三補方對自然衰老小鼠認知功能及脂質過氧化損傷的影響

〔摘要〕 目的 觀察三補方對自然衰老小鼠認知功能的影響，探討潛在病理因素和三補方（Sanbu Decoction， SBD）的作用及其可能作用機制。方法 18只18月齡自然衰老健康SPF級野生型C57BL/6小鼠，雌雄各半，隨機分為衰老組（WT-Aged）、多奈哌齊組（WT-Donepezil）、三補方組（WT-SBD），另選6只3月齡小鼠為青年對照組（WT-Young）。WT-Young小鼠不灌胃，WT-Aged小鼠用蒸餾水灌胃，其余用相應藥物處理，灌胃45 d。灌胃結束前6日采用水迷宮實驗，記錄潛伏期時間、穿越平臺次數和平臺所在象限游泳路程。用HE染色觀察海馬神經元形態變化，免疫組織化學法測定小鼠腦海馬組織Tau、p-Tau、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）、神經上皮干細胞蛋白（neuroepithelial stem cell protein， Nestin）表達水平，檢測試劑盒檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase， GSH-Px）活性和丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量。結果 與WT-Young相比，第2日起WT-Aged逃逸潛伏期延長（Plt;0.05），穿越平臺次數和平臺所在象限經過的路程減少（Plt;0.05）；與WT-Aged相比，WT-Donepezil第3～5日和WT-SDB第4～5日逃逸潛伏期縮短（Plt;0.05），穿越平臺次數和在平臺所在象限經過的路程增多（Plt;0.05）。WT-Aged小鼠出現海馬神經元排列紊亂和大面積的神經元壞死，細胞質嗜酸性增強，細胞核固縮、溶解、消失。與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠神經元損傷減少，排列較為緊密，退化固縮的細胞數量則明顯減少，少部分細胞可見核固縮及細胞漿嗜酸性變。與WT-Young相比，WT-Aged Tau、p-Tau和GFAP表達增多（Plt;0.05），Nestin表達減少（Plt;0.05），SOD、GSH-Px活性降低（Plt;0.05），MDA含量升高（Plt;0.05）。與WT-Aged相比，WT-Donepezil和WT-SDB p-Tau、GFAP表達減少（Plt;0.05），WT-SBD SOD、GSH-Px活性升高（Plt;0.05），MDA含量降低（Plt;0.05）。結論 三補方可以降低自然衰老小鼠腦海馬組織p-Tau表達，減弱星形膠質細胞活化水平，降低脂質過氧化反應，發揮腦保護抗衰老作用，提高老年小鼠學習記憶能力，改善衰老小鼠的衰老狀態，延緩衰老進程。

〔關鍵詞〕 自然衰老；認知功能；脂質過氧化損傷；三補方；枸杞子；黃芪；茯苓

〔中圖分類號〕R285" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.03.003

Effects of Sanbu Decoction on cognitive function and lipid

peroxidation damage in naturally aging mice

WANG Xiaoju1，2， WANG Zhixian1，2， ZHANG Wenjiang3， YI Jian1，2， CHEN Bowei1，2， SHENG Wang1，2，

