結核分枝桿菌MmpL5蛋白與貝達喹啉及氯法齊明相互作用的關鍵結合區域研究

摘要：目的 表達純化結核分枝桿菌MmpL5蛋白，從而進一步檢測MmpL5蛋白與藥物之間的相互作用，探究MmpL5外排系統所導致的耐藥機制。方法 通過分子對接技術預測MmpL5蛋白與藥物結合位點。基于分子對接結果，以結核分枝桿菌H37Rv基因組為模板，構建MmpL5-L1截短蛋白的表達質粒，并在大腸埃希菌中進行表達純化。利用熒光淬滅技術和表面等離子體共振技術檢測截短蛋白與藥物之間的相互作用。結果 成功在大腸埃希菌中表達純化結核分枝桿菌膜截短蛋白MmpL5-L1 （Q52-R202），MmpL5-L1截短蛋白與氯法齊明相互作用使蛋白產生熒光淬滅，表面等離子體共振實驗表明MmpL5-L1截短蛋白與貝達喹啉的親和常數（KD）為4.033×10-5 mol/L，與氯法齊明的親和常數（KD）為1.218×10-5 mol/L。結論 本文預測并確證了結核分枝桿菌MmpL5蛋白與貝達喹啉、氯法齊明結合的關鍵結合氨基酸區域，為貝達喹啉、氯法齊明與MmpL5蛋白結合進而通過MmpS5-MmpL5外排提供了直接證據，對進一步闡明貝達喹啉耐藥以及氯法齊明交叉耐藥機制奠定了一定基礎。

關鍵詞：結核分枝桿菌；MmpL5；貝達喹啉；結合；分子對接

中圖分類號：R978.3 文獻標志碼：A

Identifying key binding domain for the interaction of the Mycobacterium tuberculosis MmpL5 protein and bedaquiline/clofazimine

Abstract Objective To express and purify the MmpL5 protein of Mycobacterium tuberculosis so as to further investigate the interaction between MmpL5 protein and drugs and study the drug resistance mechanism caused by the MmpL5 efflux system. Methods The binding sites of the MmpL5 protein and drugs were predicted by molecular docking. Based on the results of molecular docking， the expression plasmid of the MmpL5-L1 truncated protein was constructed using the Mycobacterium tuberculosis H37Rv genome as a template. The MmpL5-L1 truncated protein was expressed and purified in Escherichia coli. The fluorescence quenching technique and the surface plasmon resonance technique were used to investigate the interaction between truncated proteins and drugs. Results MmpL5-L1 （Q52-R202）， a truncated protein of Mycobacterium tuberculosis， was successfully expressed and purified in Escherichia coli. The interaction between the truncated protein of MmpL5-L1 and clofazimine was validated by protein fluorescence quenching. The surface plasmon resonance experiment showed that the affinity constant （KD） of the truncated protein of MmpL5-L1 with bedaquiline was 4.033×10-5 and that with clofazimine was 1.218×10-5. Conclusion The key amino acid region of MmpL5 binding to bedaquiline and clofazimine， which provided direct evidence for the binding of bedaquiline and clofazimine to MmpL5 protein and then efflux through the MmpS5-MmpL5 system， was successfully predicted and confirmed. This work laid a certain foundation for further elucidating the mechanisms of bedaquiline resistance and clofazimine cross-resistance.

Key words Mycobacterium tuberculosis; MmpL5; Bedaquiline; Binding; Molecular docking

結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）引起的全球廣泛關注的呼吸道傳染性疾病，而出現的耐藥性問題為治療結核病帶來更大挑戰[1]。二芳基喹啉類藥物貝達喹啉（bedaquiline， Bdq）是近50年美國食品藥品監督管理局批準用于治療耐藥結核病的首個藥物，能有效提高耐藥結核病的臨床療效及縮短治療時間[2]。氯法齊明（clofazimine， Cfz）最初于1969年被用于治療麻風病，隨后臨床試驗證明Cfz可以縮短MTB的治療時間，改善MTB的治療結局[3]。但Bdq和Cfz交叉耐藥菌株很快出現，因此需要深入探究其的耐藥機制，與其他藥物合理組合用藥，從而在臨床用藥時減少耐藥性的發生[4]。

