金散外敷干預MEK/ERK信號通路治療肉芽腫性小葉性乳腺炎模型大鼠的作用機制

【天鍵詞】肉牙腫性小葉性孔腺炎；金更散；MEK/EKK信號通路

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】A 【文章編號】1007-8517（2025）10-0047-06

DOI：10.3969/j. issn.1007-8517.2025.10.zgmzmjyyzz202510009

Mechanism of Jinhuang Powder External Application Intervention on MEK/ERK Signaling Pathwayin theTreatmentof GranulomatousLobularMastitisModel Rats

LI Qianyan1ZHANG Ying2LI Benfa3HUANG Donghan3WANG Mengyuan4LI Zhuoling1MA Siqi1HUANG Min1* 1.Yunnan Universityof Traditional Chinese Medicine，Kunming65o5O0，China；2.WuhanFirstHospital，Wuhan430022， China；3.The First Afiliated Hospitalof Yunnan Universityof Traditional Chinese Medicine，Kunming 65O021，China; 4.YunnanVocational College of Transportation，Kunming 65O3Oo，China

Abstract：ObjectiveToexploretheefectofJinhuang Powderonregulating the MEK/ERK signaling pathwayinrats with granulomatouslobularmastitis（GLM）．MethodThirtyfemaleSDratswererandomlydividedintothre groups：blankcontrol group，model group，andJinhuangPowdergroup.Takeoilinmilksuspensionandinjectitintothefourthpairofmammaryglandsofrats toestablishaGLMmodel；TheblankcontrolgroupratswereinjectedwithanequalamountofphysiologicalsalineatthesamesiteAfter thesuccessulestablishmentofthemodel，ratsinteJinuangPowdergroupweretreatedwithJinuangowderexterally，hileats inthe blankcontrolgroupandmodelgroupweretreatedwith Vaselineexterall.After24hoursofmodelestablishment，thefourth pairof breastissuewas takenforHEstainingobservation；Observeandrecordthechangesinthemammaryglandsofratsineach group on the 7th， 14th ，and 3Oth day，respectively；ELISA was used to detect the expression of 1L-1β ！ 1L-6 ，and TNF -α in rat serum，and immunohistochemistry（IHC）was used to detect the expresson of ERK， p-ERK ，and RAS proteins in rat breast tissue.ResultTheacinarstructureofthemodelgroupratswasseverelydamaged，withalargeamountofinflammatorycelliflration visible. The mammary gland score was high，and the expression of ERK， p-ERK ，and RAS proteins in mammary gland tissue increased. The serum levels of IL-1β ，IL-6，and TNF- α increased significantly；The Jinhuang Powder group improved the damagetoratbreastissue，reduced inflammatorycells，decreased expresioofERK，p-ERK，andRAS proteins inbreast tissue， decreased serum levels of IL-1β ，IL-6，and TNF-α，and decreased rat breast score.Conclusion Jinhuang Powder can treat granulomatousloularmasitis，duceteexpressionofinflmmatoryfactos，ndaleviateinflammatoryreactios.Itsspecificec anism may be related to the inhibition of the MEK/ERK signaling pathway.

Key Words：Granulomatous Lobular Mastitis；Jinhuang Powder；MEK/ERK Signaling Pathway

肉芽腫性小葉性乳腺炎（granulomatouslobularmastitis，GLM）是以乳腺組織肉芽腫形成為主要表現的慢性乳房炎癥性疾病，主要侵犯乳腺小葉[1]。通常以乳房腫塊伴疼痛、破潰為主要癥狀，臨床表現復雜，反復發作，影響了患者的生活質量及身心健康。

