黃芪甲苷對顱內動脈瘤大鼠動脈血管內皮組織損傷的影響

中圖分類號R965；R285 文獻標志碼A 文章編號 1001-0408（2025）13-1617-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.13.11

Effectsofastragaloside IV onarterial endothelial tissuedamage inratswith intracranial aneurysm

CAI Qiang'，LIU Liuqing2，TANG Jiayul（1. Interventional Medical Center，Hunan Second People’s Hospital， Changsha ，China;2.Dept.of Neurology，Hunan Second People's Hospital，Changsha ，China）

ABSTRACTOBJECTIVEToinvestigatetheefectofastragalosideV（AST）ontheinjuryofarterialendothelialtisse inrats with intracranial aneurysms （IA），and to explore its mechanism of action based on the nuclear factor κB （NF- κB ）/nucleotidebinding domain leucine-rich repeat and pyrin domain-containing protein 3（NLRP3）signaling pathway.METHODS Rats were dividedito Shamgroup（intragastricadministrationandintraperitoneal injectionofthesamevolumeofnormalsaline），IAgroup （intragastricdministrationandintraperitonealinjectionofthesamevolumeofomalsaine），ASTlow-dosegroup（AST-Lgroup， intragastric administration of 40mg/kg AST），AST high-dose group（AST-H group，intragastric administration of 80mg/kg AST）， AST-H+HY-N2485 group [intragastric administration of 80mg/kg AST and intraperitoneal injection of 25mg/kg HY-N2485 （activator of NF- κB， NLRP3 signaling pathway）]. They were given relevant medicine，once a day，for 8 consecutive weeks. After last medication，the levels of inflammatory factors [serum tumor necrosis factor- ∝ （TNF- ∝ ），interleukin-18（IL-18），IL-6] and vascular endothelial growthfactor（VEGF）andendothelin（ET）were detected；themorphologyof IA wasobserved；the expreionsofvonWillebrandfactor（vWF），vascularcelladhesionmolecule-1（VCAM-1），endothelialnitricoxidesynthase （eNOS），andNF-KB/NLRP3 pathwayrelated proteinsin vasculartisse werealsodetermined.RESULTS Comparedwith the Shamgroup，thebasilararterialringofratsintheIAgrouphadoviousprotrusions，andthearterialvascularendothelialcelswere significantlydamaged.Thelevelsofinflammatoryfactors，VEGFandETinserum，aswellastheexpressionlevelsofvWF， VCAM-1 and NLRP3 proteins and the phosphorylation level of NF κB protein in vascular tissues were increased significantly （ Plt; 0.05）.Aneurysms and ruptures of the internal elastic layer were significantly increased （ ?Plt;0.05 ），while the expression level of eNOS protein was significantly decreased （ ΔPlt;0.05 ）. Compared with IA group，the morphology of IA and the levels of above indexes were all improved significantly in AST-L and AST-H groups （ （Plt;0.05 ），and the improvement in the AST-H group was more significant than that in the AST-L group ）；HY-N2485 could attenuate the improvement effect of AST on vascular endothelial tissue damage in IA rats ?Plt;0.05 ）.CONCLUSIONS AST may inhibit the expression of inflammatory factors，alleviate inflammation and vascular endothelial tissue damage in IA rats by inhibiting NF-kB/NLRP3 signaling pathway， therebyinhibiting the formation ofIA.

KEYWORDSastragaloside IV；intracranialaneurysm；NFkB/NLRP3 signaling pathway；injury to vascular endothelial tissue；inflammation

顱內動脈瘤（intracranialaneurysm，IA）是指腦動脈內腔的局限性異常擴大，造成動脈壁的一種瘤狀突出，是一種嚴重的腦血管疾病，具有潛在的破裂風險，進而引起蛛網膜下腔出血，具有較高的發病率和病死率，嚴重威脅患者生命健康。目前臨床尚無能夠穩定IA病情并預防其破裂的療法，一般采用保守治療，只有對動脈瘤破裂風險較高的患者（取決于動脈瘤大小及所處位置）才會進行閉塞手術，但會引起多種并發癥，且復發率較高2。IA發生機制復雜，包括內皮組織損傷、血管壁缺失、炎癥及細胞凋亡等[。因此，開發新的藥物以抑制瘤體形成、降低血管內皮組織損傷對IA的治療具有重要意義。

