不同危重程度社區獲得性肺炎患兒肺部微生物特征分析

[摘要]"目的"研究不同危重程度社區獲得性肺炎（community-acquired"pneumonia，CAP）患兒肺部微生物組學的特征，從而為肺炎患兒的精準診斷及抗生素治療提供依據，并且為肺部微生態在肺炎患兒的診斷與治療中的作用提供新策略和新視野。方法"收集2023年1月至12月在荊門市人民醫院兒科住院的64例不同危重程度CAP患兒的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar"lavage"fluid，BALF），將患兒分為重癥肺炎組（n=34）和普通肺炎組（n=30）。通過BALF的宏基因組測序獲得不同危重程度CAP患兒肺部的微生物組學信息，對得出的兩組樣本的菌群生物信息數據進行菌群結構多樣性分析、物種分類分析及差異性分析。結果"Alpha多樣性分析顯示，兩組患兒BALF的Chao1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數比較，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。Beta多樣性的主坐標分析（principal"coordinate"analysis，PCoA）顯示，兩組患兒BALF的微生態菌群組成相異性比較，差異有統計學意義（F=4.221，P=0.005）。經物種分類分析發現，在屬水平，重癥肺炎組患兒BALF樣本中以支原體屬為主，其次為鏈球菌屬，第三為嗜血桿菌屬，普通肺炎組患兒BALF樣本中以鏈球菌屬為主，其次為支原體屬，第三為嗜血桿菌屬。兩組患兒的微生物種群在屬水平層面排名前20位物種中豐度差異有統計學意義（Plt;0.05）的是支原體屬、鏈球菌屬、紅球菌屬、奈瑟菌屬、普雷沃菌屬、棒狀桿菌屬、假單胞菌屬。物種差異性分析顯示，在屬水平，有47個物種有差異（Plt;0.05）。結論"不同危重程度CAP患兒的肺部微生物菌群豐度、多樣性及微生物組結構與組成存在差異性，不同危重程度CAP患兒間優勢菌群有所不同，本研究豐富了CAP患兒的肺部微生物組學數據。

[關鍵詞]"支氣管肺泡灌洗液；宏基因組測序；社區獲得性肺炎；肺部微生態

[中圖分類號]"R725.6""""""[文獻標識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.36.005

Microbial"characteristics"analysis"of"the"lungs"in"children"with"community-acquired"pneumonia"of"different"severity"levels

WU"Yong，"PAN"Xiuxia，"QIN"Hua，"LIU"Yunjun，"ZHU"Yan，"WANG"Sijia，"LIANG"Yonghua，"ZENG"Rong，"WU"Qian

Department"of"Pediatrics，"Jingmen"People’s"Hospital，"Jingmen"448000，"Hubei，"China

[Abstract]"Objective"To"study"microbial"characteristics"of"pulmonary"in"children"with"community-acquired"pneumonia"（CAP）"of"different"severity，"in"order"to"provide"a"basis"for"accurate"diagnosis"and"antibiotic"treatment"of"pneumonia"children，"and"provide"new"strategies"and"perspectives"for"the"diagnosis"and"treatment"of"pulmonary"microbiota"in"pneumonia"children."Methods"Bronchoalveolar"lavage"fluid"（BALF）"from"64"children"with"CAP"of"different"severity"hospitalized"in"Department"of"Pediatrics，"Jingmen"People’s"Hospital"were"collected"from"January"to"December"2023，"the"children"were"divided"into"severe"pneumonia"group"（n=34）"and"common"pneumonia"group"（n=30）."Microbiome"information"of"the"lungs"of"children"with"CAP"of"different"severity"were"obtained"through"metagenomic"sequencing"of"BALF，"microbial"structure"diversity"analysis，"species"classification"analysis，"and"differential"analysis"on"the"microbial"bioinformatics"data"of"two"groups"of"samples"obtained"were"performed."Results"Alpha"diversity"analysis"showed"that"there"were"statistically"significant"differences"（Plt;0.05）"in"the"Chao1"index，"ACE"index，"Shannon"index，"and"Simpson"index"between"two"groups."The"principal"coordinate"analysis"（PCoA）"of"Beta"diversity"showed"a"statistically"significant"difference"in"the"composition"of"microbial"communities"between"two"groups"（F=4.221，"P=0.005）."Through"species"classification"analysis，"it"was"found"that"at"the"genus"level，"mycoplasma"was"the"main"genus"in"the"BALF"samples"of"severe"pneumonia"group，"followed"by"Streptococcus"and"Haemophilus，"Streptococcus"was"the"main"genus"in"the"BALF"samples"of"common"pneumonia"group，"followed"by"Mycoplasma"and"Haemophilus."Children"of"two"groups"showed"statistically"significant"differences"in"microbial"abundance"among"the"top"20"species"at"the"genus"level"（Plt;0.05），"including"Mycoplasma，"Streptococcus，"Rhodococcus，"Neisseria，"Prevotella，"Corynebacterium，"and"Pseudomonas."Species"diversity"analysis"showed"that"at"the"genus"level，"there"were"47"species"with"differences"（Plt;0.05）."Conclusion"There"are"differences"in"the"abundance，"diversity，"structure，"and"composition"of"pulmonary"microbiota"in"children"with"CAP"of"different"severity."The"dominant"microbiota"varies"among"children"with"CAP"of"different"severity."This"study"enriches"the"pulmonary"microbiome"data"of"children"with"CAP.

