醫學研究生實驗設計能力培養

［摘 要］ 隨著我國醫學領域的高速發展，對于具備扎實理論基礎和卓越實踐能力的醫學人才的需求日益凸顯。在這一背景下，基礎性實驗教育作為培養醫學研究生科研能力和創新思維的重要途徑，其重要性不言而喻。然而，醫學研究生在面臨繁重的課業、臨床實習以及實踐任務時，往往難以抽出足夠的時間和精力來系統學習和開展基礎實驗研究。因此，在新醫科教育模式的引領下，我們需要探索更為高效、實用的基礎實驗教學方法。研究立足于當前醫學研究生的實際情況，通過具體的實驗教學實踐，提出了一套富有創新性且貼近臨床實際的基礎實驗課題設計與實施案例。這一案例不僅為醫學研究生提供了一個可供參考的基礎實驗研究新思路，更為他們應對當前醫學教育面臨的新挑戰提供了有力的支持。

［關鍵詞］ 基礎實驗；醫學研究生；科研能力；實踐；案例

［基金項目］ 2022—2026年武漢大學中南醫院科研基金項目“DNA聚合酶POLD1促進膀胱癌發生發展及重塑免疫微環境的功能和機制研究”（SWYBK03）

［作者簡介］ 曹馨月（1988—），女，湖南長沙人，碩士，武漢大學中南醫院生物樣本庫科研助理，主要從事泌尿系統腫瘤研究腫瘤學、生物樣本科學研究；余夢雪（1995—），女，湖北仙桃人，碩士，武漢大學中南醫院生物樣本庫、泌尿系統疾病湖北省重點實驗室助理實驗師（通信作者），主要從事腫瘤精準診療的應用轉化、泌尿系統腫瘤研究。

［中圖分類號］ G643.0 ［文獻標識碼］ A ［文章編號］ 1674-9324（2024）52-0001-06 ［收稿日期］ 2024-05-24

基礎性實驗教育在我國醫學人才的培養體系中占據舉足輕重的地位，是塑造高素質醫學人才的關鍵環節之一［1］。通過系統的基礎性實驗教育，醫學研究生能夠更深入地理解疾病的發病機制，掌握科學研究的方法，為未來的臨床實踐和科研工作奠定堅實的基礎。然而，當前的醫學研究生往往面臨著課業繁重、臨床教育及實踐任務繁重的挑戰，這使得他們難以投入足夠的時間和精力進行系統性學習和開展基礎實驗。鑒于這些現狀，我們有必要在醫學研究生基礎實驗教學過程中引入更多可切實開展的實驗類研究，以幫助他們更好地掌握實驗技能，提高綜合素質。本文致力于結合在實驗教學實踐中的具體體會，以一個具有代表性的基礎性實驗課題為例，詳細闡述其設計與實施過程，并針對其中存在的問題提出切實可行的建議，為醫學研究生的基礎實驗教學提供有益的參考。