黃芪甲苷（astragaloside，AST）是從中藥黃芪中提取的活性成分，具有增強免疫、抗炎、抗凋亡、治療心血管疾病的功效4。研究顯示，AST可減輕氧化應激引起的血管內皮細胞損傷，促進血管形成，改善細胞骨架破壞；此外，AST還可減輕肺動脈高壓大鼠的炎癥，促進其肺動脈內皮細胞增殖[5-]。因此，筆者推測AST對血管內皮細胞損傷具有一定改善作用。IA的發生發展與炎癥密切相關，而核因子 κB （nuclear factor- σ_κB ，NF- σ_?κB ）/核苷酸結合結構域富含亮氨酸重復序列和含熱蛋白結構域受體3（nucleotide-binding domain leucine-rich repeat andpyrindomain-containingreceptor3，NLRP3）作為一條炎癥相關信號通路，被激活后可促進炎癥因子釋放，進而促進炎癥損傷[]。研究顯示，降低NF- σ_κB 表達水平可抑制IA形成，減輕氧化應激?；诖?，本研究擬對AST改善IA大鼠動脈血管內皮組織損傷的作用進行考察，并基于NF-κB/NLRP3信號通路探討其可能的機制，為AST的臨床應用提供參考。

1材料

1.1主要儀器

本研究所用的主要儀器有：HD-SY96B型酶標儀（山東霍爾德電子科技有限公司）CX43型顯微鏡[門季（上海）生物科技有限公司]、LD-ZQP-86型組織切片機（山東海卓爾光電科技有限公司）、165-8001型小型垂直電泳儀（濟南歐萊博技術有限公司）。

1.2主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有：AST對照品（云南四吉生物有限公司，批號84687-43-4，純度 98% ），NF-KB/NLRP3信號通路激活劑HY-N2485（美國MCE公司，批號33626-08-3，純度 99.48% ），腫瘤壞死因子 ∝ （tumornecrosis factor- α TNF-α ）、白細胞介素18（interleukin-18，IL-18）、IL-6、血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、內皮肽（endothelin，ET）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（廣州奧瑞達生物科技有限公司，批號分別為ARD11895、ARD801323、 ARD801271、SLB80076、SLB40019），彈性纖維染色液ElasticavanGieson、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑和BCA試劑盒（上海尚寶生物科技有限公司，批號分別為R23261、T15877、H26475），血管性血友病因子（vonWillebrandfactor，vWF）、血管細胞黏附分子1（vascularcell adhesionmolecule-1，VCAM-1）、內皮型一氧化氮合酶（endothelialnitricoxide synthase，eNOS）、磷酸化NF- κB （p-NF- ?κB ）、NF- σ_κB 、NLRP3和 β. -肌動蛋白（ β_β -actin）一抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulinG，IgG）（英國Ab-cam公司，批號分別為ab174290、ab181315、ab300071、ab288751、ab239882、ab270449、ab179467、ab302644）。

1.3實驗動物

本研究所用動物為SPF級雄性SD大鼠，共60只，體重 210～230g ，購自中山大學實驗動物中心，生產許可證號為SCXK（粵）2024-0072。購入后，將大鼠飼養在溫度（ 22±2 ） °C 、相對濕度 （60±5）% 、光照時間為 12h （7：00-19：00） 的動物房內，飼養期間使其自由攝食和飲水。本研究動物實驗已獲本院倫理委員會批準（編號為202404005）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

