NUAK2對肝癌細胞侵襲和遷移能力的影響

摘要：目的" 研究肝癌細胞NUAK家族激酶2（NUAK2）對肝癌細胞侵襲和遷移能力的影響。方法" 選取2022年1月-2023年6月在我院手術治療的40例患者肝癌組織標本為觀察組，并選取同期手術治療存檔的40例患者正常肝組織標本為對照組，采用聚合酶鏈式反應檢測（PCR）技術和Western Blot法檢測兩組NUAK2及NUAK2 mRNA的表達水平，Transwell法檢測NUAK2對肝癌癌細胞株侵襲能力的影響，細胞劃痕實驗檢測NUAK2對肝癌癌細胞株遷移能力的影響。結果" 觀察組NUAK2水平、NUAK2 mRNA表達均高于對照組（Plt;0.05）;觀察組肝癌細胞侵襲細胞個數、侵襲抑制率均低于對照組（Plt;0.05）;觀察組肝癌細胞遷移細胞個數、遷移抑制率均低于對照組（Plt;0.05）。結論" NUAK2在肝癌細胞組織呈現高表達水平，且會降低肝癌細胞侵襲、遷移率，進一步表明高水平NUAK2與肝癌的侵襲和遷移能力密切相關，可能與其他蛋白相互作用后調控肝癌的發生與發展。

關鍵詞：NUAK2;肝癌細胞;侵襲;遷移能力

中圖分類號：R735.7" " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.24.004

文章編號：1006-1959（2024）24-0012-04

Effect of NUAK2 on the Invasion and Migration of Hepatocellular Carcinoma Cells

LAI Dongxiang1，XIAO Xuewen2，GUO Zhenqiang3，LUO Yi4

（1.Pathology Department of Chongyi County People's Hospital，Chongyi 341399，Jiangxi，China;

2.Pathology Department of the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341001，Jiangxi，China;

3.Pathology Department of Ganzhou Municipal Hospital，Ganzhou 341099，Jiangxi，China;

4.Surgey Department of Chongyi County People's Hospital，Chongyi 341399，Jiangxi，China）

Abstract：Objective" To study the effect of NUAK family kinase 2 （NUAK2） on the invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells.Methods" From January 2022 to June 2023， 40 cases of liver cancer tissue specimens from patients undergoing surgical treatment in our hospital were selected as the observation group， and 40 cases of normal liver tissue specimens from patients undergoing surgical treatment at the same time were selected as the control group. Polymerase chain reaction （PCR） and Western Blot were used to detect the expression levels of NUAK2 and NUAK2 mRNA in the two groups. Transwell method was used to detect the effect of NUAK2 on the invasion ability of liver cancer cell lines， and cell scratch test was used to detect the effect of NUAK2 on the migration ability of liver cancer cell lines.Results" The level of NUAK2 and the expression of NUAK2 mRNA in the observation group were higher than those in the control group （Plt;0.05）. The number of invasive cells and invasion inhibition rate of liver cancer cells in the observation group were lower than those in the control group （Plt;0.05）. The number of migrated cells and migration inhibition rate of liver cancer cells in the observation group were lower than those in the control group （Plt;0.05）.Conclusion" NUAK2 is highly expressed in hepatocellular carcinoma tissues， and it can reduce the invasion and migration rate of hepatocellular carcinoma cells， which further indicates that high level of NUAK2 is closely related to the invasion and migration ability of hepatocellular carcinoma， and may regulate the occurrence and development of hepatocellular carcinoma after interacting with other proteins.

