Fam117b調控cAMP信號通路促進病理性心肌肥厚的作用機制

摘要" 目的：通過加權基因共表達網絡分析（WGCNA）對小鼠心臟轉錄組測序數據進行分析，篩選與心肌肥厚發生有關的基因和細胞信號通路。方法：通過主動脈弓縮窄法（TAC）構建心肌肥厚小鼠模型，在體外水平、解剖水平和病理水平對模型進行評價。對小鼠心肌組織進行轉錄組測序，篩選表達差異的基因。利用基因集富集分析（GSEA）和WGCNA篩選與心肌肥厚發生相關的蛋白和細胞信號通路。結果：模型建立4周后，小鼠心臟的結構和功能發生明顯改變，主要表現在小鼠左室后壁舒張末期厚度（LVPWd）較對照小鼠明顯增加（P＜0.05），而左室射血分數（LVEF）和左室短軸縮短率（LVFS）較對照組明顯降低（P＜0.05）。模型組心體比和心脛比均較對照組明顯增加（P＜0.05）。心肌組織麥胚凝集素/凝集蛋白（WGA）染色結果顯示，模型組小鼠心肌細胞麥胚凝集素/凝集蛋白染色定量較對照組小鼠明顯增大（P＜0.05）。小鼠心肌組織轉錄組測序結果顯示，與對照組比較，模型組心肌組織中分別有451個基因明顯上調，225個基因明顯下調。對差異基因進行GSEA分析，環磷酸腺苷（cAMP）信號通路被明顯富集，且其在模型組小鼠心肌組織中被明顯上調。小鼠心肌轉錄組測序數據WGCNA分析結果顯示，由385個基因構成的共表達網絡與心肌肥厚的表型相關，其中包括19個明顯上調基因和32個明顯下調基因。對共表達網絡進行基因本體（GO）分析，富集得到多條與心肌肥厚發生密切相關的生物過程，如蛋白代謝及磷酸化、器官發育、細胞凋亡等。進一步相關分析發現，共表達網絡中的基因Fam117b在心肌肥厚小鼠心臟中的表達與cAMP信號通路中的基因表達呈正相關，且其在模型組小鼠心肌組織中表達被明顯上調。結論：Fam117b能夠通過激活cAMP信號通路誘導病理性心肌肥厚的發生，這將為該病的臨床治療提供新的靶點。

關鍵詞" 病理性心肌肥厚；環磷酸腺苷；Fam117b；轉錄組；加權基因共表達網絡分析；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.23.009

Fam117b Regulating cAMP Signaling Pathway to Promote Pathological Myocardial Hypertrophy

FU Heqing1， LIU Jing2，3， NIE Huijuan2， DENG Hui2， DONG Yu1，4， LIU Tianlong2，3， ZHANG Mingjie2

1.College of Pharmacy， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， Inner Mongolia， China; 2.Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010030， Inner Mongolia， China; 3.Key Laboratory of Clinical and Basic Research in Cardiovascular Diseases， Innovative Team of Basic Research in Cardiovascular Diseases， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， Inner Mongolia， China;4.Engineering Technology Research Center of Pharmacodynamic Substance and Quality Control of Mongolian Medicine in Inner Mongolia

Corresponding Author" LIU Tianlong， E-mail： tinalongliu1984@163.com

Abstract" Objective：Mouse heart transcriptome sequencing data were analyzed by weighted gene coexpression network analysis（WGCNA） to screen genes and cell signaling pathways related to the occurrence with myocardial hypertrophy.Methods：A mouse model of myocardial hypertrophy was constructed by transverse aortic constriction（TAC） and evaluated at the in vitro，anatomical and pathological levels.Transcriptome sequencing was performed on mouse myocardial tissue to screen the genes with different expression.Gene set enrichment analysis（GSEA） and WGCNA were used to screen proteins and cell signaling pathways associated with myocardial hypertrophy.Results：Four weeks after the establishment of the model，the structure and function of the mouse heart were significantly changed，mainly in the end diastolic thickness（LVPWd） of the left ventricular posterior wall significantly increased compared with that of the control mice（P＜0.05），while the left ventricular ejection fraction（LVEF） and left ventricular short axis shortening rate（LVFS） significantly decreased compared with that of the control group（P＜0.05）.The heart-to-body ratio in model group and tibia ratio in control group significantly increased（P＜0.05）.The results of wheat germ lectin/agglutinin（WGA） staining showed that the area of myocardial cells in the model group was significantly increased compared with that in the control group（P＜0.05）.Transcriptome sequencing of mouse myocardial tissue showed that 451 and 225 genes were significantly up-regulated or down-regulated in the myocardial tissue of the model group compared with that of the control group.By GSEA analysis of differential genes，cyclic adenosine phosphate（cAMP） signaling pathway obviously enriched，and it was significantly upregulated in myocardial tissue of model group mice.The results of WGCNA analysis of mouse myocardial transcriptome sequencing data showed that the co-expression network composed of 385 genes" associated with the phenotype of myocardial hypertrophy，including 19 significantly up-regulated genes and 32 significantly down-regulated genes.Through gene ontology（GO） analysis of co-expression network，multiple biological processes closely related to myocardial hypertrophy were obtained，such as protein metabolism and phosphorylation，organ development，cell apoptosis，etc.Further correlation analysis showed that the expression of the gene Fam117b in the co-expression network was positively correlated with the gene expression in the cAMP signaling pathway in the heart of mice with myocardial hypertrophy，and its expression was significantly up-regulated in the myocardial tissue of mice in the model group.Conclusion：Fam117b can induce pathological myocardial hypertrophy by activating cAMP signaling pathway，which will provide a new target for clinical treatment of this disease.

