艾托格列凈對索拉非尼和多納非尼在大鼠體內藥動學的影響及機制研究

關鍵詞艾托格列凈；索拉非尼；多納非尼；藥動學；超高效液相色譜-串聯質譜法

2022年我國原發性肝癌發病人數為36.77萬，在各種惡性腫瘤發病率中位列第5，死亡人數高達31.65萬[1]。分子靶向藥能夠針對腫瘤發生、發展的關鍵靶點進行有效干預，是晚期肝癌的主要治療手段之一[2]。多靶點激酶抑制劑索拉非尼于2008年6月被我國國家藥品監督管理局批準用于治療不能手術切除的肝癌，其對晚期肝癌患者具有生存獲益，是目前臨床上肝癌治療的一線藥物[1，3]。多納非尼是將索拉非尼結構中的1個甲基取代為三氘代甲基所形成的氘代衍生物，其可延長晚期肝癌患者的總生存期且安全性明顯優于索拉非尼[4]。索拉非尼在體內主要經肝臟細胞色素P450酶3A4（CYP3A4）代謝，此外尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（uridinediphosphateglucuronosyltransferase，UGT）1A9Ⅱ相代謝也是其重要代謝途徑之一[5]，而多納非尼同樣是CYP3A4和UGT1A9代謝酶的底物[6]。

2型糖尿病（type2diabetes，T2DM）是一種代謝性疾病，研究發現T2DM患者發生肝癌的風險較非糖尿病患者增加2～3倍[7]，另外，T2DM也是肝癌患者的常見合并癥[8]。艾托格列凈是新一代鈉-葡萄糖共轉運蛋白2（sodium-glucosecotransporter2inhibitor，SGLT2）抑制劑，口服吸收迅速，主要經UGT酶代謝，并有多種轉運體參與其體內過程[9]。艾托格列凈在T2DM尤其合并動脈粥樣硬化性心血管疾病或肥胖的患者中降糖效果確切，臨床應用廣泛，常與索拉非尼或多納非尼聯合用于治療T2DM合并肝癌患者[10―11]。上述3種藥物同為UGT酶的底物，目前尚無明確的研究數據表明艾托格列凈與索拉非尼或多納非尼聯用時對藥動學的具體影響。基于此，本研究擬考察艾托格列凈對索拉非尼和多納非尼在大鼠體內藥動學參數的影響，并初步探討其作用機制，旨在為臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC-30A型超高效液相色譜系統（日本Shimadzu公司）、ABSciex5500型三重四極桿串聯質譜儀（美國AB公司）、SorvallST16型高速冷凍離心機（美國ThermoFisherScientific公司）、VM-03U型迷你渦旋混勻器（美國CTI公司）、MultiskanMk3型酶標儀（芬蘭Labsystems公司）、SLAN-96S型全自動熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（上海宏石醫療科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

索拉非尼對照品（批號C15090388，純度98%）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；多納非尼對照品（批號ZZS-20-X261-A1，純度99.57%，同位素純度99.91%）購自上海甄準生物科技有限公司；甲苯磺酸多納非尼片（批號01221105，規格0.1g）購自蘇州澤璟生物制藥股份有限公司；艾托格列凈片（批號W010399，規格5mg）購自默沙東（中國）投資有限公司；肝素鈉溶液（批號F201240402，規格2mL∶1.25萬單位）購自河北常山生化藥業股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自北京索萊寶科技有限公司；總RNA提取試劑（批號Y2222）購自北京天根生化科技有限公司。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A7（UGT1A7）、乳腺癌耐藥蛋白（breastcancerresistanceprotein，BCRP）和P-糖蛋白（Pglycoprotein，P-gp）的引物購自武漢塞維爾生物科技有限公司，引物序列及擴增產物長度見表1。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為SPF級雄性SD大鼠，共30只，體重（250±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0008。大鼠在溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%環境中飼養7d，自由攝食和飲水。實驗前12h禁止大鼠攝食，允許自由飲水。本研究通過河北省人民醫院醫學倫理委員會批準（批件號為202322），符合相關規定及要求。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件

以菲羅門TitankC18（100mm×2.1mm，3μm）為色譜柱，以水（A）-乙腈（B）為流動相進行等度洗脫（0～3min，90%B）；流速為0.3mL/min；進樣量為1μL。