Bdq耐藥機制主要與靶點atpE、Rv0678和pepQ基因突變有關[5]。臨床上首先發現與Bdq耐藥相關，并且報道最多的是Rv0678基因突變[6]。Bdq和Cfz交叉耐藥現象主要和Rv0678基因[7]的突變有關。前期研究中，通過分析Bdq和Cfz的原發耐藥株的全基因組，發現MTB的Rv0678基因突變是導致Bdq和Cfz交叉耐藥的原因[8]。MmpL5（Rv0676c）與MmpS5（Rv0677c）共同組成抗結瘤細胞分裂（resistance-nodulation-cell division，RND）家族的膜轉運外排泵[9]。mmpL5和mmpS5基因位于同一操縱子中，由位于mmpS5-mmpL5操縱子的下游的轉錄調節因子Rv0678調控。Rv0678基因翻譯形成的Rv0678蛋白可與位于Rv0678和mmpS5之間的基因間區的啟動子結合，這會阻止RNA聚合酶啟動轉錄，抑制MmpS5和MmpL5基因的表達，從而抑制MmpS5-MmpL5系統的外排作用[10]。Rv0678基因突變致使其對MmpS5-MmpL5系統抑制作用減弱，MmpS5-MmpL5系統外排作用增強。

目前Bdq和Cfz與MmpL5蛋白的作用機制尚不清楚，僅知MmpL5蛋白為12重跨膜蛋白，但也尚無蛋白結構解析。前期研究預測了MmpL5蛋白的三維結構，然后通過分子對接技術將Bdq和Cfz分別對接到MmpL5蛋白結構中，預測MmpL5蛋白與這些藥物分子潛在的關鍵結合位點。針對MmpL5全長膜蛋白表達純化困難的問題，選取含有藥物潛在結合位點的MmpL5蛋白部分基因序列，嘗試構建MmpL5-L1截短蛋白表達載體。將MmpL5-L1截短蛋白表達純化，利用熒光淬滅技術和表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）技術檢測該截短蛋白與Bdq、Cfz之間的相互作用，為MmpS5-MmpL5外排系統導致抗結核方面的耐藥轉運機制提供了進一步的闡釋。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

MTB標準株H37Rv（ATCC 27294）由首都醫科大學附屬北京胸科醫院/北京市耐藥結核病重點實驗室保存并提供。

1.1.2 實驗藥物

Bdq（上海瀚香生物科技公司；批號：20200518；純度≥98%）；Cfz（上海瀚香生物科技有限公司；批號：20190416；純度≥98%）。

1.1.3 儀器與試劑

Infinite 200多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）、GENEPRO多功能基因擴增儀（杭州博日科技股份有限公司）、Amersham Imager 600蛋白成像儀（美國GE公司）、Max-Q8000低溫搖床（美國Thermo Fisher Scientific公司）、DS-11FX超微量分光光度計（美國DeNovix公司）、Tanon-4200全自動數碼凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）、Nuaire701二氧化碳恒溫培養箱（美國Nuaire公司）、AKTA pure蛋白純化儀（美國Gene公司）。

pET-32a質粒為本實驗室保存；EcoRⅠ （R0101V）、Hind Ⅲ（R0104V）均購自美國紐英倫生物技術公司；E.coli DH5α（9057）購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；特超敏ECL化學發光試劑盒（P0018AS）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0010）均購自上海碧云天生物技術有限公司；超濾離心管Millipore（YZ-UFC901096）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 通過分子對接技術預測MmpL5蛋白潛在的結合位點

采用基于同源建模的Phyre2工具，以大腸埃希菌的同源蛋白AcrB和MTB中的同家族跨膜蛋白MmpL3作為模板，預測MmpL5蛋白的三維結構。利用已知的MmpL3–SQ109（PDB ID： 6AJG）、MmpL3–LMT（PDB ID： 6AJG）以及AcrB–DM2（PDB ID： 2DR6）的復合物結構作為參考，使用AutoDock Vina分子對接軟件，將Bdq、Cfz分別對接到MmpL5的預測結構中。通過分析這些對接產生的復合物的結合自由能，獲得MmpL5與Bdq、Cfz的穩定復合物結構。Pymol軟件分析MmpL5蛋白與藥物分子之間的相互結合位點。