從組織學的角度看，GLM的典型病理特征是非干酪樣小葉肉芽腫，周圍可見中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞聚集。由于肉芽腫由巨噬細胞浸潤和增殖誘導，GLM發病的中心機制被認為是巨噬細胞的活化[2-3]。巨噬細胞活化后可釋放出如白細胞介素 -1β （IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子 -α （ ）等炎性細胞因子。研究[4-5]表明 IL-1β 、IL -6、TNF- ∝ 均參與炎癥疾病的發病機制，高水平的炎癥因子與GLM病情輕重呈正相關。而絲裂原激活蛋白激酶激酶（mitogen-activated proteinkinase kinase，MEK）/細胞外信號調節激酶（extracellularsignal-regulated ki-nase，ERK）信號通路是一條涉及炎癥反應的通路，被認為有能調控上述炎癥因子的轉錄的可能，且該通路與自身免疫性疾病發病機制密切相關[6-7]

GLM歸屬于中醫“粉刺性乳癰”范疇，以“瘀”“熱”為主要病機，因肝郁氣滯、痰凝血瘀、諸邪郁滯，日久化熱損及乳絡而成[8]。金黃散作為中醫外用的經典方，來源于《醫宗金鑒》[9]，具有清熱消腫之功，王曉娜[0]已通過臨床研究證實金黃散治療GLM有明確作用，但其作用機制尚未被證實。基于此，本研究建立了GLM大鼠模型，通過動物實驗研究對比白細胞介素 -1β （IL-1β），白細胞介素-6（IL-6），腫瘤壞死因子 -α （ TNF-α， 0在GLM模型動物血清中的表達情況，以及從MEK/ERK通路出發，檢測與此通路相關的ERK、p-ERK、RAS蛋白在大鼠乳腺組織中的表達情況，探究金黃散治療GLM的影響及機制，為臨床治療肉芽腫性小葉性乳腺炎的提供思路和理論依據。

1材料

1.1動物 8周雌性SD大鼠，30只。購自斯貝福（北京）生物技術有限公司［生產許可證號：SCXK（京）2019－001]；使用許可證號：SYXK（滇）K2020-0006。

1.2藥物及試劑金黃散（哈藥集團中藥三廠，國藥準字Z23020616），蘇木素（賽維爾生物科技有限公司，批號 G1004-100ML ），伊紅染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號G1108）。大鼠IL-1β ELISA 試劑盒、大鼠IL-6ELISA 試劑盒、大鼠 TNF - α ELISA試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，批號分別為ERCO007、ERC0003、ERC102a），過氧化物酶DAB試劑盒（賽維爾生物科技有限公司，批號G1212－200T），ERK1/2蛋白抗體、P-ERK1/2蛋白抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號分別為AF0155、AF1015），RAS蛋白抗體（MCE公司，批號G1212-200T）。1.3儀器電熱恒溫培養箱（紹興市異輝儀器有限公司），切片機（上海實維儀器技術有限公司），倒置顯微鏡（Motic公司），高速低溫離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），蛋白電泳儀（164-5050）（美國BIO-RAD公司），2720ThermalCycler普通PCR儀（美國應用生物系統公司），酶標板自動讀數儀（美國BIO－RAD公司），凝膠成像儀（武漢沃歐特生物科技有限公司）。

2方法

2.1藥物制備及分組給藥藥物制備：取金黃散加入凡士林調至糊狀，傾斜容器以藥膏能夠緩慢流動為宜。使用時將金黃散藥膏外敷于SD大鼠乳腺腫塊上，厚度約 2mm ，無菌紗布覆蓋，醫用膠布固定，每次持續外敷 6h ，每日1次。分組給藥：隨機將SD大鼠分為空白對照組、模型對照組、金黃散組，每組10只。模型對照組予凡士林固定外敷，金黃散組予金黃散按上述使用方法干預治療。2.2動物造模GLM模型大鼠的造模方法參考文獻[8]，將人體新鮮GLM病變組織經細胞粉碎后釋放到勻槳中，取勻槳上清液與弗氏佐劑按1：1體積混勻，以制備油包乳混懸液。將飼養1周后的大鼠麻醉固定于木板上，第4對乳房皮膚處以剃毛機剔除腹部體毛，大鼠置于體視顯微鏡下，充分暴露雙乳，并使用乙醇消毒。模型對照組和金黃散組分別從雙側乳房乳導管處緩慢注人油包乳混懸液包埋（每側 0.2mL ），空白對照組則注入生理鹽水。造模 24h 后取第四對乳腺進行病理切片觀察。2.3肉眼觀察大鼠乳腺變化記錄治療期大鼠體重，按治療時間點（治療后第7天、第14天、第30天）觀察大鼠乳腺炎癥情況：乳房皮溫、乳腺腫脹情況（根據兩乳頭間距判斷）、乳房疼痛情況（根據小鼠痛覺實驗判斷），根據上述情況進行評分。