一、選題立項

醫學研究生在開展基礎研究時，提出科學問題是一個至關重要的環節。科學問題應來源于臨床實踐或理論研究的實際需求，確保問題的實際應用價值。同時應廣泛了解所研究領域的前沿動態，確保問題的新穎性和創新性。以筆者團隊所在的泌尿系統疾病湖北省重點實驗室的研究重點膀胱癌為例。膀胱癌（Bladder cancer， BLCA）發病率居男性惡性腫瘤的第四位，2024年預計美國約有膀胱癌新發病例83 190例和死亡病例16 840例［2］。在我國，最新統計2022年全國腫瘤登記地區膀胱癌的發病率為6.58/10萬，其中男性膀胱癌發病率居全身惡性腫瘤第八位，女性亦排在第十位以后［3］。大約有5%的患者初診為轉移性膀胱癌，約30％的患者初診為肌肉浸潤性膀胱癌（Muscle invasive bladder cancer， MIBC），其中一半最終會發生轉移［4］。約70%的患者在初診時為非肌層浸潤性膀胱癌（Non-muscle invasive bladder cancer， NMIBC），15%～30%患者會發展成為MIBC；并且，50%～70%的患者經過治療后會復發，膀胱癌一旦發生肌層浸潤，將直接威脅患者生存［4］。目前針對MIBC比較有效的治療方法是手術和放化療等綜合治療，但會導致患者的生存質量下降［5］。MIBC的預后差與腫瘤細胞的快速生長、高浸潤性等密切相關，但分子機制尚未明確［5］。因此，明確闡明膀胱癌發生發展過程中的分子作用機制對膀胱癌的診斷和治療都具有十分重要的臨床價值。長非編碼RNA（long non-coding RNA， lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸的RNA分子，目前的研究表明lncRNA具有調節基因表達的功能，其在腫瘤的發生發展中起著至關重要的作用，亦是腫瘤研究的熱點問題［6］。然而，關于lncRNA在膀胱癌發生發展過程中的調控作用尚不明確，因此篩選表達異常水平的lncRNA作為膀胱癌可靠的生物標志物可能具有較大潛力。這部分主要分析了膀胱癌與lncRNA的研究現狀，為即將開展的基礎性實驗課題提供一個可靠的立項依據，展示課題的科學價值、創新性和可行性。

二、分子標志物的篩選及驗證

這部分將具體實施這項實驗課題，從膀胱癌患者的臨床樣本出發，利用高通量測序技術檢測腫瘤組織與對照樣本中lncRNA的表達水平，對獲得的數據進行深入分析，篩選出發生特異性改變的lncRNA，并基于這些初步發現篩選，通過驗證確定一系列候選lncRNA，為后續的機制研究奠定基礎。

1.初步驗證。在臨床采集的3對膀胱癌和正常膀胱上皮組織中，通過lncRNA芯片篩選，發現LINC00393在膀胱癌組織中顯著上調（見圖1A）。

2.進一步驗證。在臨床采集的50對膀胱癌樣本中，對LINC00393的表達水平進行qRT-PCR檢測。結果顯示，LINC00393在膀胱癌中的表達水平顯著升高（見圖1B），這一發現進一步證實了LINC00393與膀胱癌之間的關聯。

3.初步研究。通過繪制Kaplan-Meier生存曲線，可更直觀地展示LINC00393對膀胱癌患者生存期的影響。結果顯示，LINC00393低表達的患者相比高表達的患者具有更長的生存期（見圖2A），這進一步強調證明了LINC00393在膀胱癌中的重要性。同時，發現LINC00393的表達水平與SIRT1 mRNA表達水平呈正相關（R=0.608，p＜0.001）（見圖2B），這一發現提示LINC00393可能通過調控SIRT1的表達來影響膀胱癌的發展。最后，通過下調LINC00393的表達實驗，檢測觀察其對膀胱癌細胞T24增殖能力的影響。結果顯示，下調LINC00393后，膀胱癌細胞T24的增殖能力受到抑制，且SIRT1 mRNA和蛋白水平也明顯下降（圖2C-D）。這一發現不僅進一步證實了LINC00393與SIRT1的關系，也為后續的機制研究提供了方向。公共數據庫分析：使用The Cancer Genome Atlas（TCGA）中408例膀胱癌樣本測序數據進行GSEA通路富集分析，發現LINC00393的高表達明顯富集到PPAR信號通路；進一步提取TCGA數據庫中408例膀胱癌測序樣本的基因表達信息，分析發現LINC00393和SIRT1表達量呈顯著的正相關關系（具體結果未展示），這與圖1的篩選結果一致，再次驗證了LINC00393在膀胱癌中的重要角色。（A）50例膀胱癌病人的Kaplan-Meier生存曲線顯示LINC00393與病人的總生存期負相關；（B）膀胱癌組織中LINC00393與SIRT1 mRNA表達水平的相關性分析（R=0.608，p＜0.001）；（C）膀胱癌細胞T24中干擾LINC00393后，MTT結果顯示細胞的增殖能力下降；（D）膀胱癌細胞T24中干擾LINC00393后，SIRT1 mRNA和蛋白水平下降。

