連翹脂素調節cAMP/EPAC1/RAP1信號通路對肺癌細胞惡性進展的影響

摘要：目的 探究連翹脂素調節環磷酸腺苷/環磷腺苷激活的交換蛋白1/Ras相關蛋白1（cAMP/EPAC1/RAP1）信號通路對肺癌細胞惡性進展的影響。方法 體外培養肺癌細胞A549，并分為對照組，連翹脂素低、中、高劑量組（25、50、100 mg/L），連翹脂素高劑量+百日咳毒素（PTX）組（100 mg/L連翹脂素+5 μmol/L PTX），連翹脂素高劑量+EPAC1拮抗劑（ESI-09）組（100 mg/L連翹脂素+1.5 μmol/L ESI-09）。CCK-8實驗檢測細胞增殖；劃痕實驗檢測細胞遷移；Transwell檢測細胞侵襲；流式細胞術檢測細胞凋亡；酶聯免疫吸附試驗檢測細胞上清液cAMP水平；Western blot分析cAMP/EPAC1/RAP1信號通路及凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bax）表達。結果 相較于對照組，連翹脂素低、中、高劑量組OD450值、劃痕愈合率、細胞侵襲數目、cAMP水平、EPAC1、RAP1和Bcl-2表達下降，細胞凋亡率和Bax表達升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與連翹脂素高劑量組比較，連翹脂素高劑量+PTX組A549細胞中光密度（OD）450值、劃痕愈合率、侵襲細胞數目、cAMP水平、EPAC1、RAP1和Bcl-2蛋白表達增加，細胞凋亡率和Bax表達下降（P＜0.05）；連翹脂素高劑量+ESI-09組各指標水平均與之相反。結論 連翹脂素通過下調cAMP/EPAC1/RAP1信號通路阻礙A549細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。

關鍵詞：肺腫瘤；連翹脂素；細胞增殖；細胞凋亡；cAMP/EPAC1/RAP1信號通路

中圖分類號：R734.2 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20250063

肺癌是常見的原發性惡性腫瘤，發病率和死亡率逐年遞增，對其早期治療通常可取得較好的預后效果，而晚期預后較差［1］。因此，亟需開發高效的新治療藥物，尋找有效的診斷分子來改善患者預后。連翹脂素又稱為連翹苷，提取于木犀科植物連翹干燥果實中［2］。研究發現，連翹脂素具有抗癌、抗菌和抗炎等藥理作用［3］。吳林斌等［4］研究發現連翹苷可通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路削弱腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。環磷酸腺苷（cAMP）是一種蛋白激酶致活劑，可通過與cAMP激活的交換蛋白1（EPAC1）作用使Ras相關蛋白1（RAP1）脫離鳥苷二磷酸（GDP），結合鳥苷三磷酸（GTP），激活下游分子，從而調控細胞生長過程［5］。Moon等［6］研究發現抑制EPAC1/RAP1通路可抑制腦腫瘤細胞生長。但連翹脂素調節cAMP/EPAC1/RAP1信號通路對肺癌細胞惡性進展的影響尚未可知。因此，本研究將深入探討連翹脂素對肺癌細胞增殖、遷移等惡性進展的影響及其與cAMP/EPAC1/RAP1信號通路的調節關系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 肺癌細胞A549購自中國科學院細胞庫；CCK-8試劑盒購自上海經科化學科技有限公司；EPAC1拮抗劑（ESI-09）購自上海源葉生物科技有限公司；百日咳毒素（PTX）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；cAMP酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒及羊抗兔二抗HRP購自Abcam（英國）公司；兔源一抗B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔源一抗EPAC1、RAP1、GAPDH購自索萊寶科技（北京）有限公司；基質膠購自BD（美國）公司。FlexA-200酶標儀購自蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司；FCK-50C光學顯微鏡、DFM-90C倒置顯微鏡購自上海蔡康光學儀器有限公司；CytoFLEX SRT流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司；4200SF凝膠成像儀購自上海天能生命科學有限公司。