LI Yuxiang1，2， LIU Baiyan4*， WANG Xingkuan1，2

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang， Shaanxi 712046， China; 4. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Sanbu Decoction （SBD） on the cognitive function of naturally aging mice， and to explore the involved potential pathological factors， as well as the action of SBD and its possible mechanism. Methods Eighteen healthy SPF wild-type C57BL/6 naturally aging mice， half female and half male， aged 18 months， were randomized into aging group （WT-Aged）， donepezil group （WT-Donepezil）， SBD group （WT-SBD）， and another six mice aged three months were selected as the young control group （WT-Young）. WT-Young group was not treated. WT-Aged group were treated with distilled water， and the rest groups with corresponding drugs， by gavage for 45 days. During the six days before the end of gavage， Morris water maze test was performed， and the escape latency， platform crossing times， and the swimming distance in the platform quadrant were recorded. HE staining was carried out to observe the morphologic changes of hippocampal neurons of the mice. Immunohistochemistry was applied to measuring the expression levels of Tau， p-Tau， glial fibrillary acidic protein （GFAP）， and neuroepithelial stem cell protein （Nestin） in the hippocampal tissue of the mice. The detection kits were used to check the activity of superoxide dismutase （SOD） and glutathione peroxidase （GSH-Px） and the content of malondialdehyde （MDA）. Results Compared with WT-Young group， the escape latency of WT-Aged group was prolonged from the 2nd day （Plt;0.05）， and the platform crossing times and the swimming distance in the platform quadrant were reduced （Plt;0.05）; compared with WT-Aged group， the escape latency of WT-Donepezil group on the 3rd to 5th day and WT-SBD group on the 4th to 5th day was shortened （Plt;0.05）， and platform crossing times and the swimming distance in the platform quadrant were increased （Plt;0.05）. The hippocampal neurons in WT-Aged group showed disordered arrangement and large areas of necrosis， enhanced acidophilia in the cytoplasm， and pyknosis， dissolution， and disappearance of the nuclei. Compared with WT-Aged group， the hippocampal neurons in WT-Donepezil and WT-SBD groups showed reduced damage and compact arrangement， and the degenerated and pyknotic cells were significantly decreased， with a small minority showing karyopyknosis and cytoplasmic acidophilic change. Compared with WT-Young group， the expressions of Tau， p-Tau， and GFAP in WT-Aged group increased （Plt;0.05）， the expression of Nestin and the activity of SOD and GSH-Px decreased （Plt;0.05）， and the content of MDA was elevated （Plt;0.05）; compared with WT-Aged group， the expressions of p-Tau and GFAP decreased in WT-Donepezil and WT-SBD groups （Plt;0.05）， and the activity of SOD and GSH-Px in WT-SBD group increased （Plt;0.05） while the content of MDA was lowered （Plt;0.05）. Conclusion SBD can reduce the expression of p-Tau in the hippocampus of naturally aging mice， weaken the activation level of astrocytes， and reduce lipid peroxidation， which can improve the learning and memory abilities of senile mice， alleviate their aging state， and delay the aging process， thus playing the roles of brain protection and anti-aging.

〔Keywords〕 natural aging; cognitive function; lipid peroxidation damage; Sanbu Decoction; Gouqizi （Lycii Fructus）; Huangqi （Astragali Radix）; Fuling （Poria）

衰老是多因素影響下機體各組織器官形態和功能退變的復雜生物學過程，腦是受衰老影響最大的器官之一[1-2]。腦的衰老會破壞神經網絡原有平衡，引起注意力不集中、學習和記憶功能下降、決策力和理解力受損等一系列認知功能障礙。如任其不管，病情可能會進展為阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD），嚴重時可能會失去語言和認知能力，人格和行為發生改變[3-5]，對社會、家庭和個人都傷害極大，也會成為嚴重的醫療衛生和社會問題[6-7]。

氧化應激脂質過氧化反應是腦衰老認知障礙的重要病理改變。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）能夠阻斷脂質過氧化鏈反應，是機體細胞抵御ROS損害的第一道防線[8]。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）能夠催化過氧化氫分解，減少氧自由基產生，特異性地降低脂質過氧化，從而提高機體的抗氧化能力。SOD和GSH-Px既能夠通過協同加強，清除機體內的自由基，又能減輕機體自由基損傷，還可以協同降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，共同減輕脂質過氧化程度[9-10]。

由于腦衰老進展不可逆性及治療效果不佳，如果能夠早期防治，將延緩該病的發生發展。中醫藥在延緩衰老方面具有不可替代的優勢，此外，中醫藥還有毒副作用小、作用靶點多的優勢，因此，中醫藥延緩衰老的作用越來越受到重視。