Key words：NUAK2;Hepatocellular carcinoma cell;Invasion;Migratory ability

肝癌（hepatocellular carcinoma）是臨床常見的惡性腫瘤，其發生率在全球僅次于肺癌及胃癌，對患者的生命安全造成嚴重威脅[1]。肝癌發病初期無顯著特異性癥狀，多數患者發病就診時已經處于晚期，失去手術治療的最佳時機[2]。相關研究顯示[3]，部分患者利用肝移植等治療方式展開根治性治療，但是整體臨床療效無法達到預期，術后具有較高復發率。侵襲、遷移是肝癌的基本特征，其侵襲與遷移取決于細胞黏附以及細胞外蛋白水解變性[4]。肝癌細胞可以在趨化因子刺激下發生運動，但其黏附性下降，容易從原發灶脫離并降解細胞外基質，形成向外轉移的通道，促進腫瘤細胞的侵襲、遷移[5]。NUAK2是人腺苷單磷酸（AMP-activated protein， AMP）激酶家族的第4個成員，編碼相關激酶[6]。目前，臨床研究已經證實NUAK2參與多種癌癥的發生與發展。但是與肝癌相關研究較少，尤其是對肝癌細胞侵襲和遷移能力影響方面的研究存在差異[7]。本研究選擇2022年1月-2023年6月在我院手術治療的40例肝癌患者組織標本，進一步探究NUAK2對肝癌細胞侵襲和遷移能力的影響，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料" 選取2022年1月-2023年6月在崇義縣人民醫院手術治療的40例肝癌患者組織標本為觀察組，并選取同期手術治療存檔的40例患者正常肝組織標本為對照組。觀察組男27例，女13例;年齡32～78歲，平均年齡（55.21±2.19）歲。對照組男25例，女15例，年齡33～77歲，平均年齡（55.22±2.18）歲。兩組年齡、性別比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），有可比性。所有納入患者均自愿參加本研究，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1儀器和試劑" 試劑盒（上海優聯生物科技有限公司）、光學顯微鏡（廣州景通儀器有限公司）、離心機（浙江三聯環保科技股份有限公司）、洗板機（廣西路博環保科技有限公司）、熒光定量PCR儀（廣州金程科學儀器有限公司）及酶標儀（深圳雷社有限公司）等。

1.2.2細胞培養" 在體外環境中，對人肝癌SMMC-7721細胞株進行連續傳代培養[8]。采用含10.00%胎牛血清的RPMI 1640培養液，并在恒溫37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養48 h，每24 h更換一次培養液。當肝癌細胞完全覆蓋培養瓶底部后，移除培養液，采用0.25%胰蛋白酶對SMMC-7721肝癌細胞進行消化處理。之后使用含10.00%胎牛血清的RPMI 1640培養液將細胞濃度調整至1×106/ml，以確保實驗的一致性和準確性。在實驗過程中，選擇處于對數生長期的細胞，以確保細胞的生長活性和實驗的可靠性。

1.2.3細胞損傷刮擦實驗" 在12孔培養板中，接種對數生長期的SMMC-7721人肝癌細胞，細胞形成單層后，采用移液器滴頭沿著培養板底部進行“一”字形劃痕單層培養細胞的操作，并在顯微鏡下對劃痕區的相對距離進行詳細記錄[9]。隨后，將培養液更換為體積分數為1%的胎牛血清RPMI1640培養液并持續培養24 h。然后再次更換為體積分數為10%的胎牛血清RPMI1640培養液并繼續培養48 h。在此過程中，觀察并拍攝照片，為了確保實驗結果的準確性和可靠性，設置4個平行樣本，并重復3次實驗。

1.2.4細胞侵襲實驗" 將0.2 ml NIH3T3細胞培養上清液加入Boyden小室的下室中[10]。選用孔徑為8 μm的聚碳酸酯微孔濾膜將上下室分隔開，并在濾膜上預先鋪設40 μl含有120 μg Madrigel的溶液。在37 ℃下聚合0.5 h，以重建基底膜。隨后，將細胞懸液加入Boyden小室的上室中，并在37 ℃、5%CO2的培養箱內孵育6 h。孵育結束后，取出濾膜，輕輕擦去膜上的Matrigel及未穿透的細胞，然后用甲醇固定1 min。接下來，進行HE染色處理。在200倍光學顯微鏡下，隨機選擇5個視野，計算穿過聚碳酸酯膜的細胞數量，并求其平均值。

1.3觀察指標" 比較兩組肝癌細胞NUAK2蛋白和NUAK2的mRNA的表達、肝癌癌細胞株侵襲、遷移能力。侵襲抑制率（遷移抑制率）=（陰性對照組各視野中穿膜細胞數-轉染組各視野中穿膜細胞數）/陰性對照組各視野中穿膜細胞數×100.00%[11]。