三、基于所篩選、驗證的生物標志物的機制研究

在膀胱癌組織中完成所篩選的生物標志物驗證后，進一步的機制研究需要采用膀胱癌細胞系模型進行基因操作，以便進行后續的表型檢測和機制研究（具體結果未展示）。首先，在膀胱癌細胞中利用生物素標記的RNA探針對LINC00393進行標記，隨后通過鏈霉素磁珠進行RNA pulldown實驗，最后通過蛋白質電泳結合質譜檢測技術確定LINC00393的相互作用蛋白PPARg。鑒于有文獻報道PPARg可以抑制SIRT1的轉錄［7］，同時在前期的實驗中也發現LINC00393和SIRT1的表達存在顯著的正相關關系。因此推測LINC00393可能通過與PPARg的結合來調控SIRT1的轉錄活性。為了驗證這一假設，可在后續的研究中圍繞LINC00393/PPARg/SIRT1信號調控軸展開更深入的探討實驗研究（具體結果未展示）。這一研究將為更全面地理解膀胱癌的發病機制提供新的視角和線索。

四、研究范例的討論及總結

基于該研究范例，可從以下幾個方面進行討論。

1.SIRT1的累積促進腫瘤的發生發展。SIRT1參與多種生物學過程并起著至關重要的作用，如細胞周期的調節、DNA修復和應激狀態下的細胞生存等［8-13］。此外，SIRT1在多種腫瘤中異常表達，如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等，推測SIRT1可能在腫瘤的發生過程中起到重要的作用［14-16］。有研究表明，SIRT1直接結合并去乙酰化p53、FOXO1、FOXO3和E2F1等轉錄因子，調控疾病進展［14-20］。前期研究發現，膀胱癌中SIRT1的表達上調，干擾SIRT1后抑制膀胱癌細胞的增殖和侵襲，表明SIRT1通過去乙酰化FOXO3a促進膀胱癌細胞的增殖和遷移［21］。基因表達主要是通過轉錄和轉錄后水平進行調節。研究表明，SIRT1在癌細胞中的過表達主要發生在轉錄水平，SIRT1基因啟動子中的兩個p53結合位點通常抑制SIRT1基因轉錄，腫瘤抑制因子HIC1與SIRT1形成轉錄抑制復合物，直接結合SIRT1啟動子并抑制其轉錄［22］。此外，在細胞應激或DNA損傷下，細胞周期和凋亡調節因子E2F1通過結合SIRT1啟動子直接誘導SIRT1轉錄［17］。lncRNA也被發現參與SIRT1的調節，其中競爭性內源RNA方式是目前研究最多的調控方式，例如，lncRNA HNF1A-AS1可通過內源競爭結合miR-34a誘導SIRT1表達從而促進結腸癌的轉移［23］。該討論部分表明，SIRT1的轉錄和轉錄后調控是其在腫瘤中異常表達的重要方式，SIRT1受lncRNA調節的其他機制目前未見報道。

2.轉錄因子PPARg參與SIRT1轉錄調控與膀胱癌密切相關。有研究表明，PPARg在多種腫瘤組織中高表達，其中包括膀胱癌。Yang等［24］通過熒光原位雜交技術檢測顯示，膀胱癌組織中PPARg表達量明顯高于癌旁組織，此外，與淺表性膀胱癌樣本相比，浸潤性膀胱癌組織中PPARg表達水平明顯更高。PPARg特異性激動劑羅格列酮能夠促進膀胱癌細胞的增殖［24-25］，提示PPARg的高表達或激活均能促進膀胱癌的發生進展。SIRT1是PPARg的重要調控靶點之一，PPARg蛋白可結合到SIRT1基因的啟動子區域，從而抑制SIRT1基因的轉錄［7］。同時，SIRT1也可以結合到PPARg啟動子區域抑制其轉錄，由此形成一個負反饋和自我調節的環路［26］。