選取50只大鼠建立IA模型：用 3% 戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，剃去大鼠背部毛發并消毒后，在其背部雙側肋緣處作 1.5～2cm 縱向切口，分離皮下和肌肉層，至腎臟暴露出來，分離腎動脈和靜脈，用0-3絲線結扎雙側腎動脈后支，然后將腎臟復位，縫合傷口；7d后，在手術顯微鏡下用絲線結扎其左頸總動脈，并用 2% 鹽水替代飲用水3個月。造模成功標志：大鼠輕度偏癱、顱內壓和體溫升高、眼神經麻痹。造模成功的大鼠共有43只，取其中40只隨機分為IA組、AST低劑量組（AST-L組）AST高劑量組（AST-H組）和AST-H+HY-N2485組（聯用NF-KB/NLRP3信號通路激活劑HY-N2485），每組10只。將剩余10只大鼠作為假手術組（Sham組），背部切口后即縫合。

AST-L組和AST-H組大鼠分別灌胃 40，80mg/kg 的AST，AST-H+HY-N2485組大鼠灌胃 80mg/kg 的AST并腹腔注射 25mg/kg 的 HY-N2485^[10] ，Sham組和IA組大鼠灌胃并腹腔注射等體積生理鹽水；每天給藥1次，連續8周。

2.2 樣本采集

干預結束后 12h ，將大鼠麻醉后腹主動脈取血3mL，將新鮮血液置于離心機中，以 3000r/min 離心10min，取上清液保存備測。取血后，以頸椎脫白法處死大鼠，開顱取腦，剝離右嗅動脈和腦前動脈分叉，備測；另取IA血管組織，冷凍待測。

2.3 IA形態學評估

將\"2.2\"項下右嗅動脈和腦前動脈分叉冷凍、切片（厚度 5μm ），用 4^°C 預冷的丙酮固定 8min ，以ElasticavanGieson染色，使用BZ軟件分析動脈瘤大小、內部彈性層破裂的大小和壁厚比。動脈瘤大小 （最大內腔的最大高度 + 最大寬度）/2;壁厚比 °leddash 動脈瘤壁的最小寬度/正常動脈壁的平均厚度。

2.4血管組織形態觀察

采用HE染色法觀察。取“2.2\"項下IA血管組織，置于 4% 多聚甲醛中固定 8h ，脫水后常規制備石蠟切片（厚度 3μm ），烤片后脫蠟，然后常規行HE染色，封片，在顯微鏡下觀察血管組織形態。

2.5 血清中炎癥因子和VEGF、ET水平檢測

取\"2.2\"項下血清 50μL ，采用ELISA法檢測血清中炎癥因子（TNF- ∝ IL-18、IL-6）和VEGF、ET水平，具體操作嚴格按照相應試劑盒說明書進行。

2.6血管組織中vWFVCAM-1、eNOS及NF ??κB. /NLRP3信號通路相關蛋白表達檢測

采用Westernblot法檢測。取“2.2”項下IA血管組織，提取組織中總蛋白，以BCA法分析蛋白濃度，采用100^°C 熱水浴處理 5min ，電泳 （100V）60min 分離蛋白，轉至PVDF膜（電流 400mA ，時間 100min ），以 5% 脫脂奶粉封閉2h;加入vWF、VCAM-1、eNOS、p-NF- κB 、NF-κB NLRP3和 β. -actin一抗（稀釋比例均為1：5000）， 4^°C 下孵育過夜；以磷酸鹽緩沖液洗膜，加入二抗（稀釋比例1：1500），室溫下孵育 2h ；以ECL顯影，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值。以vWF、VCAM-1、eNOS、NLRP3蛋白條帶與內參蛋白（ β -actin）條帶灰度值的比值表示vWF、VCAM-1、eNOS、NLRP3蛋白的相對表達水平，以p-NF- σ_κB 蛋白條帶與NF- κB 蛋白條帶灰度值的比值表示NF- ??κB 蛋白的磷酸化水平。

2.7 統計學方法

使用GraphPadPrism8.0.1軟件對數據進行統計分析。計量資料以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK ?q 檢驗。檢驗水準α=0.05 。