[Key"words]"Bronchoalveolar"lavage"fluid;"Metagenomic"sequencing;"Community"acquired"pneumonia;"Pulmonary"microbiome

世界衛生組織資料顯示，2016年肺炎造成92萬5歲以下兒童死亡，其中98%來自發展中國家；肺炎也是當前中國5歲以下兒童死亡的主要原因之一，其中絕大部分兒童肺炎為社區獲得性肺炎（community-"acquired"pneumonia，CAP）[1]。通過支氣管肺泡灌洗獲取的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar"lavage"fluid，BALF）有“液體肺活檢”之稱[2]。基于BALF的高通量測序研究可全面準確地反映肺部微生物群情況，對肺部感染的診斷具有重要意義[3-4]。隨著肺部微生物組學（又稱肺部微生態）測序技術的發展，曾被認為是無菌的肺部已被證實微生物共生體的存在，并可測得組成和相對豐度[5-6]。肺部微生物組的多樣性及穩定性對抵抗病原體定植，參與機體新陳代謝和免疫功能發育有巨大作用[7]。目前關于肺部微生態與呼吸系統疾病的主要研究方向為肺部微生物菌群與呼吸系統慢性疾病[8-12]；但對微生物群落組成的分析在急性肺部疾病中的探索較少。本研究基于Illumina高通量測序平臺，采用宏基因組測序的方法，研究不同危重程度CAP患兒肺部微生物組學的特征，從而為肺炎患兒的精準診斷及抗生素治療提供依據，并為肺部微生態在肺炎患兒診斷與治療中的作用提供新策略和新視野。

1""對象與方法

1.1""研究對象

選擇2023年1月至12月荊門市人民醫院兒科收治的64例不同危重程度CAP患兒，將患兒分為重癥肺炎組（n=34）和普通肺炎組（n=30）。兒童CAP的診斷標準參照《兒童社區獲得性肺炎診療規范（2019年版）》[1]。重癥肺炎組：評估符合《兒童社區獲得性肺炎診療規范（2019年版）》的診斷標準，在CAP基礎上出現以下任何一項：一般情況差、意識障礙、呼吸頻率明顯增快（嬰兒≥70次/min，gt;1歲患兒≥50次/min）、輔助呼吸（呻吟、鼻翕、三凹征）、間歇性呼吸暫停、氧飽和度lt;92%、超高熱（持續高熱gt;5d）、拒食或脫水癥、影像學檢查提示（≥2/3一側肺浸潤、多葉肺浸潤、胸腔積液、氣胸、肺不張、肺壞死、肺膿腫）、有肺外并發癥。普通肺炎組：除重度CAP外的兒童。納入標準："①符合上述兒童CAP的診斷標準；②年齡為生后29d至14歲；③符合支氣管鏡術的適應證且無禁忌證，家長同意行支氣管鏡術及宏基因組測序檢查，且經監護人同意納入研究并簽署知情同意書。排除標準：①有支氣管鏡術相對禁忌證：a.嚴重心肺功能減退者；b.嚴重心律失常，心房顫動、心室顫動及心房撲動、3度房室傳導阻滯者；c.高熱，持續高熱而又亟須行支氣管鏡術者，可將其體溫降至38.5℃以下再行手術，以防高熱驚厥；d.活動性大咯血者、嚴重的出血性疾病、凝血功能障礙、嚴重的肺動脈高壓及可能誘發大咯血者等；e.嚴重營養不良，不能耐受手術者。②不符合納入標準。本研究經荊門市人民醫院醫學倫理委員會審批通過（倫理審批號：2023092808）。