1.2.2 目的基因與pET-32a質粒的連接及轉化

根據NCBI中MTB標準株H37Rv的mmpL5基因序列和分子對接結果設計引物，引物序列如下：mmpL5-L1-F： 5'GGAATTCATGCA ACTGGAAACGGTCGGAC 3'（EcoRⅠ）；mmpL5-L1-R：5'CCCAAGCTTTCAACGGTCGCCGGCC 3'（Hind Ⅲ）。PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳，DNA純化試劑盒回收PCR產物。目的基因與pET-32a質粒利用EcoRⅠ及Hind Ⅲ酶切處理、連接。轉化連接產物至E.coli DH5α大腸埃希菌感受態細胞，挑取陽性克隆并測序驗證。測序正確的克隆標記為pET-32a-mmpL5-L1截短蛋白。

1.2.3 MmpL5-L1截短蛋白的表達與純化

37 ℃條件下培養菌液10 h，待菌液培養至波長600 nm處吸光度值（A600值）為0.8，加入IPTG溶液

（50 mg/mL）使菌液中IPTG終濃度為0.5 mmol/mL，誘導蛋白表達，16 ℃條件下繼續培養18 h。收集誘導表達后的菌液，離心后棄上清，菌沉淀用預冷的磷酸鹽緩沖液重懸，用高壓破碎儀破碎菌體，16 000 r/min

離心30 min，吸取上清。上清液過0.45 μm濾膜后，用含20 mmol/mL咪唑的上樣緩沖液將蛋白裂解液上樣至AKTA pure蛋白純化儀，用含500 mmol/mL咪唑的洗脫緩沖液進行梯度洗脫，收集純化蛋白。

1.2.4 蛋白免疫印跡分析

將蛋白裂解液和洗脫液進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至聚偏氟乙烯膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h，加入1：2000的抗組氨酸鼠源IgG單克隆抗體一抗，TBST緩沖液洗去一抗3次，加入1：5000的羊抗鼠IgG二抗孵育，TBST緩沖液洗去二抗3次，加入辣根過氧化物酶顯色劑孵育后，進行化學顯色檢測。

1.2.5 蛋白脫鹽濃縮

用超純水浸潤超濾離心管Millipore的濾膜，棄去超純水。將純化蛋白樣品加入超濾離心管，4000 g，

4 ℃，離心15 min，棄廢液。加入10 mL置換液，4000 g，

4 ℃，離心15 min，棄廢液，重復兩次。吸取回收過濾裝置底部樣品，蛋白脫鹽濃縮至置換液中。

1.2.6 蛋白濃度測定

取適量25 mg/mL蛋白標準，稀釋至終濃度為0.5 mg/mL。按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50：1）配制適量BCA工作液。將標準品按0、1、2、4、8、12、16和20 μL加到96孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20 μL，相當于標準品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL。

加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中。如果樣品不足20 μL，需加標準品稀釋液補足到20 μL。各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置20～30 min。用Infinite 200多功能酶標儀測定A562波長的吸光度，建立標準曲線計算蛋白樣品濃度。

1.2.7 蛋白熒光淬滅

用超濾離心管Millipore將純化蛋白進行脫鹽濃縮至100 mmol/L磷酸鉀溶液中，進行蛋白濃度測定。用100 mmol/L磷酸鉀溶液將蛋白純化母液稀釋至原濃度的0、25%、50%、75%和100%，在330～500 nm

波長下測定其熒光強度。選取適宜蛋白濃度作為固定濃度，在96 μL蛋白溶液中加入4 μL不同濃度的Cfz，使其藥物終濃度為0.4、0.2、0.1、0.05和

0.025 mg/mL，測定其熒光強度，與未加藥物的蛋白熒光強度進行比較。

1.2.8 BIAcore 分析MmpL5-L1截短蛋白與Bdq、Cfz的相互作用

（1）芯片準備" " 通過在注射前立即混合400 mmol/L

EDC和100 mmol/L NHS（GE）來制備活化劑?；旌衔镆?0 μL/min的流速注入Fc3和Fc4樣品通道800 s。然后以10 μL/min的流速將64 μg/mL的在10 mmol/L NaAc （pH 4.0）中的MmpL5-L1注射到Fc4樣品通道中1600 s，固定化水平約為8400 RU。芯片被1 mol/L 乙醇胺鹽酸鹽（GE）以10 μL/min的流速滅活800 s，進入Fc3和Fc4樣品通道。