早期臨床觀察發現，三補方（中藥組方枸杞子、黃芪、茯苓）有較好療效，能夠顯著改善腦衰老患者記憶能力，提高生活質量[11]。然而，三補方改善認知功能障礙的作用機制尚未可知。因此，本研究采用自然衰老小鼠模擬衰老認知功能障礙模型，探索三補方的認知改善作用，并研究其可能的作用機制，以期為三補方的進一步研發應用奠定基礎。

1 材料

1.1" 實驗動物

健康SPF級野生型C57BL/6小鼠24只，雌雄各半，從南京大學生物模式中心引入，動物許可證號為SCXK（蘇）2015-0001。課題組自行繁殖后自行鑒定飼養，青年小鼠3月齡，體質量為（24±3） g，老年小鼠18月齡，體質量為（35±5） g。飼養環境溫度（22±2） ℃，相對濕度50%，自由飲食進水，晝夜光照12 h節律交替。小鼠的飼養、手術及取材均嚴格遵守湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物科學與管理的相關規定。本實驗所有的實驗方案和操作流程遵守動物福利、動物倫理（倫理審查編號：ZYFY20190417-09）及動物保護等相關原則和規定。

1.2" 主要藥品、試劑及儀器

三補方（由枸杞子15 g、黃芪15 g、茯苓10 g組成，購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，藥材均符合《中華人民共和國藥典》標準（藥材鑒定人為湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心藥檢室張裕民主任藥師）；鹽酸多奈哌齊[衛材（中國）藥業有限公司，批準文號：國藥準字H20050978，批號：1705078]；Rabbit monoclonal（EPR2605） to Tau（phospho S404）（英國Abcam公司，貨號：ab92676）；monoclonal（E178） to Tau（英國Abcam公司，貨號：ab32057）；Anti-GFAP Antibody（美國Proteintech公司，貨號：16825-1-AP）；Anti-Nestin Antibody（美國Proteintech公司，貨號：19483-1-AP）。SOD測試盒/羥胺法（測總）（貨號：A001-1-1）、MDA測試盒（貨號：A003-1-2）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）（貨號：A005-1-1）均購自南京建成生物工程研究所。Morris水迷宮測試系統（中國成都泰盟軟件有限公司）。

2 方法

2.1" 動物分組、給藥和處理

普通飼料飼養動物至18月齡后開始灌胃。將小鼠分為衰老組（WT-Aged），多奈哌齊組（WT-Donepezil），三補方組（WT-SBD），另取3月齡小鼠為青年對照組（WT-Young），每組6只小鼠，分別做如下處理。WT-Young：普通飼料飼養至3月齡，不灌胃。WT-Aged：普通飼料飼養至18月齡，灌胃等體積蒸餾水。WT-Donepezil：普通飼料飼養至18月齡，灌胃鹽酸多奈哌齊水溶液。WT-SBD：普通飼料飼養至18月齡，灌胃三補方湯藥。按60 kg成人與動物體質量藥量折算表換算，即小鼠按10 mL/（kg·d）劑量進行灌胃，給藥劑量根據小鼠每日劑量（g）=成人每日劑量（g）×小鼠體質量與體表面積比值/人體質量與體表面積比值計算。WT-SBD給予5.19 g/（kg·d）制備好的湯藥灌胃給藥，WT-Donepezil按0.65 mg/（kg·d）劑量給予鹽酸多奈哌齊溶液灌胃。每日灌胃1次，連續灌胃45 d。本實驗死亡小鼠1只（為WT-Aged小鼠），解剖發現巨脾和腹水，可能是小鼠死亡的原因。死亡的小鼠從同品系同月齡小鼠中按隨機數字表法隨機抽取，進行補充，對整體實驗結果無影響。