2.1.2 質譜條件

采用電噴霧離子源，多反應監測模式正離子掃描；離子源溫度為500℃；氣簾氣壓力為20psi、碰撞氣體壓力為8kPa、噴射電壓為5500V；Gas1、Gas2均為60psi；索拉非尼的定量分析離子對為質荷比（m/z）465.2→270.3（去簇電壓為100V，碰撞能量為45eV），多納非尼的定量分析離子對為m/z468.3→255.3（去簇電壓為100V，碰撞能量為40eV）。

2.2 溶液的配制

精密稱取索拉非尼和多納非尼對照品適量，分別加入1mLDMSO溶解，配制成質量濃度均為1mg/mL的儲備液。取上述各成分儲備液適量，均用50%乙腈溶液逐級稀釋，分別制得質量濃度均為50、100、500、2000、8000、20000、40000、50000ng/mL的索拉非尼和多納非尼標準曲線工作溶液。同法配制質量濃度均為150、15000、37500ng/mL的索拉非尼和多納非尼質控工作溶液。

多納非尼（索拉非尼-D3）與索拉非尼互為內標，分別用50%乙腈溶液稀釋得到2000ng/mL的索拉非尼內標工作溶液和1500ng/mL的多納非尼內標工作溶液。分析前，儲備液與工作溶液均置于－20℃冰箱中保存。

2.3 血漿樣品的處理

索拉非尼和多納非尼的血漿樣品均采用液液萃取法進行處理。取大鼠血漿樣品50μL，加入對應內標溶液5μL和甲基叔丁基醚300μL，渦旋混勻3min后于4℃條件下以12000r/min離心10min；取上清液150μL，于室溫下以氮氣吹干，用300μL50%乙腈溶液復溶，隨后立即渦旋混勻1min，待測。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察

按“2.3”項下方法分別處理大鼠空白血漿、空白血漿+定量下限工作溶液（索拉非尼、多納非尼質量濃度均為5ng/mL）、大鼠給藥后血漿樣品（索拉非尼、多納非尼分別為給藥后8h和3h樣品），其中處理空白血漿不加內標溶液。按“2.1”項下方法進樣分析，記錄色譜圖。結果顯示，空白血漿中的內源性物質均不干擾索拉非尼及多納非尼的定量測定，表明本方法專屬性良好，結果見圖1。

2.4.2 標準曲線及定量下限考察

分別取“2.2”項下索拉非尼系列工作溶液5μL，均加入45μL大鼠空白血漿，渦旋混合得到索拉非尼質量濃度分別為5、10、50、200、800、2000、4000、5000ng/mL的標準血漿溶液；同法制得多納非尼相同系列質量濃度的標準血漿溶液。上述樣品均按“2.3”項下方法處理后進樣分析。以分析物質量濃度為橫坐標（x），分析物與內標的峰面積比值為縱坐標（y），采用加權最小二乘法進行回歸分析，得索拉非尼的回歸方程為y＝0.00990x+0.00859（r＝0.9990），多納非尼的回歸方程為y＝0.00311x+0.02010（r＝0.9965），表明索拉非尼和多納非尼在5～5000ng/mL質量濃度范圍內均具有良好的線性關系，定量下限均為5ng/mL。

2.4.3 精密度及準確度考察

按“2.3”項下方法分別配制索拉非尼和多納非尼質量濃度為5、15、1500、3750ng/mL的定量下限及低、中、高質量濃度的質控血漿樣品各6份，連續3d內測定，每天均用隨行標準曲線回歸方程定量索拉非尼及多納非尼的實際質量濃度，考察日內及日間精密度；以實際質量濃度與理論質量濃度的相對誤差（relativeerror，RE）考察準確度，結果見表2。由表2可知，索拉非尼日內、日間RSD均不超過4.80%，RE為－1.93%～1.84%；多納非尼日內、日間RSD均不超過7.09%，RE為－2.30%～2.65%；RSD和RE均滿足生物樣本定量分析的要求，本方法具有較好的重現性。