1.2""研究方法

1.2.1""收集患兒的BALF進行宏基因組測序""按《中國兒科可彎曲支氣管鏡術指南（2018年版）》[13]要求將支氣管鏡嵌頓于患兒靶支氣管后，經支氣管鏡工作孔道注入37℃生理鹽水[1ml/（kg·次），≤20ml/次，總量≤5～10ml/kg]，再經負壓100～200mmHg（1mmHg=0.133kPa）（選擇的負壓值以吸引時支氣管腔不塌陷為宜）的吸引器收集BALF，每次灌洗液的回收率≥40%。由專人進行支氣管肺泡灌洗術并正確收集BALF，收集標本后的宏基因組測序工作均委托廣州微遠基因科技有限公司進行。

1.2.2""數據分析""利用廣州微遠基因科技有限公司提供的數據對原始測序序列進行質控，篩除誤差數據，提高測序結果的準確性和可信度，然后對肺部微生物進行Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、物種組成分析、物種差異分析。使用Mothur軟件（version"v.1.30）對樣品Alpha多樣性指數進行評估，通過Alpha多樣性分析可反映樣本內微生物群落的豐度和多樣性，包括Chao1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數。Chao1指數、ACE指數可反映樣品微生物的豐富度，估計群落中實際存在的物種數；Shannon指數、Simpson指數可反映樣品微生物的多樣性。采用Qiime軟件（V1.9.1）進行Beta多樣性的主坐標分析（principal"coordinate"analysis，PCoA）（主坐標分析是一種非約束性的數據降維分析方法，可研究樣本群落組成的相似性或差異性，不同的點代表不同的樣本，樣本之間的距離表示樣本之間的相似性，距離越近，相似性越大），并通過R語言將結果可視化。為研究兩組樣品間微生物群落豐度的差異，利用R軟件對兩組間的物種豐度數據進行wilcoxon秩和檢驗。

1.3""統計學方法

采用SPSS"24.0軟件、Mothur軟件、Qiime軟件、R軟件進行統計學分析和繪圖。計數資料以率表示，計量資料以均數±標準差（）表示，比較采用秩和檢驗；樣本間物種豐度差異性分析采用R軟件中的秩和檢驗。n=2，采用R語言中的wilcox.test。Plt;0.05為差異有統計學意義。P值校正通過R（v3.1.1）包中的p.adjust進行。

2""結果

2.1""兩組患兒BALF的微生物群落Alpha多樣性分析

兩組患兒BALF的Chao1指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數比較，差異均有統計學意義（Plt;0.05），提示普通肺炎組微生物群落豐富度及物種多樣性較高，見表1。

2.2""兩組Beta多樣性分析

兩組間Beta多樣性的PCoA顯示，第一主坐標差異貢獻率為45.91%，第二主坐標差異貢獻率為16.12%，兩個主坐標共解釋62.03%的差異，在屬水平，兩組患兒BALF的微生態菌群組成比較，差異有統計學意義（F=4.221，P=0.005），見圖1。

2.3""物種組成分析

經物種分類分析發現，在屬水平，兩組樣本共檢測到520個物種，重癥肺炎組326個，普通肺炎組463個，重癥肺炎組BALF樣本中以支原體屬為主，其次為鏈球菌屬，第三為嗜血桿菌屬；普通肺炎組BALF樣本中以鏈球菌屬為主，其次為支原體屬，第三為嗜血桿菌屬，見圖2。

對兩組研究對象的微生物種群在屬水平層面排名前20位的物種豐度差異進行統計，重癥肺炎組高于普通肺炎組物種豐度的有支原體屬、棒狀桿菌屬（Plt;0.05），普通肺炎組高于重癥肺炎組物種豐度的有鏈球菌屬、紅球菌屬、奈瑟菌屬、普雷沃菌屬、假單胞菌屬（Plt;0.05），見表2。

2.4""物種差異性

物種差異性分析顯示，在屬水平，重癥肺炎組與普通肺炎組共有47個物種有差異（Plt;0.05），包括支原體屬、鏈球菌屬、紅球菌屬、奈瑟菌屬、普雷沃菌屬、棒狀桿菌屬、假單胞菌屬等，見表3。