Keywords" pathological myocardial hypertrophy; cyclic adenosine phosphate; Fam117b; transcriptome; weighted gene coexpression network analysis; experimental study

基金項目" 國家自然科學基金項目（No.81960048，82160058，82260838）；內蒙古自治區科技計劃項目（No.2019GG128）；內蒙古自治區自然科學基金項目（No.2021LHMS08043）；內蒙古醫科大學附屬醫院博士啟動金項目（No.NYFY BS 202114）；內蒙古自治區高等學校青年科技人才發展計劃項目（No.NJYT22005）；內蒙古自治區高等學校科學研究項目（No.NJZY19103）

作者單位" 1.內蒙古醫科大學藥學院（呼和浩特 010110）；2.內蒙古醫科大學附屬醫院（呼和浩特 010030）；3.內蒙古醫科大學心血管疾病臨床和基礎研究重點實驗室（呼和浩特 010110）；4.內蒙古自治區蒙藥藥效物質與質量控制工程技術研究中心

通訊作者"" 劉天龍，E-mail：tinalongliu1984@163.com

引用信息" 付賀青，劉晶，聶慧娟，等.Fam117b調控cAMP信號通路促進病理性心肌肥厚的作用機制

［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（23）：4285-4292.

《中國心血管健康與疾病報告2022概要》指出，隨著生活方式的改變和社會老齡化的不斷加快，我國心血管病發病率和死亡率仍在升高，疾病負擔下降的拐點尚未出現［1］。流行病學統計結果發現，高血壓是首要的心血管疾病危險因素［2］。眾所周知，長期的高血壓將導致心、腦、腎等重要靶器官的結構和功能損害，這極大地增加了高血壓病人的死亡風險［3］。病理性心肌重構是最常見的高血壓靶器官損傷。研究顯示，36%～41%的高血壓病人存在不同程度心臟功能和結構的改變，主要臨床表現為心肌肥厚、纖維化及心臟功能的降低［4-5］。目前，雖然發現了一些與心肌重構有關的基因、蛋白及信號通路，但心肌重構的發病機制尚不明確，臨床上缺少有效的治療藥物［6-8］。因此，研究和篩選與心肌重構有關的蛋白和細胞信號通路，對于藥物的設計和合成具有重要指導意義。

環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）作為重要的第二信使參與細胞代謝、離子通道激活、基因表達、細胞生長、分化和凋亡等諸多重要的生命過程［9-10］。研究顯示，cAMP信號通路參與心肌肥厚的發生、發展及形成［11-13］。在病理條件下，如高血壓、心肌梗死及心力衰竭，外周血中的兒茶酚胺類物質明顯升高［14］。兒茶酚胺類物質與細胞膜上的α/β-腎上腺素受體結合活化腺苷酸環化酶而導致心肌細胞中的cAMP水平升高。cAMP通過活化蛋白激酶A使心肌細胞內質網中的鈣離子釋放，鈣離子與鈣調蛋白相結合促進病理性心肌肥厚相關基因的表達［12］。Fam117b（family with sequence similarity 117，member b）是動物體內由589個氨基酸編碼的高度保守蛋白。研究顯示，Fam117b在胃癌組織中表達明顯升高，且其參與調控胃癌細胞的增殖［15］。此外，研究顯示，Fam117b被報道與腔隙性中風和肉樣瘤病發生有關［16-17］。然而，其在心血管疾病中的作用尚鮮有報道。本研究通過加權基因共表達網絡分析（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis，WGCNA）對小鼠心臟轉錄組測序數據進行分析，篩選與心肌肥厚發生有關的基因和細胞信號通路，分析Fam117b在心肌組織中的表達與cAMP細胞通路關鍵分子的關系，為該病的臨床治療提供新的靶點。