3結果

3.1AST對大鼠IA形態學的影響

Sham組大鼠動脈形態正常；與Sham組比較，IA組大鼠顱底動脈環有明顯突起，動脈瘤、內部彈性層破裂均增大（ （Plt;0.05 ）;與IA組比較，AST-L組和AST-H組大鼠顱底動脈環凸起縮小，動脈瘤、內部彈性層破裂均縮小 （Plt;0.05） ，壁厚比升高 （Plt;0.05） ，且AST-H組大鼠的上述指標變化均較AST-L組更明顯（ （Plt;0.05） ；與AST-H組比較， _{AST-H+HY-N2485} 組大鼠動脈瘤、內部彈性層破裂均增大 （Plt;0.05） ，壁厚比降低 （Plt;0.05） 。結果見圖1（圖1中僅展示IA組、AST-H組、AST-H+HY-N2485組的結果，完整圖片可掃描本文首頁二維碼，進入“增強出版\"頁面查看附圖1）表1。

3.2 AST對大鼠IA血管形態的影響

Sham組大鼠血管組織形態正常；IA組大鼠動脈血管內皮細胞出現空泡樣變性，平滑肌細胞厚度和動脈壁厚度變薄，彈性纖維斷裂，伴有大量炎癥細胞浸潤；AST-L組和AST-H組大鼠血管內皮組織損傷程度有明顯減輕；AST-H+HY-N2485組大鼠相較于AST-H組血管內皮組織損傷程度明顯加重。結果見圖2（圖2中僅展示IA組、AST-H組、AST-H+HY-N2485組的結果，完整圖片可掃描本文首頁二維碼，進人“增強出版”頁面查看附圖2）。

3.3AST對IA大鼠血清中炎癥因子水平的影響

與Sham組比較，IA組大鼠血清中TNF- ∝ 、IL-18和IL-6水平均顯著升高 （Plt;0.05） ；與IA組比較，AST-L組、AST-H組大鼠血清中TNF- _?α?IL-18 和IL-6水平均顯著降低（ （Plt;0.05） ，且AST-H組大鼠血清中上述指標水平較AST-L組降低得更明顯 （Plt;0.05） ；與AST-H組比較，AST-H+HY-N2485組大鼠血清中TNF- ?α，IL-18 和IL-6水平均顯著升高（ （Plt;0.05 ）。結果見表2。

3.4AST對IA大鼠血清中VEGF和ET水平的影響

與Sham組比較，IA組大鼠血清中VEGF、ET水平均顯著升高 （Plt;0.05） ；與IA組比較，AST-L組、AST-H組大鼠血清中VEGF、ET水平均顯著降低 （Plt;0.05 ，且AST-H組大鼠血清中上述指標水平較AST-L組降低得更明顯 （Plt;0.05） ；與AST-H組比較，AST-H+HY-N2485組大鼠血清中VEGF、ET水平均顯著升高 （Plt;0.05 。結果見表3。

3.5AST對IA大鼠血管組織中vWF、VCAM-1、eNOS及NF-kB/NLRP3信號通路相關蛋白表達的影響

與Sham組比較，IA組大鼠血管組織中vWF、VCAM-1、NLRP3蛋白表達水平和NF- σ_?κB 蛋白磷酸化水平均顯著升高（ Plt;0.05） ，eNOS蛋白表達水平顯著降低L （Plt;0.05） ；與IA組比較，AST-L組、AST-H組大鼠血管組織中vWF、VCAM-1、NLRP3蛋白表達水平及NF- ?κB 蛋白磷酸化水平均顯著降低（ （Plt;0.05 ，eNOS蛋白表達水平均顯著升高 ?lt;0.05 ，且AST-H組大鼠血管組織中上述指標水平較AST-L組改善得更明顯 （Plt;0.05） ；與AST-H組比較，AST-H+HY-N2485組大鼠血管組織中vWF、VCAM-1、NLRP3蛋白表達水平及 NF-κB 蛋白磷酸化水平均顯著升高（ （Plt;0.05） ，eNOS蛋白表達水平顯著降低 ?Plt;0.05 ）。結果見圖3、表4。