3""討論

宏基因組測序是基于宏基因組學和高通量測序技術，通過直接對臨床樣本中的核酸進行檢測，然后與數據庫比對分析得到的序列信息，可檢測并分析各種臨床來源樣本中所有已知及未知的病原體[14-15]。本研究基于Illumina高通量測序平臺，采用宏基因組測序的方法，對不同危重程度CAP患兒BALF的微生物組學信息進行分析，可非常全面準確地反映其肺部微生物組學特征。肺部微生物組的改變與機體之間是雙向關系，如打破其動態平衡，可致使氣道失調和免疫紊亂，從而產生嚴重的肺部損傷[16-17]。研究認為呼吸道合胞病毒感染后引起的呼吸道微生物菌落組成和多樣性的改變，與呼吸道感染的嚴重程度密切相關[18]。龍鑫等[19]研究發現呼吸道合胞病毒感染可引起呼吸道微生態的菌落組成改變，加重≥6月齡的呼吸道合胞病毒感染患兒的病情。本研究同樣發現不同危重程度CAP患兒肺部微生物菌群的改變。Alpha多樣性分析發現重癥肺炎組和普通肺炎組肺部微生物群落的Chao1指數、ACE指數、Shannon、Simpson指數比較差異有統計學意義。Chao1指數、ACE指數用于衡量微生物群落豐度，指數越大說明群落豐富度越高，Shannon指數、Simpson指數評價物種多樣性，Shannon指數越大，Simpson指數越小，物種多樣性越高。普通肺炎組Chao1指數、ACE指數明顯高于重癥肺炎組，表明普通肺炎組微生物群落豐富度明顯高于重癥肺炎組。普通肺炎組Shannon指數明顯高于重癥肺炎組，而Simpson指數明顯低于重癥肺炎組，表明普通肺炎組的肺部微生物菌群多樣性明顯高于重癥肺炎組。Beta多樣性分析發現兩組患兒微生態菌群組成差異有統計學意義。重癥肺炎組患兒的微生物群落豐富度和多樣性較普通肺炎組低，說明不同危重程度CAP患兒肺部微生物豐富度和多樣性與重癥肺炎發生具有相關性。目前有較多研究表明肺部微生物菌群與呼吸系統慢性疾病密切相關，Lee等[11]根據病情嚴重程度將63例支氣管擴張患者分為兩組，利用16SrDNA測序技術對其痰微生物組進行研究發現，在屬水平上，輕度支氣管擴張組的嗜血桿菌和羅氏菌屬明顯多于中/重度患者組，中/重度患者組的假單胞菌屬明顯多于輕度組，且差異均有統計學意義。Invernizzi等[12]進行一項前瞻性研究，對受試者的BALF進行16S"rDNA測序，發現特發性肺纖維化患者肺部微生物菌群以厚壁菌門占主導地位，相較于健康對照組，特發性肺纖維化組的厚壁菌門及放線菌門豐度增加，且差異有統計學意義。Yagi等[20]比較慢阻肺患者與健康受試者BALF的微生物組，研究發現慢阻肺患者的莫拉氏菌、鏈球菌、變形菌、真菌和普雷沃菌相對豐度增加。本研究在屬水平對兩組CAP患兒BALF樣本進行物種分類分析發現，重癥肺炎組BALF樣本中以支原體屬為主，其次為鏈球菌屬，第三為嗜血桿菌屬，普通肺炎組則以鏈球菌屬為主，其次為支原體屬，第三為嗜血桿菌屬，對兩組患兒的BALF微生物種群在屬水平層面排名前20位的物種豐度差異進行統計，發現重癥肺炎組的支原體屬、棒狀桿菌屬豐度明顯高于普通肺炎組，而重癥肺炎組的鏈球菌屬、紅球菌屬、奈瑟菌屬、普雷沃菌屬、假單胞菌屬豐度明顯低于普通肺炎組，表明重癥肺炎組與普通肺炎組的肺部微生物組結構與組成不同，可為臨床醫生在不同危重程度CAP的抗生素經驗性使用選擇上提供一定參考。在屬水平，對兩組患兒的BALF進行物種差異性分析顯示，包括支原體屬、鏈球菌屬、紅球菌屬、奈瑟菌屬、普雷沃菌屬、棒狀桿菌屬、假單胞菌屬等在內的47個物種存在差異。通過對64例不同危重程度CAP患兒的BALF的宏基因組測序，對比分析其肺部微生態差異，使兒科醫生認識其微生態的變化，識別病原體的差異，從而精準地診斷，幫助臨床醫生精確指導抗生素的治療，進而減少肺炎并發癥，縮短病程，改善預后。關于肺部微生物組是否可靶向治療及如何靶向治療，從而改善重癥肺炎的結局，還需要進一步研究。富含纖維的飲食可同時改變肺部和腸道的微生物組[21]；營養支持和益生菌的使用可能是維持或恢復功能性肺部微生物組的有效策略。

本研究未動態監測CAP患兒治療前后的呼吸道菌群改變，也未對比健康兒童的肺部菌群特點，而這可能有助于了解肺炎治療效果相關的呼吸道菌群改變，未來可納入更多患者，以更加全面系統地描述肺炎患兒肺部的微生物菌落，進一步探索肺部微生態在肺炎發生、發展中的作用。總之，不同危重程度CAP患兒肺部微生物菌群豐度、多樣性及微生物組結構與組成存在差異性，不同危重程度CAP間優勢菌群有所不同，本研究豐富了CAP患兒肺部微生物組學數據。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–09–23）

（修回日期：2024–12–24）