3.LINC00393誘導轉錄因子PPARg結合促進SIRT1轉錄lncRNA通過多種機制進行轉錄水平調控，其中研究最多的是內源競爭結合miRNA，通過轉錄后調節基因的表達。例如，lncRNA HNF1A-AS1可通過內源競爭結合miR-34a誘導SIRT1表達從而促進結腸癌的轉移［23］。lncRNA也可以直接與蛋白結合發揮功能，例如lncRNA結合RNA結合蛋白TLS來調控蛋白CBP和p300的組蛋白乙酰轉移酶活性，進而抑制Cyclin D1的轉錄［27］。lncRNA Evf2能夠激活轉錄因子DLX2，進而調控基因轉錄［28］。lncRNA也能夠結合轉錄因子，通過調節轉錄因子結合啟動子的能力，促進或抑制相應基因的表達。比如，Luo等［29］研究發現，lncRNA GAS5通過增強轉錄因子E2F1與p27啟動子的結合能力，促進p27的轉錄。我們發現，lncRNA LINC00393在膀胱癌中表達量顯著增高，與腫瘤惡性程度相關，并與SIRT1 mRNA表達正性相關（R=0.608，p＜0.001）。此外，干擾LINC00393后，膀胱癌細胞增殖能力明顯減弱，同時SIRT1 mRNA和蛋白水平均明顯下降。

4.總結。在深入探討膀胱癌的分子機制過程中，發現LINC00393在膀胱癌組織中的表達顯著增加。LINC00393入核后與轉錄因子PPARg形成復合物，并誘導PPARg從SIRT1基因的啟動子區域解離，從而削弱了PPARg對SIRT1基因的轉錄抑制作用。與此同時，表達增加的SIRT1在入核后，仍然能夠結合PPARg的啟動子區域，發揮其抑制PPARg表達的作用，從而引起膀胱癌細胞內SIRT1的異常累積。進一步的研究發現，SIRT1的異常累積通過其去乙酰化作用，影響了FOXO信號通路、p53信號通路等多個關鍵信號通路的正常調節，通過誘導Cyclin D1的表達，抑制E-cadherin的表達，最終促進了膀胱癌細胞的增殖和遷移。本項研究通過詳細闡述膀胱癌中LINC00393在PPARg-SIRT1回路中的調控作用及其分子機制，不僅為詮釋膀胱癌發生進展的分子機制提供新的科學依據，更為膀胱癌的治療提供新的潛在靶標。這一發現對于膀胱癌的早期診斷、治療以及預后評估都具有重要的理論和實踐意義。

結語

醫學研究生教育，作為我國高層次醫學人才培養的重要基礎，始終承載著為國家和社會培養杰出醫學人才的重大使命。在當前新時代背景下，隨著醫學科技的飛速發展和新醫科理念的提出，如何在新醫科的統領下，實現更加符合臨床實際需求、更加具有實踐性和創新性的實驗性教學，已成為當前醫學研究生教育面臨的新挑戰。近年來，隨著醫學研究的深入和臨床問題的復雜化，對實驗性課題的需求呈現出爆發性的增長趨勢。然而，不容忽視的是，作為醫學研究主力軍的研究生，在院校內能夠獲得的基礎實驗課題指導和條件卻相對匱乏，這在一定程度上制約了他們的研究能力和創新能力的提升。因此，本文旨在為解決這一問題，提供一種新的思路和方法。通過深入剖析臨床學習負擔繁重的醫學研究生的實際需求，本文提出了一個操作性強、貼合臨床問題、能夠深入研究疾病發生發展機制的實驗性研究范例。這一范例不僅能有效彌補當前醫學研究生在實驗課題方面的不足，還能為他們提供一個全新的視角和思考方式，激發他們的創新思維和探索精神。相信這一范例的提出，將為醫學研究生的基礎性實驗課題研究提供有力的支持和指導，進一步推動醫學研究生教育的創新和發展。

參考文獻

［1］于建渤，曹永，劉星，等.基礎醫學實驗教學課程改革的實踐與探索［J］.基礎醫學教育，2016，18（4）：299-301.