（2）通過動力學/親和力運行分析物Bdq" " 用運行緩沖液（1×PBS-P 5%DMSO緩沖液，GE）將Bdq稀釋至8個濃度（90、45、22.5、11.25、5.63、2.81、1.41、0.70和0 μmol/L）。將Bdq以30 μL/min的流速注入通道的Fc3-Fc4，結合期為60 s，然后解離90 s。結合和解離過程都在運行緩沖液中處理。

（3）通過動力學/親和力運行分析物Cfz" " 用運行緩沖液（1×PBS-P 5%DMSO緩沖液，GE）將Cfz稀釋至5個濃度（13.20、6.60、3.30、1.65、0.83和0 μmol/L）。

將Cfz以30 μL/min的流速注入通道的Fc3-Fc4，結合期為60 s，然后解離90 s。結合和解離過程都在運行緩沖液中處理。

2 結果

2.1 MmpL5與Bdq和Cfz的分子對接

基于MmpL3-SQ109（PDB ID： 6AJG）、MmpL3-LMT（PDB ID： 6AJG）和AcrB-DM2（PDB ID： 2DR6）的已知復合結構，鑒定出MmpL5蛋白中的10個潛在藥物結合位點。如圖1A和B所示，在這些位點中，有3個位于MmpL5蛋白的膜外結構域，另外7個結合位點位于MmpL5蛋白的跨膜結構域。通過分子對接技術將Bdq、Cfz分別對接到這10個結合位點中，并根據計算得到的結合自由能選取最優復合物結構。結果表明，Bdq、Cfz的最佳結合位點均位于PD-BS1，結合自由分別為-9.1和-9.4 kcal/mol。如圖1C和D所示，藥物分子Bdq分子中的苯環與K76形成了陽離子-π相互作用。此外，藥物分子與D712、E556、S63、H77、S710、Q556等氨基酸形成極性相互作用，與V62、I78、M546、V554、L709、P711、L758、A763、M64等氨基酸形成疏水相互作用。

2.2 pET-32a-mmpL5-L1表達載體的構建

基于MmpL5與化合物分子對接的結果，Bdq、Cfz的最佳結合位點均位于PD-BS1，藥物分子Bdq分子中的苯環與K76形成了陽離子-π相互作用。藥物分子與S63、H77等氨基酸形成極性相互作用，與V62、M64、I78等氨基酸形成疏水相互作用。根據Uniprot蛋白質數據庫，Q52-R202為MmpL5蛋白兩個跨膜域之間的非跨膜域，能夠純化表達，因此設計截短蛋白MmpL5（Q52-R202）進一步研究。PCR方法擴增選取MTB的MmpL5（Q52-R202）基因片段命名為MmpL5-L1，MmpL5-L1片段長度為453 bp，目的基因條帶大小與理論值一致（圖2A）。EcoRⅠ和Hind Ⅲ 雙酶切目的基因及pET-32a表達載體，pET-32a空質?；驐l帶大小為5900 bp，雙酶切條帶大小與理論值一致（圖2B），測序結果無突變。

2.3 MmpL5-L1截短蛋白在大腸埃希菌中的表達

對經IPTG誘導的pET-32a-mmpL5-L1重組菌株及pET-32a空質粒菌株進行蛋白免疫印跡分析，MmpL5-L1截短蛋白相對分子質量為36 000 Da，加上6×His組氨酸標簽組成的重組蛋白，在相對分子質量為34 000～43 000 Da處出現目的條帶，而空質粒菌株沒有條帶（圖3A），表明MmpL5-L1在大腸埃希菌中成功表達。

2.4 MmpL5-L1截短蛋白的純化

用AKTA蛋白純化儀純化蛋白后，對純化蛋白進行蛋白免疫印跡分析。pET-32a-mmpL5-L1蛋白裂解液及洗脫液均在相對分子質量為34 000～43 000 Da處出現目的條帶（圖3B），表明MmpL5-L1截短蛋白成功純化。