1" 材料與方法

1.1" 儀器、試劑及動物

1.1.1" 儀器

小動物超聲系統（D6 LAB，飛依諾科技股份有限公司）；酶標儀（Multiskan FC，Thermos）；顯微鏡（LV100NPOL/Ci-POL，日本NIKON尼康）；紫外分光光度計（NanoDrop One，ThermoFisher Scientific）；組細胞破碎儀（Bullet Blender）；聚合酶鏈式反應（PCR）儀（QuantStudio3，ThermoFisher Scientific）。

1.1.2" 試劑

2，2，2-三溴乙醇（Sigma-Aldrich，貨號：75-80-9）；4%多聚甲醛（Biosharp，貨號：BL539A）；麥胚凝集素/凝集蛋白（WGA）（AAT Bioquest，貨號：25530）；Trozol（CWIB，貨號：25530）；逆轉錄試劑（翌生生物，貨號：11141ES10）；實時熒光定量PCR（RT-PCR）試劑盒（翌生生物，貨號：11184ES60）。

1.1.3" 動物

無特定病原體（SPF）級BALB/C雄性小鼠20只，體質量18～22 g，購于內蒙古醫科大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養于內蒙古醫科大學動物中心屏障系統內，恒溫（22～26 ℃）、恒濕（相對濕度40%～60%）環境喂養。動物實驗經內蒙古醫科大學倫理委員會批準（YKD202101044），所有操作均遵守《實驗動物使用規范》。

1.2" 小鼠病理性心肌肥厚模型的制備

隨機選取10只小鼠，根據文獻［18］報道的方法制備小鼠心肌肥厚模型，主動脈弓縮窄（transverse aortic constriction，TAC）具體手術過程：使用3%的三溴乙醇麻醉小鼠，注射劑量為0.3 mL/20 g體質量。小鼠麻醉后仰臥于自制的小鼠固定裝置上，剃毛消毒后，沿小鼠中位線縱向剪開小鼠頸部皮膚，開口大小為2 cm左右。剝離甲狀腺及頸部肌肉，暴露出氣管。使用眼科鑷子沿胸骨上窩頓性分離胸骨下組織后，在胸骨上窩切沿中位線剪開約0.5 cm的縱向切口，暴露主動脈弓。鈍性分離主動脈弓處的組織使其游離，使用自制的穿線器將6-0的尼龍線穿過主動脈弓，墊27G針頭結扎。結扎后拔出針頭，縫合胸骨和皮膚。手術完成后將小鼠置于25 ℃電熱毯上等待其蘇醒。對照組小鼠進行相同操作的手術，但不結扎主動脈弓。手術完成4周后，從體外水平、解剖水平、病理水平及分子水平對模型進行評價。

1.3" 小鼠心臟功能體外評價

小鼠TAC手術4周后，使用1.5%異氟烷麻醉小鼠，待心率穩定后，利用小動物超聲系統檢測小鼠心臟的結構和功能改變。收集小鼠的左室舒張末期室間隔厚度（IVSd）、左室舒張末期內徑 （LVEDD）、左室后壁舒張末期厚度（LVPWd）、左室收縮末期室間隔厚度（IVST）、左室收縮末期內徑（LVESD）、左室后壁收縮末期厚度（LVPWT）等參數，并計算左室射血分數（LVEF）和左室短軸縮短率（LVFS）。

1.4" 心肌組織WGA染色

實驗結束后，處死小鼠并收集心臟，去掉心耳及部分主動脈。將完整的心臟從上到下平均分成3部分，兩端部分液氮速凍后，于－80 ℃凍存，用于轉錄組測序分析。中間部分心臟使用4%多聚甲醛固定，用于病理染色。將固定的心肌組織經脫水后包埋于石蠟中，切片。石蠟切片厚度6 μm，于乳頭肌水平橫切，經脫蠟、去除內源性過氧化物酶及抗原活化后，行WGA染色評價小鼠心肌肥厚程度。