2.4.4 提取回收率及基質效應考察

按“2.4.3”項下方法分別配制低、中、高質量濃度的索拉非尼、多納非尼質控血漿樣品，每個濃度各6份，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下方法進樣分析，記錄分析物與內標的峰面積比值為A。同法處理空白血漿（不加內標），取上清液得到空白基質，然后加入內標溶液和不同質量濃度的質控工作溶液，進樣分析測得分析物與內標的峰面積比值為B。分析物質控純溶液與內標的峰面積比值為C。按照公式[提取回收率（%）＝A/B×100%、基質效應（%）＝B/C×100%]進行計算，結果見表3。由表3可知，索拉非尼和多納非尼的提取回收率分別為96.18%～104.12%、95.68%～100.40%，均符合定量分析要求。索拉非尼和多納非尼質控樣品的基質效應分別為98.00%～107.51%、98.93%～103.96%，表明基質的存在均不干擾兩藥的測定。

2.4.5 穩定性考察

按“2.4.3”項下方法分別配制低、中、高質量濃度的索拉非尼和多納非尼質控血漿樣品，每個濃度各6份，分別置于室溫下8h、自動進樣器中12h、－80℃至室溫反復凍融3次及－80℃條件下放置1個月，考察不同條件下樣品的穩定性。結果顯示，4種條件下索拉非尼和多納非尼峰面積的RSD分別不超過5.33%和6.02%，RE分別在－2.33%～4.00%和－4.11%～6.80%范圍內，具有較好的穩定性。

2.4.6 稀釋可靠性考察

按“2.2”項下方法分別配制4倍于定量上限質量濃度即20μg/mL的多納非尼溶液，將該溶液用大鼠空白血漿分別稀釋5倍和10倍，每個稀釋倍數下各濃度樣品平行制備6份，再按“2.3”項下方法處理后進樣分析，結果見表4。由表4可知，多納非尼血漿樣品在不同的稀釋倍數下，RSD均不超過2.49%，表明在血漿藥物濃度高于定量上限時，多納非尼可采用空白血漿稀釋法進行準確定量（因索拉非尼在大鼠體內的藥物濃度均未超過定量上限，所以方法學部分無需考察其稀釋可靠性）。

2.5 大鼠體內藥動學研究

2.5.1 艾托格列凈對索拉非尼藥動學參數影響實驗

將12只雄性SD大鼠隨機分為A、B兩組，每組6只。A、B組大鼠分別連續7d灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液4mL/kg和艾托格列凈（用0.5%CMCNa溶液溶解，下同）1.5mg/kg（劑量根據臨床等效劑量換算，下同），第7天在給藥1min后均灌胃索拉非尼（用含5%DMSO的0.5%CMC-Na溶液溶解）100mg/kg（劑量根據文獻[12―14]設置）。分別于索拉非尼給藥前及給藥后0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、24、36、48、72、96h從大鼠眼內眥靜脈叢取血，每個采血點取血量約100μL。血漿置于肝素化離心管中，于4℃條件下以3500r/min離心10min，取上層血漿保存至－80℃冰箱中待分析。

2.5.2 艾托格列凈對多納非尼藥動學參數影響實驗

將12只雄性SD大鼠隨機分為C、D兩組，每組6只。C、D組大鼠分別連續7d灌胃0.5%CMC-Na4mL/kg和艾托格列凈1.5mg/kg，第7天給藥1min后均灌胃多納非尼[用0.5%羥丙基甲基纖維素溶液和純凈水按4∶1（V/V）配制成溶劑溶解]40mg/kg（劑量根據臨床等效劑量換算）。分別于多納非尼給藥前及給藥后0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24、48、72、96h從大鼠眼內眥靜脈叢取血，其余操作同“2.5.1”。

2.5.3 數據處理與分析

將“2.5.1”“2.5.2”項下血漿樣品按“2.3”項下方法處理，再按“2.1”項下方法進樣分析，記錄峰面積，分別根據隨行回歸方程計算不同采血點大鼠血漿中索拉非尼（A、B組）或多納非尼（C、D組）的質量濃度。采用GraphPadPrism8.0軟件繪制藥-時曲線，結果見圖2。應用DAS2.1.1軟件（非房室模型）計算索拉非尼、多納非尼藥動學參數，結果以x±s表示，詳見表5。使用SPSS25.0軟件進行統計分析，以獨立樣本t檢驗（正態分布）或Mann-WhitneyU秩和檢驗（非正態分布）進行組間比較，檢驗水準α＝0.05。由表5可知，與A組比較，B組大鼠血漿中索拉非尼的藥-時曲線下面積（AUC0-t）、AUC0-∞、峰濃度（cmax）、達峰時間（tmax）、平均滯留時間（MRT0-t）和MRT0-∞均顯著降低，清除率（CL）和表觀分布容積（V）均顯著升高（P＜0.05）；與C組比較，D組大鼠血漿中多納非尼的AUC0-t、AUC0-∞、tmax、cmax、MRT0-t均顯著降低，V和CL均顯著升高（P＜0.05）。