1.2 細胞培養及分組 取出凍存的A549細胞進行復蘇，然后放置在37 ℃、5%CO2 細胞培養箱中培養，培養基選用含10% FBS 和1% 雙抗的RPMI-1640，24 h 后進行傳代。將A549細胞分為對照組，連翹脂素低、中、高劑量組（25、50、100 mg/L，該劑量根據文獻［7］和前期預實驗結果確定），連翹脂素高劑量+PTX（特異性增加細胞內cAMP含量）組（100 mg/L連翹脂素+5 μmol/L PTX［8］），連翹脂素高劑量+ESI-09 組（100 mg/L連翹脂素+1.5 μmol/L ESI-09［8］）。對照組常規培養，加等量溶劑DMSO，其余組用相應藥物處理48 h。

1.3 CCK-8 法檢測A549 細胞增殖 A549 細胞在96 孔板（1×104 個/孔）培養，24 h后依據1.2 分組進行藥物干預，24、48、72 h 后分別添加10 μL CCK-8 試劑，37 ℃、5%CO2 孵育2 h。用酶標儀測定450 nm光密度（OD）值。

1.4 劃痕實驗測定A549細胞遷移 A549細胞接種于6孔板（1×106個/孔）進行貼壁培養。使用200 μL無菌移液器尖端在孔中進行劃痕，然后用1.2 中不同分組對應的藥物處理劃傷的細胞48 h。用光學顯微鏡在0 h和48 h捕獲劃痕區域，并測量劃痕寬度，以0 h和48 h劃痕寬度差值與0 h劃痕寬度百分比表示劃痕愈合率。

1.5 Transwell 檢測A549細胞侵襲 用200 μL不加FBS的RPMI-1640培養基培養A549細胞（1×106個細胞），將其接種于Transwell上室，Transwell上室涂有40 μL基質膠。然后，在Transwell下室添加RPMI-1640培養基500 μL。用規定濃度的藥物在37 ℃、5%CO2 培養箱中培養細胞48 h，清洗Transwell 插入物上表面，用4%多聚甲醛固定細胞30 min。用0.1%結晶紫染色20 min。倒置顯微鏡下對隨機5個視野中的侵襲細胞進行計數。

1.6 流式細胞術檢測A549細胞凋亡 A549細胞按照1.2 分組方法用不同藥物處理48 h，用預冷的PBS洗滌1次，用PBS稀釋的300 μL Binding Buffer 重懸。孵育10 min 后，加入5 μL Annexin V-FITC；然后加入5 μL PI，混合均勻，室溫避光孵育15 min，1 h內流式細胞儀檢測。

1.7 ELISA檢測細胞上清液中cAMP水平 收集處理后的各組A549細胞上清液，嚴格按照cAMP ELISA試劑盒說明書步驟檢測cAMP水平。

1.8 Western blot測定EPAC1、RAP1及凋亡蛋白表達 將各組A549細胞勻漿，在低溫下用RIPA裂解緩沖液處理30 min，分離提取物中蛋白質。用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經SDS-PAGE分離，轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉阻斷1 h，4 ℃ 將PVDF 膜與Bax、EPAC1、RAP1、Bcl-2、GAPDH（1∶1 500）一抗過夜孵育。室溫下孵育二抗（1∶3 000）4 h。ECL顯影，用Quantity One軟件分析蛋白灰度值。

1.9 統計學方法 用GraphPad Prism 6軟件進行數據分析，計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組A549細胞增殖水平比較 對照組，連翹脂素低、中、高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組和連翹脂素高劑量+ESI-09組24、48、72 h的OD450值差異均有統計學意義（n=5，F 分別為201.931、114.342、63.658，均P＜0.01）。相較于對照組，連翹脂素低、中、高劑量組24、48、72 h的OD450值下降，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于連翹脂素高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組24、48、72 h的OD450值增加，連翹脂素高劑量+ESI-09組OD450值下降（P＜0.05）。見圖1。