2.4樣本采集及處理各組大鼠于治療干預第7天、第14天、第30天麻醉大鼠后測量造模組兩側種植部位紅腫包塊大小，并通過心臟取血，取樣后室溫靜置血樣室 ^2h 以上，離心（ 4^°C ， 3000rpm 10min ）收集血清，于 -80^°C 凍存，以便后期檢測。于治療第30天另取第四對乳腺組織，使用多聚甲醛溶液浸泡固定，依次進行脫水、透明后將組織放入石蠟中浸泡滲透，經石蠟包埋后，制作切片，經HE染色后使用顯微鏡觀察各組乳腺組織病理變化。

2.5炎癥因子檢測使用中2.4血清樣本，離心收集上清液，按照ELISA試劑盒說明操作分別檢測各組乳腺組織中炎癥因子 IL-1β 、IL-6和 TNF-α 和水平。

2.6免疫組化檢測ERK、p-ERK、RAS的表達使用2.4中乳腺組織切片，將組織片放入 64^°C 恒溫箱中烘烤1h，進行脫蠟、使用酒精水化后用PBS沖洗、抗原修復、滅活內源性過氧化物酶活性后用5% 牛血清白蛋白 V37^°C 孵育 30min 封閉。根據抗體說明書選擇合適的稀釋比例用 2% 牛血清白蛋白V稀釋一抗，將稀釋好后的一抗滴加到玻片上，放到4^°C 冰箱中過夜。過夜后的玻片置入 37^°C 溫箱中復溫 30min ，PBS沖洗3次，每次 5min ，行增強反應后滴加 100μL 或適量的增強酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物，置人 37^°C 溫箱中孵育 20min ，染色封片，全片掃描檢測各組ERK、p-ERK、RAS蛋白。

2.7統計學分析本研究用SPSS29.0建立數據庫，進行數據分析，實驗數據符合正態分布以均數加減標準差（ ）描述表示，以 Plt;0.05 為差異具有統計學意義。多組間比較采用ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

3結果

3.1金黃散對GLM大鼠體重及乳房情況的影響如圖1所示，三組對比，大鼠體重在各時間點無明顯差異。三組大鼠第4對乳房組織皮溫在治療第0天、第7天、第14天、第30天無明顯差異，空白對照組大鼠第4對乳房組織皮溫在上述時間點無明顯波動；模型對照組在治療第7天后皮溫達到峰值后逐漸緩慢降低；金黃散組在治療第14天后皮溫迅速降低，第30天時皮溫與空白對照組基本一致。乳房腫脹情況，模型對照組治療第7天后腫脹緩慢下降，第14天后腫脹程度呈上升趨勢，后評分逐漸高于金黃散組；金黃散組大鼠在干預治療后隨時間逐漸下降。依據大鼠痛覺評分可以看出，金黃散組在治療后評分呈現下降趨勢，而模型對照組呈上升趨勢，且各時間點模型對照組痛覺評分均高于金黃散組。對于大鼠乳房腫塊情況，治療第7天模型組與金黃散組均有乳房腫塊，但模型對照組腫塊較大；金黃散組大鼠治療第14天右側乳房腫塊消退，在治療第30天左側乳房腫塊消退。