2.5 Cfz與MmpL5-L1截短蛋白結合引起蛋白熒光淬滅

由于Bdq自身熒光值高，無法有效觀測到蛋白熒光的變化，所以本研究只檢測了Cfz對MmpL5-L1截短蛋白熒光強度的影響。通過蛋白熒光強度的變化，檢測蛋白與藥物之間是否發生結合。該實驗所用純化濃縮蛋白母液濃度測定2.64 mg/mL。從MmpL5-L1截短蛋白的熒光發射光譜可知，蛋白濃度的增加，蛋白的熒光強度也隨之增加（圖4A）。選取未經稀釋的100%蛋白母液（2.64 mg/mL）為固定蛋白濃度，加入等量不同濃度Cfz溶液后，觀察到MmpL5-L1截短蛋白熒光強度隨著藥物濃度的增高而逐漸降低（圖4B）。表明Cfz與MmpL5-L1截短蛋白發生結合，使得蛋白發生熒光淬滅，且蛋白熒光淬滅程度與Cfz藥物成濃度依賴性。

2.6 Bdq、Cfz與MmpL5-L1截短蛋白結合

用Biacore T200系統檢測MmpL5-L1截短蛋白與Bdq、Cfz之間的相互作用。在CM5芯片上捕獲的MmpL5-L1截短蛋白，通過結合平衡數據計算Bdq的親和常數KD為4.033×10-5 mol/L（圖5A和B），Cfz的親和常數KD為1.218×10-5 mol/L（圖5C和D），蛋白與藥物均具有中等親和力，證明MmpL5-L1截短蛋白與Bdq、Cfz之間有相互作用。

3 討論

MTB耐藥的主要原因之一是外排泵發揮外排作用，將藥物泵出菌體，使菌體內藥物含量降低，從而產生耐藥性。本研究主要考察MTB中外排蛋白MmpL5與Bdq、Cfz之間的相互作用，為MmpL5-MmpS5外排泵導致的Bdq、Cfz耐藥機制作進一步闡釋。本研究首先通過分子對接技術預測MmpL5蛋白具有10個潛在結合位點，分子對接預測結果顯示MmpL5蛋白與Bdq、Cfz的最佳結合位點均位于PD-BS1結合區域。對PD-BS1結合區域與藥物分子之間的相互作用力進行分析，發現MmpL5蛋白的第76位氨基酸（K76）與藥物分子中的苯環之間存在π-陽離子相互作用，使藥物分子可以較為穩定地結合在MmpL5蛋白的PD-BS1區域。因此選取包含PD-BS1區域及氨基酸位點（K76）的基因序列去構建MmpL5-L1（Q52-R202）截短蛋白。將構建好的MmpL5-L1截短蛋白表達純化后，用熒光淬滅技術和SPR技術測定其與Bdq、Cfz之間的相互作用。

H37Rv標準株的基因組有14個mmpL基因，這些基因編碼RND蛋白，被命名為MmpL轉運體[9，11]。RND蛋白形成同源三聚體或異源三聚體，每個單體包含12個跨膜結構域和兩個可溶性的胞質外[12-13]。MTB編碼13種MmpL蛋白，其中，MmpL5蛋白（Rv0676c基因編碼）由964個氨基酸組成，理論相對分子質量為104 800 Da，由12個跨膜結構域及2個周質結構域組成[14]，受下游的轉錄抑制因子Rv0678的調控[15]。我們前期研究發現，Bdq和Cfz對Rv0678突變的MTB交叉耐藥，Rv0678突變導致MmpL5和MmpS5表達的上調，外排泵抑制劑維拉帕米在體外能夠降低 Rv0678突變株的MIC[16]。同時本研究和其他研究團隊證明了MTB的膜蛋白MmpL5和MmpS5需要共表達才能使MmpL5蛋白在MTB和恥垢分枝桿菌中發揮外排作用，并且降低Bdq的藥物敏感性[17-19]。

本研究考慮從蛋白和小分子相互作用方面，給出MmpL5蛋白與Bdq、Cfz之間具有相互作用的直接證據。膜蛋白的表達與純化一直是蛋白研究的技術難題，前期在BL21（DE3）plysS大腸埃希菌及C43大腸埃希菌中多次嘗試表達純化膜蛋白MmpL5蛋白且更換DDM、LMNG等多種去污劑仍未能獲得理想結果，可能是外源膜蛋白在大腸埃希菌中的毒性、錯誤折疊、聚集等導致表達量低且MmpL5為12次跨膜蛋白導致純化難度大。因此，通過分子對接技術預測Bdq、Cfz與MmpL5蛋白的潛在結合位點，選取部分序列構建關鍵區域截短蛋白進行研究。