灌胃結束前6日開始行水迷宮實驗，水迷宮測試結束后處死小鼠取材。采用摘眼球取血法取血后，快速用剪刀剪下小鼠頭部，置于冰凍臺上，低溫降低腦內蛋白酶活性。取右半腦的皮質與海馬部分裝入標記好的EP管內，立刻投入液氮速凍，最終轉移至-80 ℃保存，待ELISA檢測。左半腦組織進行固定后，浸入4%多聚甲醛過夜，再取出行脫水處理，用于HE染色和免疫組織化學法（Immunohistochemistry，IHC）檢測。

2.2" 檢測指標

2.2.1" 行為學檢測" 運用經典Morris水迷宮實驗[12]來檢測小鼠對空間方向和位置的學習記憶能力。

水迷宮實驗圓筒直徑為120 cm，高為50 cm，將圓筒等分為4個象限并設置4個入水點，在其中一個象限中固定一個直徑為10 cm的透明平臺，平臺頂端平面位于圓形水池液面以下1 cm。每日隨機選擇入水點順序，測試環境及平臺位置保持不變。圓筒內的水需要用二氧化鈦[食品添加劑二氧化鈦（漿料型）]染成乳白色，用棍棒攪混至水變成乳白色掩蓋平臺。水池水溫控制在（22±1） ℃，以減少來自水溫的干擾。實驗連續進行，5 d訓練，1 d測試，共6 d。

水迷宮實驗包括適應性訓練、定位航行、空間探索實驗。正式實驗開始前1日進行適應性訓練，將小鼠放置在平臺上適應15 s，然后把小鼠均依次放于水迷宮中自由游泳60 s，剔除游泳技能不好甚至不會游泳的小鼠。然后進行為期5 d的定位航行實驗，將小鼠快速放入水池。每只小鼠每日每個象限訓練1次，每日共4次，訓練歷時5 d。在60 s內找到平臺后停留10 s，若未找到平臺，則用網兜引導小鼠至平臺停留10 s。記錄小鼠第1次找到平臺的時間。

定位航行實驗結束后將平臺撤除，開始進行空間探索實驗。依次將小鼠分別從原平臺所在對側象限放入水中，記錄60 s內小鼠逃逸潛伏期、穿越平臺位置的次數、游行原平臺所在區域時間、小鼠的游泳速度、運動軌跡、各象限停留時間和路程等參數。實驗中選用60 s內穿越原平臺位置的次數、在原平臺象限內停留的路程和軌跡為評估指標。

2.2.2" HE染色" 每組選小鼠左側腦半球，用4%多聚甲醛在4 ℃固定24 h后進行石蠟包埋，分離海馬組織，制作石蠟切片（5 μm厚）。切片經二甲苯脫蠟和梯度乙醇水合后，對切片進行HE染色，再封片待顯微鏡觀察。

2.2.3" 小鼠腦組織IHC染色" 每組選小鼠左側腦半球，用4%多聚甲醛在4 ℃固定24 h后進行石蠟包埋，分離海馬組織，制作石蠟切片（5 μm厚）。先將切片脫蠟至水，再進行熱修復抗原；待熱修復抗原完成后，進一步滅活內源性酶。分別孵育一抗、二抗，再行DAB顯色；再用蘇木精復染并各級乙醇脫水，上述步驟完成后，取出后置于二甲苯中10 min，兩次，再用中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

2.2.4" ELISA試劑盒檢測SOD、GSH-Px、MDA" 取凍存小鼠腦組織勻漿、于2～8 ℃ 5 000×g離心5 min，取上清液進行實驗，或將上清分裝保存于-20 ℃或

-80 ℃，解凍后的樣本應再次離心，然后檢測，避免反復凍融。按照試劑盒說明書進行各試劑配制，腦組織樣本按照SOD、GSH-Px、MDA不同指標的說明書進行操作，操作完成后讀取并記錄數據。

2.3" 數據處理和統計學分析

所有數據均用SPSS 23.0統計軟件進行處理分析，計量資料用“x±s”表示，GraphPad Prism 6.0作圖軟件作圖。多組比較用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者用LSD法，方差不齊者用Games Howell法。以Plt;0.05為差異具有統計學意義。采像為普通的點采像，倍數為40×40倍和10×10倍，圖像分析軟件為IPP（Image-Pro-Plus）。