3.2金黃散對GLM大鼠乳腺組織的影響各組大鼠乳房組織HE染色結果如圖2所示，空白對照組中可見少量炎性細胞浸潤，乳腺組織結構完好；與空白對照組相比，模型對照組中，乳腺小葉邊界不清，組織細胞排列紊亂，腺泡結構破壞嚴重，視野內可見大量炎性細胞，組織纖維化加重；與模型對照組相比，金黃散組大鼠乳腺組織中炎性細胞浸潤減少，組織受損程度明顯改善，腺泡結構破壞程度下降。

3.3金黃散對GLM大鼠血清中 IL-1β 、IL-6、TNF-α的影響使用ELISA檢測大鼠血清中的IL^-1β 、IL-6、TNF-α表達水平，結果顯示：干預治療第7天時，與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清的 IL-1β 、IL-6、TNF- ∝ 的表達明顯升高，兩組對比差異具有統計學意義（ Plt;0.05） ，表明乳腺炎模型會導致 IL-1β 、IL-6、 TNF-α 表達升高，提示造模成功；與模型對照組相比，金黃散組 IL-1β 、IL-6的表達水平均有降低趨勢，但差異無統計學意義（ Pgt;0.05） ； TNF-α 表達水平明顯降低，差異具有統計學意義（ Plt;0.05 ）。干預治療第14天時，與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清的IL-1β 、IL-6、TNF- ∝ 的表達升高，兩組對比差異具有統計學意義（ Plt;0.05 ；與GLM模型對照組相比，金黃散組大鼠血清中 IL-1β 、IL-6、 TNF-α 的表達持續降低，兩組對比 IL-1β ！ TNF-α 具有顯著統計學意義（ Plt;0.01 ），IL-6水平具有統計學意義（ P lt;0.05 。干預治療第30天時，與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清的 IL-1β 、IL-6、TNF-α的表達仍然持續升高，兩組對比差異具有統計學意義（ P lt;0.05 ）；與模型對照組相比，金黃散組大鼠血清中IL-1β、IL-6、 TNF-α 的表達有下降趨勢，兩組對比差異具有統計學意義（ ?Plt;0.05 。與空白對照組相比，在干預的第7天、第14天、第30天，模型對照組大鼠 IL-1β 、IL-6、 TNF-α 表達量呈現逐漸增加的趨勢；與模型對照組相比，金黃散組 IL-1β 、IL-6、 TNF-α 表達量呈現逐漸減少的趨勢，說明金黃散外敷干預后可以抑制炎性因子的表達，從而起到抑制炎性反應的作用。見表1～表3。

3.4金黃散對GLM模型大鼠乳腺組織ERK信號通路中ERK、p-ERK、RAS蛋白表達的影響圖3至圖5所示為各組大鼠干預第30天后乳腺組織免疫組化結果（其中黑色點狀為細胞核，灰色點狀為ERK、p-ERK、RAS目的蛋白），蛋白組間對比統計學差異如圖6所示。從圖3～圖5中可以看出，空白組大鼠乳腺組織結構清晰，而模型對照組乳腺組織結構紊亂。統計結果顯示：模型對照組與空白對照組比較，大鼠乳腺組織中ERK蛋白呈現高表達趨勢，但兩組間差異無統計學意義；金黃散組與模型組比較，ERK蛋白均呈現低表達，差異無統計學意義。與空白對照組比較，模型對照組P-ERK蛋白呈現高表達，差異具有顯著統計學意義（ Plt;0.01 ）；與模型對照組比較，金黃散組P-ERK蛋白表達量減少，差異具有統計學意義（ Plt; 0.05）。與空白對照組比較，模型對照組RAS呈現高表達，差異具有顯著統計學意義（ Plt;0.01 ；與GLM模型組比較，金黃散組的RAS蛋白呈現低表達，差異無統計學意義（ Pgt;0.05 ）。構建肉芽腫性小葉性乳腺炎后乳腺組織中的RAS、ERK、p-ERK蛋白表達升高，金黃散干預后與模型對照組相比，乳腺組織中的RAS、ERK、p-ERK表達降低。