熒光淬滅技術是根據蛋白分子內源熒光被小分子淬滅程度來測定蛋白與小分子之間是否具有相互作用的方法。由于Bdq自身帶有很高的熒光強度，檢測時無法檢測到蛋白熒光強度的變化，所以研究過程中只檢測了MmpL5-L1截短蛋白與Cfz相互作用后蛋白熒光強度的變化。MmpL5-L1截短蛋白的熒光強度隨著藥物濃度的增高而逐漸降低，且蛋白熒光淬滅程度與Cfz藥物成濃度依賴性，表明Cfz與MmpL5-L1截短蛋白發生結合從而引起蛋白發生熒光淬滅。BIACORE是基于SPR原理來實時跟蹤生物分子間的相互作用的新型生物分析傳感技術，具有無需標記，高靈敏度，檢測快速，并能實時定量測試等優勢，所以本研究選擇此方法探究MmpL5-L1截短蛋白與Bdq、Cfz之間是否存在相互作用。MmpL5-L1截短蛋白與Bdq、Cfz的結合屬于快結合、快解離，對于較快結合的單分子結合動力學過程，可以采用結合模型分析模式。MmpL5-L1截短蛋白與Bdq的親和常數（KD）是40.3 μmol/L，與Cfz的親和常數（KD）是12.1 μmol/L，這表明MmpL5-L1截短蛋白與Bdq、Cfz是中等程度的親和相互作用。Sandhu等[20]研究發現分枝桿菌素作為MmpS5-MmpL5外排系統底物與MmpL5蛋白結合時，MmpS5蛋白可促進并增強MmpL5蛋白從細胞質中向周質空間轉運分枝桿菌素。因此推測Bdq、Cfz發生交叉耐藥原因可能與之類似，即Bdq、Cfz與MmpL5蛋白結合，通過MmpS5-MmpL5外排系統外排至菌體外。

Rv0678基因突變會導致Bdq與Cfz發生交叉性耐藥，與兩藥具有相同的MmpS5/MmpL5外排系統，該外排泵基因的上調會導致耐藥性的發生。與其他的分枝桿菌不同，麻風分枝桿菌基因組中不含有MmpS5-MmpL5操縱子，無法形成MmpS5-MmpL5外排系統，因此在使用Cfz治療麻風病時藥物不會經由MmpS5-MmpL5外排系統外排。本研究結果表明，Bdq與Cfz均可與MmpL5蛋白直接結合，進而使藥物經MmpS5-MmpL5系統外排至結核分枝桿菌菌體外。這可能就是Cfz在治療麻風病方面療效顯著并且沒有產生耐藥性問題，但在結核分枝桿菌中會與Bdq產生交叉耐藥現象的原因。

MmpL5蛋白除了Q52-R202外的其他部分本研究并未進行檢測。盡管MmpL5蛋白其他部分也可能與藥物具有相互作用，但參考分子對接結果，MmpL5蛋白與Bdq、Cfz主要結合位點應是第76位賴氨酸，該位點位于構建的MmpL5-L1截短蛋白基因片段中。前期也嘗試將關鍵結合位點進行定點突變，但構建的突變蛋白未能在大腸埃希菌中成功表達，考慮原因有二：一是該突變蛋白不適合在大腸埃希菌中表達或表達量過低，二是該位點是蛋白表達的關鍵位點，突變后影響了該蛋白的表達。雖然無法與構建截短蛋白形成對比，但是本研究明確了Bdq耐藥相關的MmpL5關鍵結合區域。在此基礎上，未來將開展藥物與MmpL5蛋白結合后如何從菌體內外排到菌體外，以及這個過程需要哪些蛋白參與等研究進一步明確MmpL5-MmpS5的轉運機制。同時，也在以抑制MmpL5-MmpS5系統作為靶點開發新型的抗結核藥物和聯合抗結核治療策略，減少Bdq耐藥性的發生，提高抗結核治療效果。

綜上所述，本研究構建了MTB的MmpL5-L1截短蛋白在大腸埃希菌中的表達體系，并成功純化MmpL5-L1截短蛋白。熒光淬滅實驗表明了Cfz與MmpL5-L1截短蛋白發生結合使得MmpL5-L1截短蛋白熒光強度降低。利用SPR技術，通過Biacore檢測也顯示Bdq、Cfz可與MmpL5-L1截短蛋白具有中等親和力，證明了MmpL5-L1截短蛋白和Bdq、Cfz之間有相互作用。本研究進一步解釋了MmpL5外排泵蛋白導致Bdq、Cfz藥物外排的機制，深化了MmpS5-MmpL5外排系統所導致的Bdq、Cfz耐藥機制的理解。

參 考 文 獻

World Health Organization. Global tuberculosis report 2023[R/OL]. Geneva： World Health Organization， 2023， https：//www.who.int/publications-detail-redirect/9789240083851.