3 結果

3.1" 動物一般情況

青年小鼠灰黑色毛發順滑亮澤，腹肌緊收，攝食飲水正常、日常行為及反應較為敏捷，精神狀態良好。老年小鼠毛發比青年小鼠粗糙、發灰、枯燥，甚至有脫毛現象，部分倦怠慵懶、反應遲鈍，部分易激怒，精神狀態較青年小鼠差，藥物灌胃治療后均有所改善。

3.2" 水迷宮實驗

3.2.1" 定位航行實驗" 與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠花費更多的時間搜索平臺，各組小鼠主要圍繞水池邊緣探索式游泳，找到水中隱匿平臺后，小鼠慢慢學會有意識尋找平臺，出現直驅式搜索情況；與WT-Young相比，第2日起WT-Aged逃逸潛伏期延長（Plt;0.05）；第3～5日，與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil小鼠逃逸潛伏期縮短（Plt;0.05），第4～5日，WT-SDB小鼠逃逸潛伏期縮短（Plt;0.05）。詳見圖1。

3.2.2" 空間探索實驗" 與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠穿越平臺次數和在平臺所在象限經過的路程減少（Plt;0.05）；與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠穿越平臺次數和在平臺所在象限經過的路程增多（Plt;0.05）。詳見圖1。

3.3" 三補方對自然衰老小鼠海馬神經元結構的影響

WT-Young小鼠CA1區海馬神經元多達3～4層，排列緊密有序，細胞核和細胞漿清晰可見。與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠海馬神經元排列紊亂，海馬CA1區出現大面積的神經元壞死，細胞質嗜酸性增強，細胞核固縮、溶解、消失。與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠神經元損傷減少，排列較為緊密，退化固縮的細胞數量則明顯減少，少部分細胞可見核固縮及細胞漿嗜酸性變。詳見圖2。

3.4" 三補方對自然衰老小鼠腦內海馬神經元Tau蛋白和p-Tau蛋白的影響

與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠Tau蛋白表達增多（Plt;0.05）；與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠Tau蛋白表達減少，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠p-Tau蛋白表達增多（Plt;0.05）；與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠p-Tau蛋白表達減少（Plt;0.05）。詳見圖3。

3.5" 三補方對自然衰老小鼠腦內GFAP、Nestin的影響

與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠GFAP表達升高（Plt;0.05）；與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠GFAP表達降低（Plt;0.05）。與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠Nestin表達減少（Plt;0.05）；與WT-Aged小鼠相比，WT-Donepezil和WT-SDB小鼠Nestin蛋白表達增高，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。詳見圖4。

3.6" 三補方對自然衰老小鼠腦組織脂質過氧化損傷的影響

與WT-Young小鼠相比，WT-Aged小鼠SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高（Plt;0.05）。與WT-Aged小鼠相比，WT-SDB小鼠SOD、GSH-Px活性升高（Plt;0.05），MDA含量降低（Plt;0.05）。詳見圖5。