4討論

炎癥可促進IA的發生發展，炎癥因子大量釋放可造成血管內皮細胞炎性損傷，破壞血管壁的完整性，進而引起血管壁力學性能下降，促進動脈瘤形成；同時炎癥還會增加血管內皮細胞的通透性，使脂質沉積在血管壁，進一步促進動脈瘤形成[12。本研究結果顯示，IA組大鼠血清中炎癥因子TNF- σ?α∝ 、IL-18、IL-6的水平顯著高于Sham組；而AST可降低模型大鼠血清中炎癥因子水平，減輕炎性損傷。VEGF和ET為血管內皮細胞損傷標志物。其中，VEGF可促進血管內皮細胞增殖、遷移，增加血管通透性；血管內皮細胞損傷時可誘導VEGF過表達。ET具有收縮血管的作用，可導致血管阻力增加、血壓升高[]。本研究結果顯示，IA組大鼠血清中VEGF、ET水平較Sham組明顯升高，提示IA大鼠血管內皮組織明顯受損；而AST可顯著降低模型大鼠血清中VEGF、ET水平，減輕血管內皮組織損傷，且高劑量AST的作用較低劑量AST更明顯。

vWF是一種由內皮細胞生成并分泌的糖蛋白，進入血液循環后，會促使血小板之間相互黏附和聚集，進而引發血栓形成，可作為評估血管病變的關鍵標志物[14]。eNOS能夠催化產生一氧化氮，而一氧化氮釋放到血管中可以使血管平滑肌舒張，從而調節血壓;eNOS的表達水平下降時，一氧化氮的生成減少，導致活性氧大量積累，誘導血管內皮細胞受損，影響血管的正常生理功能[]。VCAM-1為一種血管細胞黏附分子，可介導白細胞黏附和炎癥反應，破壞內皮細胞連接的完整性，增加血管通透性，促進血漿蛋白、脂質物質滲出到血管壁內皮下，促進脂質沉積和血栓形成，加速血管病變[]。本研究結果顯示，AST可下調模型大鼠血管組織中vWF和VCAM-1的蛋白表達，上調eNOS蛋白表達。進一步通過ElasticavanGieson和HE染色發現，AST可減小模型大鼠顱底動脈環突起，減輕動脈血管內皮細胞損傷，提示AST可減少模型大鼠的IA形成，減輕炎癥和血管內皮組織損傷。

NF-kB/NLRP3信號通路是一條炎癥通路，細胞受到損傷刺激時可激活NF- ?×B ，誘導其進入細胞核，進而啟動其靶基因NLRP3轉錄和蛋白表達，導致炎癥因子合成和釋放，促進炎性疾病發生[]。 Yu 等[1研究表明，抑制NF- κB 信號通路可降低IA大鼠TNF- σ?α∝ 、IL-6、單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoatractant protein-1，MCP-1）水平，抑制IA形成。Jiang等[9研究表明，抑制NF- σ_κB 信號通路可降低IA小鼠血壓及TNF- α_?α∝ 、IL-1β、IL-6、MCP-1水平，減輕血管內皮組織損傷，改善IA。本研究結果顯示，IA組大鼠血管組織中NF- κB 蛋白磷酸化水平和NLRP3蛋白表達水平均顯著高于Sham組，提示NF- ??κB/? NLRP3信號通路被激活；而AST可降低模型大鼠血管組織中NF- κB 蛋白磷酸化水平和NLRP3蛋白表達水平，抑制該信號通路激活，進而降低炎癥因子TNF- σ?α∝ IL-18和IL-6水平，減輕血管內皮組織損傷，研究結果與上述文獻報道一致。為進一步驗證AST改善IA是否與調控NF-KB/NLRP3信號通路有關，本研究在AST給藥的同時使用NF- κB， NLRP3信號通路激活劑HY-N2485進行干預，結果顯示HY-N2485可減輕AST對IA大鼠血管內皮組織損傷的改善作用。這提示AST減輕IA大鼠血管內皮組織損傷可能與抑制NF- κB/ NLRP3信號通路有關。

綜上所述，AST可能通過抑制NF-kB/NLRP3信號通路來抑制炎癥因子表達，減輕炎癥和血管內皮組織損傷，從而抑制IA形成。但考慮到AST在大鼠體內可能還存在其他作用通路，其具體作用機制還需后續進一步探究。

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（收稿日期：2025-03-14 修回日期：2025-05-31） （編輯：林靜）