1.4統計學方法" 采用SPSS 27.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以[n（%）]表示，行χ2檢驗;計量資料以（x±s）表示，行t檢驗;Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組肝細胞中NUAK2水平、NUAK2的mRNA比較" 觀察組肝癌細胞中NUAK2水平、NUAK2的mRNA均高于對照組（Plt;0.05），見表1。

2.2兩組肝細胞侵襲個數、侵襲抑制率比較" 觀察組肝癌細胞侵襲細胞個數、侵襲抑制率均低于對照組（Plt;0.05），見表2、圖1。

2.3兩組肝細胞遷移細胞個數、遷移抑制率比較" 觀察組肝癌細胞遷移細胞個數、遷移抑制率均低于對照組（Plt;0.05），見表3、圖2。

3討論

隨著現代醫學的發展，肝癌的治療趨于靶向治療，并且已經成為當前臨床治療肝癌研究的熱點話題，并且特異性靶向藥物在提高臨床療效方面已經取得巨大進展[12，13]。治療靶點一般為信號通路上信號轉導或轉錄活化的關鍵分子，因此研究肝癌發生發展的分子機制可以為肝癌的治療提供新的靶點[14，15]。NUAK2主要定位在細胞核，可通過調節細胞周期通路，將細胞能力狀態與細胞生長、增殖聯系起來，并且參與調節細胞代謝、運動功能機制[16]。肝癌的發生是癌細胞無限制增殖，并伴新生血管，隨著病情的進展，癌細胞會突破基底膜、血管內層，例如血液、淋巴管等系統，從而遷移至其他部位，最后黏附于靶器官，形成轉移灶[17]。因此，研究NUAK2的表達，并探究NUAK2與肝癌轉移、遷移的關系，對緩解病情，控制肝癌細胞侵襲和轉移至關重要[18]。

本研究結果顯示，觀察組肝癌細胞中NUAK2水平、NUAK2的mRNA均高于對照組（Plt;0.05），表明肝癌患者NUAK2呈高水平表達，且可能參與肝癌的發生、發展過程。分析認為，可能是因為NUAK2作為AMPK相關激酶，可對細胞代謝、運動等過程進行調節，且隨著NUAK2水平的不斷升高，通過激活下游相關信號通路，促進肝癌細胞的增殖等過程，從而增強肝癌細胞的惡性生物學特性，如侵襲、遷移能力，進而可能增加肝癌轉移、進展的發生。因此，NUAK2對肝癌的預測也具有一定的價值[19]。同時本研究顯示，觀察組肝癌細胞侵襲細胞個數、侵襲抑制率均低于對照組（Plt;0.05），提示NUAK2高水平會抑制肝癌細胞侵襲率，對于減緩肝癌惡性進程具有積極的影響。究其原因，與對照組比較，觀察組肝癌患者NUAK2高水平表達，可能會通過調控細胞骨架進行重組，影響細胞黏附、遷移相關的蛋白表達，抑制上皮間充質轉化過程進展，增強上皮細胞活性，有效減弱轉移和侵襲能力，從而預防肝癌細胞的侵襲[20]。故，肝癌細胞中NUAK2表達可降低肝癌細胞侵襲能力。此外，觀察組肝癌細胞遷移細胞個數、遷移抑制率均低于對照組（Plt;0.05），表明上調NUAK2表達會降低肝癌細胞遷移運動功能。因為，NUAK2快速表達可以削弱NUAK2對肝癌細胞的調控，誘導肝癌細胞衰老，從而降低遷移細胞個數，最終抑制遷移。可見，NUAK2 可能是肝癌細胞發生、發展的一個靶基因，且在其中起到正反饋的作用，降低肝癌細胞惡性進程。

綜上所述，NUAK2高度表達水平與肝癌細胞的侵襲與遷移能力緊密相關，NUAK2水平高，其侵襲及遷移抑制率均降低。基于此，臨床可通過靶向抑制NUAK2的表達，削弱肝癌細胞的惡性生物學特征，從而為肝癌的治療開辟出全新的思路與途徑。

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收稿日期：2024-10-31;修回日期：2024-11-05

編輯/成森

基金項目：贛州市指導性科技計劃項目（編號：GZ2023ZSF402）

作者簡介：賴冬香（1989.11-），女，江西崇義縣人，本科，主治醫師，主要從事病理診斷工作