4討論

肉芽腫性小葉性乳腺炎在中醫古籍中未有明確記載，古書中將其歸于“乳癰”之范疇。因其臨床癥狀與漿細胞性乳腺炎相似，歸屬于“粉刺性乳癰”，以和“乳癰”即“急性乳腺炎”相鑒別[1]。中醫認為本病多因情志不遂，肝氣郁結、痰凝血瘀，諸邪郁滯，乳絡不通，聚集成塊，日久化熱，熱盛肉腐所致。中醫治療以內治和外治相結合，分期論治，準確辨證療效甚佳。

金黃散來源于《醫宗金鑒》，因其藥物研磨成粉末后顏色金黃，故命名為金黃散，由白芷、姜黃、南星、天花粉以及黃柏等組成，具有清熱解毒、消腫散結、活血止痛之功，是粉刺性乳癰的常用外治方。將金黃散調制成膏狀后外敷于腫塊處能使藥物經皮膚黏膜充分滲透及吸收，使藥物直達病所[9。常用于外科瘡瘍腫毒之陽熱證，如下肢丹毒[9]、急性乳腺炎[12]、腮腺炎[13]及皮膚軟組織感染[14]等多種炎癥性疾病，通過臨床研究已被證實有降低炎癥細胞的功效，可抑制炎癥，臨床用其治療GLM，療效確切[10]。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是生物體內重要的信號轉導通路[15]，在受到炎癥因子、生長激素等刺激后，MARK信號通路被激活，參與調控機體炎癥，在機體炎癥反應過程中起重要作用。與此同時，MEK/ERK信號通路已被證實是MAPKs經典的亞族信號通路[16]。袁蓓[17]發現當細胞受到IL-1β、IL-6、TNF- ∝ 等炎癥因子的刺激時，可使RAS蛋白被激活。Ras作為MEK/ERK通路的上游因子，其被激活后能夠促使下游MEK經磷酸化修飾轉入細胞核，而經磷酸化修飾的MEK（p-MEK）可激活ERK基因，并使ERK蛋白磷酸化，進一步促使p-ERK調控下游炎癥因子表達，影響細胞增殖凋亡，促進自噬并最終調控炎癥水平[18-19]。譚利寬[2]通過對肉芽腫性乳腺炎的臨床研究證明，GLM的發作和高水平炎癥因子（IL-1β 、IL-6、TNF-α）密切相關。因此，本研究通過建立GLM大鼠模型，檢驗金黃散是否可以通過影響MEK/ERK信號通路中關鍵站點的蛋白表達水平，從而影響炎癥因子（IL-1β、IL-6和TNF-∝ ）水平。

本研究結果顯示，模型對照組與空白對照組相比，大鼠乳腺組織中p-ERK、RAS蛋白呈高表達，ERK蛋白表達呈上升趨勢。模型對照組炎癥細胞因子 IL-1β 、IL-6、TNF- ∝ 隨時間的增加表達量逐漸增加，證實GLM的發病與MER/ERK信號通路的激活有相關性。應用金黃散對GLM大鼠進行干預治療后，觀察到金黃散組大鼠乳腺組織中ERK、p-ERK、RAS蛋白與模型對照組相比有下降趨勢，大鼠血清中的炎性細胞 IL-1β 、IL-6、TNF- ∝ 含量隨時間的增加表達量逐漸減少。且大鼠乳腺腫塊逐漸變小消散，乳腺痛覺評分降低，乳腺炎癥情況得到控制。說明金黃散治療GLM發揮了有效作用，也證明了金黃散能夠調節MEK/ERK信號通路中相關蛋白及炎癥因子的表達，抑制炎癥反應，可為臨床應用提供理論依據。

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