1.5" 心肌肥厚生物標志物檢測

將－80 ℃凍存的心肌組織10 mg置于0.5 mL Trizol中，利用組織細胞粉碎儀將心肌組織打碎，回收Trizol并與等體積的氯仿混合，充分混合2 min，靜置2 min，12 000×g離心10 min，取中間水相于RNAase-Free的1.5 mL離心管中，加入等體積的70%乙醇，混合均勻。將得到的混合液轉移到吸附柱中，12 000×g離心20 s，倒掉廢液。向吸附柱中加入700 μL Buffer RW1，12 000×g離心20 s，棄掉廢液，加入500 μL Buffer RW2，12 000×g離心2 min，室溫晾干吸附柱，加入50 μL焦碳酸二乙酯（DEPC）水，室溫放置1 min，12 000×g離心1 min，收集RNA。

使用紫外分光光度計檢測RNA的濃度，并將其逆轉錄為cDNA，逆轉錄的體系如下：total RNA 100 pg，5×g DNA digester Mix 3 μL，DEPC H2O to15 μL，42 ℃孵育2 min后，加入4×HifairⅢSuperMix plus 5 μL。設置PCR儀逆轉錄程序為：25 ℃ 5 min，55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃，將RNA逆轉錄為cDNA。

設計和合成心肌損傷標志物ANP和BNP的引物，ANP：正向引物為5′-CGGAGCCTACGAAGATCCAG-3′，反向引物5′-AAGCTGTTGCAGCCTAGTCC-3′；BNP：正向引物為5′- GAGGTCACTCCTATCCTCTGG-3′，反向引物5′- GAGGTCACTCCTATCCTCTGG-3′；GAPDH：正向引物為5′- AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，反向引物5′- TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。RT-PCR體系為10 μL，其中10 μmol/L的正向、反向引物各1 μL，SYBR Green master Mix 5 μL，模板3 μL。反應完成后，通過2－△△Ct計算心鈉肽（ANP）和腦鈉肽（BNP）的表達量。

1.6" 心肌組織轉錄組測序

利用Trizol法提取心肌組織的RNA，建庫上機進行轉錄組測序。轉錄組測序工作由上海凌恩生物科技有限公司完成。以P＜0.05及|log2（FC）|＞1作為篩選差異基因的條件并對差異基因進行基因集富集（gene set enrichment analysis，GSEA）分析。利用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對差異基因進行基因本體（GO）。

1.7" 統計學處理

采用Graphpad軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。以P＜0.05為差異有統計學意義。利用R軟件對轉錄組測序數據進行WGCNA分析。

2" 結" 果

2.1" 體外超聲評價小鼠心臟的結構和功能改變

TAC手術4周后，模型組小鼠心臟的結構和功能發生明顯改變，主要表現為IVSd、LVPWd、LVESD和LVPWT較對照組明顯增加，而LVEF和LVFS 較對照組明顯降低，詳見圖1、表1。

2.2" 兩組心體比（HW/BW）和心脛比（HW/TL）比較

TAC手術4周后，模型組HW/BW和HW/TL較對照組明顯增加（P＜0.001），詳見圖2。模型組小鼠心臟的外觀輪廓較對照組小鼠明顯增大，心肌組織WGA染色結果顯示，模型組心肌細胞WGA染色定量較對照組明顯增加（P＜0.05），說明TAC手術后小鼠出現明顯的病理性心肌肥厚表型。詳見圖3、圖4。

2.3" 心肌肥厚生物標志物的檢測

為了進一步在分子水平對TAC誘導的病理性心肌肥厚小鼠模型進行評價，利用實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測心肌肥厚標志物ANP和BNP在小鼠心肌組織中的表達。結果顯示，TAC手術4周后，模型組ANP和BNP在心肌組織中的表達較對照組明顯增加（P＜0.01）。詳見圖5。

2.4" 小鼠心肌轉錄組測序及分析結果

為了進一步研究病理性心肌肥厚的分子機制，對小鼠心肌組織進行轉錄組測序。以P＜0.05及|log2（FC）|＞1作為篩選差異基因的條件，結果顯示，與對照組比較，模型組心肌組織中共有451和225個基因明顯上調，225個基因明顯下調（見圖6）。對差異基因進行GSEA分析，cAMP信號通路被明顯富集［標準化富集得分（NES）為1.507，P＝0.047］，說明TAC誘導的cAMP信號通路活化參與小鼠病理性心肌肥厚的發生和形成，詳見圖7 和圖8。