4 討論

中醫學無腦衰老病名，根據臨床特點，腦衰老可歸屬于“健忘”“呆病”“失神”等疾病范疇，屬于老年人高發疾病。本課題組基于前期研究[11]認為，腦衰老總屬腎精虧損、肺氣虛衰、脾運失健三者交雜以致損及髓海、傷及清竅、蒙于元神而發病，據此提出“滋腎精、補肺氣、健脾運”之法用于健腦抗衰，創治三補方有較好臨床療效。方中枸杞子能滋補肝腎、益智安神，《本草匯言·卷十》言枸杞子“有十全之妙用”而能達“壯精益神，神滿精足”之功，故為方中君藥。黃芪為“補氣諸藥之最”，為臣藥，《本草綱目·黃耆》云：“黃芪甘溫純陽，其用有五：補諸虛不足，一也；益元氣，二也；壯脾胃，三也；去肌熱，四也；排膿止痛，活血生血，內托陰疽，為瘡家圣藥，五也?！避蜍呖山∵\中焦，能助君藥入腎補益真元，又助飲食水谷精微滋先天以生腦髓，并可將髓海之痰濁引而下行，腦竅得以清明，故為佐藥。三藥合用，脾化健運，肺氣固密，腎精充盛，精血充旺，既可培補先天，又能滋養后天，使髓海充足，則腦實神全?，F代研究表明，氧化應激脂質過氧化反應是腦衰老的重要致病因素，機體隨著年齡增長，抗脂質過氧化能力下降，容易造成蛋白質、脂質、核酸積累以及細胞凋亡，從而加速腦組織衰老，導致學習和記憶能力減退[13-14]。黃芪[15-17]、枸杞子[18]、茯苓[19-20]具有抗衰老、抗氧化等生物活性作用，可以提高血清中SOD活性，降低MDA含量，增強小鼠的空間學習記憶能力。

p-Tau形成的細胞內神經纖維纏結（neurofibrillary tangle，NET）是衰老認知障礙的主要病理標志物之一。Tau蛋白的生物活性主要由其磷酸化程度來調控，過度磷酸化的Tau蛋白穩定性降低，與微管的結合能力下降，并從微管上解離下來，聚集成成對的螺旋纖維絲狀結構，沉積聚集在神經細胞的微絲中形成NET，加劇氧化應激反應，觸發神經元凋亡增加，導致AD等神經變性疾病的發生。星形膠質細胞在神經系統病理過程及神經元保護中都具有非常重要的作用。GFAP是星形膠質細胞的特異性表達標志物。隨著機體衰老及伴隨的中樞神經系統老化過程中，神經膠質細胞反應性增生，GFAP活性增強，對氧化應激損傷也非常敏感。Nestin的表達與神經干細胞的增殖和分化密切相關，常被用作神經干細胞的標記蛋白，是神經干細胞或祖細胞的標志物，其活化可能是對神經系統創傷或炎癥的一種反應，可能影響神經元和其他細胞類型。隨著機體衰老及伴隨的中樞神經系統老化，神經膠質細胞反應性增生，GFAP活性增強，對氧化應激損傷也非常敏感。神經干細胞可能在神經系統修復和再生中發揮作用，但其功能可能受到各種因素的調控，Nestin的表達與神經干細胞的增殖和分化密切相關，常被用作神經干細胞的標記蛋白，是神經干細胞或祖細胞的標志物[21]。

本研究結果說明自然衰老模型小鼠存在認知功能減退，由黃芪、枸杞子、茯苓組方而成的SBD可以顯著改善認知障礙小鼠受損的學習記憶能力。HE和IHC結果表明，SBD治療還可以減少腦組織p-Tau表達，降低GFAP的活性，減少衰老相關蛋白對腦組織的損害作用，從而發揮保護老年小鼠的學習記憶能力。SBD提高了SOD和GSH-Px活性，降低了MDA含量，體現了SBD在衰老小鼠腦內的抗氧化應激作用。

三補方對自然衰老小鼠認知功能及脂質過氧化損傷的影響機制流程詳見圖6。

5 結論

隨著人口老齡化程度的加劇，衰老及其帶來的機體改變引起廣泛關注。其中，腦衰老引起的認知功能障礙會為患者及其家庭帶來極大的負擔。因此，及早預防、及早治療、延緩病程進展具有重大意義。三補方為臨床驗方，能通過降低自然衰老小鼠腦海馬組織p-Tau表達，減弱星形膠質細胞活化水平，抑制與腦衰老認知障礙的重要病理環節——脂質過氧化反應，改善小鼠認知功能，延緩衰老進程，發揮腦保護作用，可為臨證診治腦衰老認知功能障礙提供一定的中醫藥治療思路。

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