于細胞切片的制片工作中，載玻片是用多聚糖賴氨酸進行處理，在細胞切片制成后于60℃加熱，過夜固定[2]。在方利君等對家兔骨髓MSCs的體外培養試驗當中，選用了2.5g/L的胰酶室溫進行消化約5-10min時間[3]，在唐濤進行的MSC抑制大鼠骨關節炎作用的研究實驗研究當中，將骨髓MSC暴露于約37℃、5%的CO2的飽和濕度環境進行體外培養，0.25%的胰蛋白酶進行體外消化試驗[4]，在MSC體內向骨骼肌樣細胞分化生實驗中將胚胎與MSC胚胎同樣保存于溫度37℃、體積分數大于5%和CO2超飽和高濕度空氣中進行培養，用0.25%的胰酶液在室溫37℃狀態下進行消化約1小時-5min[5]。在國外對MSC細胞的分離培養及其制片加工過程實驗當中，隨著科學家對純化MSC技術研究領域的了解不斷得到深入，在細胞處理分離方面，常分別使用了密度梯度離心法、貼壁篩選法及對流式細胞儀分選法純化等純化方法來直接獲得純度較優純化的純化MSC的細胞，以進行染色體制片過程[6]。在歐陽明玥的研究當中，MSC的處理經DPBS洗滌兩次后，在室溫下450×g離心5 min進行離心，保障干細胞獲得良好的分裂相[7]。在對大鼠間充質干細胞的分離與培養研究當中，李延清對離心時間進行了測試，選取其中離心程度最佳的離心速度與實踐進行細胞分離操作[8]。較快的離心速度或較長的離心時間都容易造成細胞破裂，影響制片，因此一般離心速度都在1000轉/min之內，時間小于10min。孫亞東對人胎兒肺間充質干細胞染色體的制備便采用1000r/min離心5min來獲取細胞，然后從細胞膜的破損率來確定制片所需的最佳低滲處理時間。低滲可以使細胞膨脹，從而促進染色體在細胞內均勻地分散開來，制成良好的染色體標本[9]。

間充質不僅能從骨髓中獲得，目前也有研究從羊水間獲取間充質干細胞，在對其進行培養制片時，用2-3μg/ml 的秋水仙素對細胞進行前處理，培養4-6h，再以1000 r/min的速度離心10 min，37℃低滲5 min，在預固定與固定中均在加入固定液之后，以1000 r/min 離心5 min，再進行烤片、顯帶與染色[10]。在對人外周血骨髓間充質干細胞的分離培養實驗當中，采用了密度梯度離心技術的方法，經5%C02，37℃，飽和濕度條件下進行干細胞培養后，用0.25%胰酶對細胞進行消化[11]。在對大鼠骨髓間充質干細胞的體外分離與純化等課題研究項目當中，均認為是在37℃，5%的CO2低飽和的濕度狀態下進行離心培養，而張本斯則是采用密度梯度離心法，在每分鐘1000轉/min條件下連續離心培養10min，用胰蛋白酶進行體外消化試驗[12]，在肖鑾娟的分離純化實驗當中，應用0.25%的胰蛋白酶及0.02%EDTA進行消化功能培養，對MSC進行預處理[13]。

三、間充質干細胞染色體制片技術的優化

從上述對間充質干細胞進行染色體制片的研究當中，對MSC進行染色體制片時，首先需對MSC進行培養，大多數研究都是采用秋水仙堿來進行處理分散干細胞內的染色體，由此來確定低滲溶液的濃度，再用胰酶來進行消化。在大多數實驗當中，均是采用0.25%的胰酶來對細胞內的蛋白質進行消化，然后進行離心。低滲溶液則為KCL溶液，在37℃下進行，低滲時間根據實驗不同而不同，然后在預固定及固定當中，也需進行離心，再進行烤帶、顯帶與染色。陳茂勝對間充質干細胞染色體制片技術進行了優化，他采用20μg/ml的秋水仙堿培養2h10min，用0.05%胰酶在37℃下進行消化，以1500rpm離心10min，由此來確定低滲溶液的濃度及低滲時間[14]。吳雄志在對骨髓間充質干細胞的研究中則使用胰蛋白酶進行了20min的消化[15]。在進行低滲濾液操作時，國外一般控制在15-30℃之間，控制在20min以內，而國內則大多數控制在37℃之內，并且對低滲的時間與控制室溫度還需分別進行分析及計算，以實驗室溫度為分析基礎來分別計算得出最佳的低滲時間，低滲濃度常為0.075mol/L。在預埋固定與固定試驗當中，需嚴格確定固定液量的使用比例范圍及固定的次數，實驗室工作中最常用的冰醋酸：甲醇=1：2/1：3進行固定，來保證染色體的形狀保持原樣，在進行預固定及固定時也需進行離心操作，然后再進行烤片等過程。在滴加染液進行染色時，一般采用移液器吸取10μl，再蓋上玻片。這種方法能夠保證MSC細胞染色均勻，且操作簡單[16]。在反復進行的實驗工作當中，確定出能夠保證獲得最佳數據質量的處理液體濃度、離心時間、固定液比例等等，干細胞的細胞密度越大，分析效果越好，因此可從細胞密度來對MSC染色體制片的質量進行把控，提高制片質量，為后期的MSC研究提供便利。

參考文獻：

[1]陳超，周婷婷，王雙閣，等.骨髓染色體制片方法探討[J].中國保健營養，2021，31（4）：5.

[2]廖繼東，張洹.胎肝干細胞抗原陽性細胞向腎臟細胞分化的研究[J].中華醫學雜志，2003，83（19）：1686-1690

[3]方利君，付小兵，孫同柱，李建福，程飚，楊銀輝，王玉新，王通.在體誘導骨髓間充質干細胞分化為表皮細胞的初步觀察[J].中華創傷雜志，2003，19（4）：212-214.

[4]唐濤，張繼虹，孫先潤，李治，王波，劉穎，李亞國，肖壯，李連娥.綠色熒光蛋白滑膜間充質干細胞抑制大鼠骨關節炎的實驗研究[J].中國醫科大學學報，2016，45（10）：913-917.