2.2 各組A549細胞遷移情況比較 對照組，連翹脂素低、中、高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組和連翹脂素高劑量+ESI-09 組劃痕愈合率（%）分別為60.23±5.11、47.64±3.81、33.52±2.75、19.67±1.37、31.16±2.42和13.58±1.08，組間比較差異有統計學意義（n=5，F=158.080，P＜0.05）。相較于對照組，連翹脂素低、中、高劑量組劃痕愈合率降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于連翹脂素高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組A549細胞劃痕愈合率升高，連翹脂素高劑量+ESI-09組A549細胞劃痕愈合率降低（P＜0.05）。見圖2。

2.3 各組A549細胞侵襲情況比較 對照組，連翹脂素低、中、高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組和連翹脂素高劑量+ESI-09組侵襲細胞數目（個）分別為87.51±6.17、72.63±5.56、54.42±4.18、35.17±2.44、49.93±3.82、23.68±1.63，組間比較差異有統計學意義（n=5，F=153.139，P＜0.01）。相較于對照組，連翹脂素低、中、高劑量組侵襲細胞數目下降，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于連翹脂素高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組A549細胞侵襲細胞數目升高，連翹脂素高劑量+ESI-09組A549細胞侵襲細胞數目降低（P＜0.05）。見圖3。

2.4 各組A549細胞凋亡情況比較 對照組，連翹脂素低、中、高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組和連翹脂素高劑量+ESI-09 組細胞凋亡率（%）分別為6.13±0.67、13.75±1.23、21.02±1.91、32.33±2.65、22.16±1.98和41.84±3.59，組間比較差異有統計學意義（n=5，F=166.438，P＜0.01）。相較于對照組，連翹脂素低、中、高劑量組凋亡率升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于連翹脂素高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組凋亡率降低，連翹脂素高劑量+ESI-09組凋亡率升高（P＜0.05）。見圖4。

2.5 各組A549細胞上清液中cAMP水平比較 對照組，連翹脂素低、中、高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX 組和連翹脂素高劑量+ESI-09 組cAMP（nmol/L）水平分別為21.93±1.79、17.29±1.42、11.67±0.95、6.34±0.53、16.86±1.35 和6.29±0.52，組間比較差異有統計學意義（n=5，F=143.527，P＜0.01）。相較于對照組，連翹脂素低、中、高劑量組cAMP水平下降，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；相較于連翹脂素高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組A549細胞上清液中cAMP 水平升高，連翹脂素高劑量+ESI-09 組A549細胞上清中cAMP水平變化無顯著差異。2.6 各組A549 細胞cAMP/EPAC1/RAP1 通路及凋亡蛋白表達水平比較 與對照組比較，連翹脂素低、中、高劑量組A549細胞Bax表達增加，EPAC1、RAP1和Bcl-2表達減少，并且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與連翹脂素高劑量組比較，連翹脂素高劑量+PTX組A549 細胞Bax 表達減少，EPAC1、RAP1 和Bcl-2 表達增加（P＜0.05），連翹脂素高劑量+ESI-09組A549細胞Bax表達增加，EPAC1、RAP1和Bcl-2表達減少（P＜0.05），見圖5、表1。

3 討論

肺癌可分為非小細胞癌和小細胞癌，肺癌發病率和死亡率在男性惡性腫瘤中均占首位，在女性惡性腫瘤中排第三［9］。臨床中常依據患者的病程來選擇多種方法綜合治療，但目前臨床治療方式對于晚期患者預后效果較差［10］。因此，需要更深入地了解肺癌進展的病理機制，尋找新藥物來改善患者預后。