［2］SIEGEL R L， GIAQUINTO A N， JEMAL A. Cancer statistics， 2024［J］. CA： A cancer journal for clinicians，2024，74（1）：12-49.

［3］HAN B， ZHENG R， ZENG H， et al. Cancer incidence and mortality in China，2022［J］. Journal of the national cancer center，2024，4（1）：47-53.

［4］DYRSKJOT L， HANSEL D E， EFSTATHIOU J A， et al. Bladder cancer［J］. Nature reviews disease primers，2023，9（1）：58.

［5］LOPEZ-BELTRAN A， COOKSON M S， GUERCIO B J， et al. Advances in diagnosis and treatment of bladder cancer［J］. The British medical journal，2024，384：e076743.

［6］ADNANE S， MARINO A， LEUCCI E. LncRNAs in human cancers： signal from noise［J］. Trends in cell biology，2022，32（7）：565-573.

［7］HAN L， ZHOU R， NIU J， et al. SIRT1 is regulated by a PPARgamma-SIRT1 negative feedback loop associated with senescence［J］. Nucleic acids research，2010，38（21）：7458-7471.

［8］SUN Y， YANG Y M， HU Y Y， et al. Inhibition of nuclear deacetylase Sirtuin-1 induces mitochondrial acetylation and calcium overload leading to cell death［J］. Redox biology，2022，53：102334.

［9］RASTI G， BECKER M， VAZQUEZ B N， et al. SIRT1 regulates DNA damage signaling through the PP4 phosphatase complex［J］. Nucleic acids research，2023，51（13）：6754-6769.

［10］QIN Z， FANG X， SUN W， et al. Deactylation by SIRT1 enables liquid-liquid phase separation of IRF3/IRF7 in innate antiviral immunity［J］. Nature immunol，2022，23（8）：1193-1207.

［11］LIANG J， HUANG G， LIU X， et al. The ZIP8/SIRT1 axis regulates alveolar progenitor cell renewal in aging and idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Journal of clinical investigation，2022，132（11）：e157338.

［12］LEVINE D C， KUO H Y， HONG H K， et al. NADH inhibition of SIRT1 links energy state to transcription during time-restricted feeding［J］. Nature metaboli-sm，2021，3（12）：1621-1632.

［13］KAPOOR-VAZIRANI P， RATH S K， LIU X， et al. SAMHD1 deacetylation by SIRT1 promotes DNA end resection by facilitating DNA binding at double-strand breaks［J］. Nature communications，2022，13（1）：6707.

［14］LIU T， LIU P Y， MARSHALL G M. The critical role of the class Ⅲ histone deacetylase SIRT1 in cancer［J］. Cancer research，2009，69（5）：1702-1705.

［15］ONYIBA C I， SCARLETT C J， WEIDENHOFER J. The mechanistic roles of sirtuins in breast and prostate cancer［J］. Cancers（Basel），2022，14（20）：5118.

［16］DILMAC S， KUSCU N， CANER A， et al. SIRT1/FOXO signaling pathway in breast cancer progression and metastasis［J］. International journal of molecular sciences，2022，23（18）：10227.

［17］WANG C， CHEN L， HOU X， et al. Interactions between E2F1 and SirT1 regulate apoptotic response to DNA damage［J］. Nature cell biology，2006，8（9）：1025-1031.

［18］ZHU M， WEI C， WANG H， et al. SIRT1 mediated gastric cancer progression under glucose deprivation through the FoxO1-Rab7-autophagy axis［J］. Frontiers inoncology，2023，13：1175151.

［19］CHEN H， LIN X， YI X， et al. SIRT1-mediated p53 deacetylation inhibits ferroptosis and alleviates heat stress-induced lung epithelial cells injury［J］. International journal of hypertherm-ia，2022，39（1）：977-986.