2.5" 小鼠轉錄組測序數據WGCNA篩選與病理性心肌肥厚表型相關的共表達網絡

采用標準化連接度法對轉錄組測序的10個樣本進行聚類分析并以樹形圖進行展示，結果顯示，10個樣本可分為兩大類，無離群值予以剔除（見圖9）。通過 WGCNA R 軟件包中的pick softThreshold 功能對各加權系數下的網絡連接度進行計算，挑選滿足SFTRsq（R2）＞0.90 的同時，還可保留網絡節點間的最大連接度（max.k.）、平均連接度（mean.k.）和中位連接度（median.k.）的軟閾值，最終選取軟閾值為 14 進行后續分析（見圖10）。按照軟閾值為 14 進行鄰接矩陣以及拓撲矩陣的獲取，然后根據相異度，對得到的拓撲矩陣進行聚類，使用 cutreeDynamic 功能對層次聚類樹進行動態樹切割，其中剪切深度（deep split）的功能參數設定為 2，經過計算，最終成功將 lncRNA 劃分為 6 個模塊，每一個模塊均以單獨的顏色來表示（見圖11）。進一步計算每個模塊與模型的相關性，結果顯示，綠松石色模塊（MEturquoise）與心肌肥厚表型的相關度最高（見圖12），其所代表的共表達網絡見圖13。對共表達網絡中的基因進行GO富集分析，富集得到多條與心肌肥厚發生相關的生物過程，如蛋白代謝及磷酸化、器官發育、細胞凋亡等，詳見圖14。

2.6" 心肌肥厚關鍵基因的相關性

將WGCNA篩選出的與心肌肥厚表型相關的基因與富集到cAMP信號通路中涉及的基因進行相關性分析，詳見圖15。共表達網絡中的基因Fam117b在心肌肥厚小鼠心肌組織中明顯高表達（見圖16），且其表達與cAMP信號通路中的基因Atp2b3、Vip、Cnga4、Nppa、Grin1表達呈正相關（P＜0.05），詳見圖17。

3" 討" 論

心肌肥厚是心臟在長期高前后壓力負荷下出現的代償性和失代償性結構和功能的改變，是發生心力衰竭或猝死的重要原因［12］。病理性心肌肥厚前期臨床表現較隱匿，就診病人均有一定程度的心臟功能改變。目前，病理性心肌肥厚的發病機制尚不明確，臨床上也缺少有效的治療手段。研究表明，腎上腺素受體信號通路在心肌肥厚以及心力衰竭的發生中起著重要的作用［19］。病理條件下，G蛋白（Gs）耦聯腎上腺素能受體激活腺苷酸環化酶（adenylate cyclase，AC）產生cAMP，激活cAMP依賴的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），使鈣離子通道活動增加，增強心臟收縮力，然而持續性刺激是有害的，將導致心臟肥大［20］。cAMP信號傳導可以不依賴于PKA，直接作用于cAMP下游結合蛋白Eapc。當Eapc被激活后，促使Ca2＋活動增加，刺激Rac發揮活性，最終激活活化T細胞因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT），NFAT作為轉錄因子入核促進心肌肥厚相關基因的表達［21］。

Fam117b位于2q33.2染色體區域，與少年型肌萎縮側索硬化和肥大綜合征有關［22-23］。Fam117b屬于序列相似性家族117，該家族的另外兩個成員為Fam117a和Fam117c。Fam117a又稱為C/EBP 誘導蛋白，研究顯示Fam117a在肺癌病人的表達降低，可以抑制細胞生長周期［24］。Fam117c稱為糖皮質激素誘導轉錄因子1（glucocorticoid induced transcript 1，GLCCI1），過表達GLCCI1通過調控白細胞介素-13（IL-13）/骨膜蛋白（periostin）/轉化生長因子-β1（TGF-β1）信號通路抑制氣管重構，發揮保護哮喘的活性［25］。目前，未發現Fam117b在心臟結構和功能研究中的報道。本研究發現了Fam117b在心肌肥厚小鼠心肌組織中表達明顯升高，且其表達水平與cAMP信號通路相關蛋白表達呈正相關。

本研究的局限性：1）為前期探索性研究，對Fam117b的功能未做驗證；2）心肌肥厚小鼠心肌組織中Fam117b表達水平較正常小鼠明顯增加，但這種增加是代償性增加，還是病理性增加，尚無法確定。今后課題組將利用慢病毒和腺相關病毒-9在細胞水平和動物水平對Fam117b進行心臟特異性過表達，深入研究其活性及其在心肌肥厚中的作用。

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（收稿日期：2024-02-06）

（本文編輯郭懷印）