天然化學物質被認為是抗癌藥物的重要來源［11］。連翹脂素是從傳統中藥連翹中提取的一種活性成分，具有許多生物學特性［12］。研究表明，連翹苷元通過調節多種細胞行為表現出抗癌作用［13］。Li等［3］研究發現連翹苷元可顯著阻滯胰腺癌細胞侵襲、遷移和上皮間充質轉化。Ding等［14］研究發現連翹苷元通過調節SHP-1/JAK2/STAT3信號通路抑制骨肉瘤生長和轉移。近年研究顯示，連翹脂素可增強結直腸癌腫瘤微環境的免疫應答，抑制血管生成［15］；并抑制宮頸癌［16］、前列腺癌［17］細胞增殖、侵襲、遷移并誘導凋亡。本研究結果顯示，與對照組比較，連翹脂素低、中、高劑量組OD450值、侵襲細胞數目、劃痕愈合率及Bcl-2表達下降，凋亡率、Bax表達增加，且呈劑量依賴性，表明連翹脂素能夠誘導肺癌細胞凋亡，阻滯細胞增殖、遷移和侵襲。

cAMP對細胞的調控作用主要通過蛋白激酶控制細胞內代謝過程，主要作用靶點有cAMP依賴蛋白激酶A（PKA）和EPAC［18］。EPAC 有EPAC1 和EPAC2 兩種形式，EPAC1 是一種100 ku 的單體蛋白，在全身組織均有分布［19］。RAP1屬于Ras小G蛋白家族［20］。作為cAMP的下游效應分子，EPAC1參與GDP/GTP 交換，將與RAP1 結合的GDP 置換為GTP，引起RAP1激活，從而在多種生物學功能中發揮重要作用。研究表明cAMP/EPAC1/RAP1信號通路是腫瘤進展的關鍵信號通路［21］。Kumar等［22］研究發現EPAC1在乳腺癌細胞遷移和凋亡中發揮重要作用，通過其特異性抑制劑ESI-09阻斷EPAC1表達可促進乳腺癌細胞凋亡，抑制細胞遷移。本研究發現，低、中、高劑量連翹脂素均能降低A549細胞中cAMP水平及EPAC1和RAP1表達，其效果隨劑量增高而增強，說明連翹脂素可能通過介導cAMP/EPAC1/RAP1通路緩解肺癌進展過程。為證實這一推測，本研究在連翹脂素高劑量作用基礎上分別利用可特異性增加細胞內cAMP含量的PTX和EPAC1拮抗劑ESI-09進行處理，結果發現，相比連翹脂素高劑量組，連翹脂素高劑量+PTX組細胞凋亡率和Bax表達下降，OD450值、侵襲細胞數目、劃痕愈合率、cAMP水平、EPAC1、RAP1和Bcl-2表達增高；連翹脂素高劑量+ESI-09 組趨勢與之相反。由此表明，抑制cAMP/EPAC1/RAP1通路可增強連翹脂素對A549細胞惡性進展的抑制作用，激活cAMP/EPAC1/RAP1通路可減弱連翹脂素對A549細胞惡性進展的抑制作用，證實了連翹脂素可能通過下調cAMP/EPAC1/RAP1通路誘導A549細胞凋亡，抑制細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上，連翹脂素可通過抑制cAMP/EPAC1/RAP1通路抑制肺癌細胞惡性進展。這為連翹脂素在肺癌領域的應用提供了一定參考，但信號通路對癌癥的調控極其復雜，連翹脂素改善肺癌發生發展過程的其他機制還有待深入探究。另外，本研究樣本量較少，僅用一株細胞系進行功能驗證和機制研究。未來將使用多個肺癌細胞株驗證連翹脂素的功能，并通過動物實驗進一步探討連翹脂素在體內的作用是否與體外研究結果一致。同時，將通過與其他中藥成分進行比較，觀察連翹脂素在抗肺癌方面是否有優勢。

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（2025-01-07收稿 2025-02-14修回）

（本文編輯 李志蕓）