Cox E， Laessig K. FDA approval of bedaquiline--the benefit-risk balance for drug- resistant tuberculosis[J]. N Engl J Med， 2014， 371（8）： 689-691.

Duan H， Chen X， Li Z， et al. Clofazimine improves clinical outcomes in multidrug-resistant tuberculosis： A randomized controlled trial[J]. Clin Microbiol Infect， 2019， 25（2）： 190-195.

Ismail N， Peters R P H， lsmail N A， et al. Clofazimine exposure in vitro selects efflux pump mutants and bedaquiline resistance[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2019， 63（3）： e02141-18.

Huh H J， Kim S Y， Jhun B W， et al. Recent advances in molrcular diagnostics and understanding mechanisms of drug resistance in nontuberculous mycobacterial diseases[J]. Infect Genet Evol， 2019， 72： 169-182.

Andries K， Villellas C， Coeck N， et al. Acquired resistance of Mycobacterium tuberculosis to bedaquiline[J]. PloS one， 2014， 9（7）： e102135.

Hankoorn R C， Uplekar S， Cole S T. Cross resistance between clofazimine and bedaquiline through upregulation of MmpL5 in Mycobacterium tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2014， 58（5）： 2979-2981.

Xu J， Wang B， Hu M， et al. Primary clofazimine and bedaquiline resistance among isolates from patients with multidrug resistant tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2017， 61（6）： e00239-17.

Briffotaux J， Huang W， Wang X， et al. MmpS5/MmpL5 as an efflux pump in Mycobacterium species[J]. Tuberculosis （Edinb）， 2017， 107： 13-19.

Radhakrishnan A， Kumar N， Wright C， et al. Crystal structure of the transcriptional regulator Rv0678 of Mycobacterium tuberculosis[J]. J Biol Chem， 2014， 289 （23）： 16526-16540.

Delmar J A， Su C C， Yu E W. Bacterial multidrug efflux transporters[J]. Annu Rev Biophys， 2014， 43： 93-117.

Kim E H， Nies D H， McEvoy M M， et al. Switch or funnel： how RND-type transport systems control periplasmic metal homeostasis[J]. J Bacteriol， 2011， 193（10）： 2381-2387.

Daury L， Orange F， Taveau J C， et al. Tripartite assembly of RND multidrug efflux pumps[J]. Nat Commun， 2016， 7： 10731.

Wells R M， Jones C M， Xi Z， et al. Discovery of a siderophore export system essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis[J]. PLoS Pathog， 2013， 9（1）： e1003120.

Pacheco S A， Hsu F F， Powers K M， et al. MmpL11 protein transports mycolic acid-containing lipids to the mycobacterial cell wall and contributes to biofilm formation in Mycobacterium smegmatis[J]. J Biol Chem， 2013， 288（33）： 24213-242122.

Xu J， Tasneen R， Peloquin C A， et al. Verapamil increases the bioavailability and efficacy of bedaquiline but not clofazimine in a murine model of tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2017， 62（1）： e01692-17.

Xu J， Li D， Shi J， et al. Bedquiline resistance mutations： correlations with drug exposures and impact on the proteome in M. tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2023， 67（7）： e0153222.

李東碩， 王彬， 陸宇， 等. 結核分枝桿菌膜蛋白MmpS5-MmpL5的表達及功能研究[J]. 中國防癆雜志， 2022， 44（3）： 227-233.

Yamamoto K， Nakata N， Mukai T， et al. Coexpression of MmpS5 and MmpL5 contributes to both efflux transporter MmpL5 trimerization and drug resistance in Mycobacterium tuberculosis[J]. mSphere， 2021， 6（1）： e00518-20.

Sandhu P， Akhter Y. Siderophore transport by MmpL5-MmpS5 protein complex in Mycobacterium tuberculosis[J]. J Inorg Biochem， 2017， 170： 75-84.