2.6 艾托格列凈對大鼠肝臟和小腸組織中UGT1A7、P-gp、BCRPmRNA表達的影響

2.6.1 大鼠肝臟及小腸組織的采集

將6只雄性SD大鼠隨機分為空白對照組和艾托格列凈給藥組，每組3只。空白對照組大鼠灌胃0.5%CMC-Na（4mL/kg），艾托格列凈給藥組大鼠灌胃艾托格列凈（1.5mg/kg），每天1次，連續7d。末次給藥結束后，腹腔注射2%戊巴比妥麻醉大鼠，迅速取出大鼠的肝臟及小腸組織；用預冷的生理鹽水沖洗組織并用濾紙吸干表面水分，將組織轉移至包埋盒中，于液氮中速凍后置于－80℃冰箱保存。

2.6.2 大鼠肝臟和小腸組織中UGT1A7、P-gp、BCRPmRNA表達水平檢測

取各組大鼠肝臟和小腸組織適量，采用RNA快速抽提試劑盒提取其中總RNA，分析RNA純度后，將其反轉錄成cDNA。然后以cDNA為模板進行PCR。PCR反應條件為：95℃預變性15min；95℃變性10s，60℃退火32s，共40個循環。以NADPH為內參，采用2－ΔΔCt法計算UGT1A7、P-gp、BCRPmRNA的表達水平。由圖3可知，與空白對照組比較，艾托格列凈給藥組大鼠肝臟和小腸組織中UGT1A7、P-gp、BCRPmRNA表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05），結果見圖3。

3 討論

腫瘤患者罹患共病情況較為常見，多重用藥現象十分普遍，導致藥物相互作用（drug-druginteraction，DDI）發生的風險顯著增加[15―16]，有研究表明，腫瘤患者中DDI發生率高達88.1%[17]。索拉非尼和多納非尼作為一線抗腫瘤藥物，在中、晚期肝癌治療中發揮著重要作用，臨床上常與其他藥物聯合使用[1]。T2DM是肝細胞癌的獨立危險因素之一[7]，艾托格列凈為T2DM尤其是伴肥胖患者的優選降糖藥物，但艾托格列凈是否影響索拉非尼和多納非尼的藥動學過程尚不明確。本研究結果顯示，艾托格列凈可使索拉非尼的AUC0-t、AUC0-∞和cmax分別下降54.7%、54.7%和47.5%，使多納非尼的AUC0-t、AUC0-∞和cmax分別下降43.3%、42.8%和21.6%。此外，艾托格列凈可使索拉非尼和多納非尼的CL均顯著增加（分別增加126.4%和66.7%），tmax均顯著縮短（分別下降38.4%和49.9%）。這表明聯用艾托格列凈后，索拉非尼和多納非尼在大鼠體內的排泄量增加、暴露量減少。由于暴露量下降可能使藥物治療效果不佳，因此，建議臨床上艾托格列凈與索拉非尼或多納非尼聯合用藥時，應予以重點關注。

本研究結果表明，艾托格列凈對大鼠肝臟和小腸組織中UGT1A7mRNA的表達無明顯影響，這提示艾托格列凈對索拉非尼和多納非尼代謝的影響可能不依賴于其對UGT酶的作用。索拉非尼是P-gp、BCRP外排轉運體的底物[18―19]，為進一步探究潛在的機制，本研究還考察了艾托格列凈對上述轉運體mRNA表達的影響，結果顯示，艾托格列凈對P-gp、BCRPmRNA的表達無明顯作用。索拉非尼、多納非尼與艾托格列凈均為高蛋白結合率藥物[5―6，11]，筆者推測可能是由于聯用時藥物會競爭相同的蛋白結合位點，使索拉非尼或多納非尼的游離藥物濃度增加、清除加快，從而導致索拉非尼或多納非尼的暴露量減少。

綜上所述，艾托格列凈可影響索拉非尼和多納非尼在大鼠體內的藥動學過程，減少兩者的體內暴露量，但其作用機制可能并非是通過調控相關代謝酶和轉運體；建議臨床聯合用藥時應警惕藥物治療效果不佳可能導致的疾病進展。