［20］BORDBARI S， MORCHEN B， PYLAEVA E， et al. SIRT1-mediated deacetylation of FOXO3a transcription factor supports pro-angiogenic activity of interferon-deficient tumor-associated neutrophils［J］. International journal of cancer，2022，150（7）：1198-1211.

［21］HU Q， WANG G， PENG J， et al. Knockdown of SIRT1 suppresses bladder cancer cell proliferation and migration and induces cell cycle arrest and antioxidant response through FOXO3a-mediated pathways［J］.Biomed research international，2017：3781904.

［22］CHEN W Y， WANG D H， YEN R C， et al. Tumor suppressor HIC1 directly regulates SIRT1 to modulate p53-dependent DNA-damage responses［J］.Cell，2005，123（3）：437-448.

［23］FANG C， QIU S， SUN F， et al. Long non-coding RNA HNF1A-AS1 mediated repression of miR-34a/SIRT1/p53 feedback loop promotes the metastatic progression of colon cancer by functioning as a competing endogenous RNA［J］.Cancer letters，2017，410：50-62.

［24］YANG D R， LIN S J， DING X F， et al. Higher expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma or its activation by agonist thiazolidinedione-rosiglitazone promotes bladder cancer cell migration and invasion［J］.Urology，2013，81（5）：1109. e1-1109. e6.

［25］LUBET R A， FISCHER S M， STEELE V E， et al. Rosiglitazone， a PPAR gamma agonist： potent promoter of hydroxybutyl（butyl）nitrosamine-induced urinary bladder cancers［J］. International journal cancer，2008，123（10）：2254-2259.

［26］PENG T， WANG G， CHENG S， et al. The role and function of PPARgamma in bladder cancer［J］. Journal of cancer，2020，11（13）：3965-3975.

［27］CUI W， YONEDA R， UEDA N， et al. Arginine methylation of translocated in liposarcoma（TLS） inhibits its binding to long noncoding RNA， abrogating TLS-mediated repression of CBP/p300 activity［J］. Journal of biological chemistry，2018，293（28）：10937-10948.

［28］FENG J， BI C， CLARK B S， et al. The Evf-2 noncoding RNA is transcribed from the Dlx-5/6 ultraconserved region and functions as a Dlx-2 transcriptional coactivator［J］.Genes amp; development，2006，20（11）：1470-1484.

［29］LUO G， LIU D， HUANG C， et al. LncRNA GAS5 inhibits cellular proliferation by targeting P27（Kip1）［J］.Molecular cancer research，2017，15（7）：789-799.

Training of Experimental Design Ability for Medical Graduate Students： A Case Study on a Foundational Experimental Topic

CAO Xin-yue1，2， LI Wen-jing1， XU Zi-lin1，2， YU Meng-xue1，2，3

（1. Department of Biological Repositories Zhongnan Hospital of Wuhan University， Wuhan， Hubei 430071， China; 2. Human Genetic Resources Preservation Center of Hubei Province， Wuhan， Hubei 430071， China; 3. Hubei Key Laboratory of Urological Diseases， Wuhan， Hubei 430071， China）

Abstract： With the rapid development of the medical field in our country， the demand for professionals with solid theoretical foundations and excellent practical skills has become increasingly prominent. In this context， the importance of fundamental experimental education for cultivating the research capabilities and innovative thinking of medical graduate students is evident. However， due to heavy academic workloads， clinical internships， and practical assignments， these students often struggle to dedicate sufficient time and energy to systematic fundamental experimental research. To address this issue， it is essential to explore more efficient and practical methods for fundamental experimental teaching within the new medical education model. This research proposes a set of innovative and clinically relevant cases for designing and implementing fundamental experimental projects based on specific teaching practices. These cases not only provide medical graduate students with new approaches to fundamental experimental research but also offer robust support to meet the emerging challenges in medical education today.

Key words： basic experimentation; medical postgraduates; research capacity; practice; case study