高效液相色譜法測(cè)定硝基呋喃類藥物代謝物及其在對(duì)蝦體內(nèi)的代謝

辛少平，鄧建朝，楊賢慶，岑劍偉，魏 涯，郝淑賢，李來好,*

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

高效液相色譜法測(cè)定硝基呋喃類藥物代謝物及其在對(duì)蝦體內(nèi)的代謝

辛少平1,2，鄧建朝1，楊賢慶1，岑劍偉1，魏 涯1，郝淑賢1，李來好1,*

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

建立高效液相色譜法測(cè)定對(duì)蝦中胺基脲（semicarbazide，SEM）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲（1-aminohydantoin，AHD）、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxazolidone，AMOZ）和3-氨基-2-惡唑基酮（3-amino-2-oxazolidone，AOZ）4 種硝基呋喃類藥物代謝物。采用含100g/L三氯乙酸的甲醇-水（50∶50，V/V）溶液提取，鄰氯苯甲醛衍生，經(jīng)乙酸乙酯萃取、異辛烷凈化，以0.05 mol/L乙酸銨-乙腈（30∶70，V/V）為流動(dòng)相，反相高效液相色譜分析，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，4 種待測(cè)物在0.1～50 nmol/mL 濃度范圍內(nèi)線性良好，檢出限分別為SEM 0.75 ?g/kg、AHD 1.2 ?g/kg、AMOZ 2.0 ?g/kg、AOZ 1.0 ?g/kg。停藥后4 種硝基呋喃類藥物代謝物在對(duì)蝦肌肉內(nèi)富集最高含量分別為51.5、35.8、79.3 μg/kg和127 μg/kg，代謝物殘留低于0.5 μg/kg所需代謝時(shí)間為SEM 21d、AHD 15d、AMOZ 17d和AOZ 23d。

高效液相色譜；硝基呋喃代謝產(chǎn)物；代謝規(guī)律；對(duì)蝦

硝基呋喃類藥物是一類被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖中防治細(xì)菌感染疾病的人工合成廣譜抗生素。藥物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮分別迅速代謝為胺基脲（semicarbazide，SEM）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲（1-aminohydantoin，AHD）、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxazolidone，AMOZ）和3-氨基-2-惡唑基酮（3-amino-2-oxazolidone，AOZ），這些代謝物以與蛋白結(jié)合的形式穩(wěn)定存在。硝基呋喃類藥物有一定的毒性，尤其代謝物被證實(shí)具有致畸、致突變和致癌作用，而引起高度重視[1-2]。雖然世界各國已嚴(yán)令禁止該類藥物在食源性動(dòng)物中的使用，但硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留仍不斷被檢出[3-4]。此類藥物殘留檢測(cè)方法主要有免疫學(xué)法[5-7]、高效液相色譜法[8-10]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[11-15]等。免疫學(xué)法包括酶聯(lián)免疫和免疫層析法，靈敏感度高、特異性強(qiáng)，但難免出現(xiàn)假陽性結(jié)果，目前酶聯(lián)免疫不能同時(shí)檢測(cè)多種代謝物，膠體金免疫層析法雖可實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)但尚不成熟[16]。高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法利用色譜條件將目標(biāo)物與干擾物分開再檢測(cè)，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛采用。中國農(nóng)業(yè)部于2006年和2008年相繼頒布了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和高效液相色譜-紫外檢測(cè)法作為食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法[8,11-12]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用作為一種檢測(cè)和確證手段，被廣泛認(rèn)可，但因其設(shè)備昂貴，檢測(cè)成本高，而難以被大規(guī)模推廣使用。高效液相色譜法設(shè)備價(jià)格和檢測(cè)成本相對(duì)較低，國內(nèi)大部分實(shí)驗(yàn)室配備有高效液相色譜儀，但標(biāo)準(zhǔn)方法中樣品前處理復(fù)雜，步驟繁瑣，給實(shí)際操作帶來不便，有必要進(jìn)行改進(jìn)。

本實(shí)驗(yàn)以對(duì)蝦為對(duì)象，研究SEM、AHD、AMOZ、AOZ 4種硝基呋喃類藥物代謝物在水產(chǎn)品中殘留量的測(cè)定，建立以100g/L三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-甲醇溶液提取、乙酸乙酯萃取純化、高效液相色譜-紫外法測(cè)定的方法，簡化了操作過程。在此基礎(chǔ)上測(cè)定了藥物在對(duì)蝦體內(nèi)的代謝規(guī)律，豐富了硝基呋喃類藥物代謝研究的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei），采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳大鵬灣養(yǎng)殖基地。

呋喃西林 南昌白云藥業(yè)有限公司；呋喃妥因 蘇州瑜創(chuàng)生物科技有限公司；呋喃唑酮 河南科牧動(dòng)物藥業(yè)有限公司；呋喃它酮 濟(jì)南百納獸藥原料有限公司；呋喃西林代謝物SEM、呋喃妥因代謝物AHD 德國DR公司；呋喃唑酮代謝物AOZ、呋喃它酮代謝物AMOZ 德國Witega公司；乙腈（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；鄰氯苯甲醛、冰醋酸、甲醇、TCA、乙酸乙酯、磷酸二氫銨均分析純；實(shí)驗(yàn)用水均符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》一級(jí)水的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜（配有二極管陣列檢測(cè)器） 美國Agilent公司；自動(dòng)平衡離心機(jī) 湖南湘儀儀器公司；分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；超聲波清洗儀德國Elma公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 試劑的配制

提取液：含有100g/L TCA的甲醇-水（50∶50，V/V）溶液；衍生化試劑：取1 mL鄰氯苯甲醛，溶解于5 mL冰乙酸和20 mL甲醇混合液中；10 mol/L NaOH溶液：稱取40 g氫氧化鈉固體，溶于蒸餾水，定容至100 mL；5 mol/L乙酸銨緩沖液：稱取38.5 g乙酸銨溶于蒸餾水，定容至100 mL；50 mmol/L磷酸二氫銨溶液：稱取5.75 g磷酸二氫銨溶于超純水中，定容至1 L，過0.22 ?m濾膜；標(biāo)準(zhǔn)貯備液（100 nmol/mL）：稱取75.1 mg SEM、115.0 mg AHD、102.1 mg AOZ、201.2 mg AMOZ，溶于30%乙腈-水溶液，定容至10 mL，4 ℃保存。

1.3.2 衍生條件的優(yōu)化

酸堿性對(duì)衍生的影響：分別將代謝物溶于酸性甲醇-水溶液（含TCA）和中性的甲醇-水中衍生30min，測(cè)定衍生產(chǎn)物含量。

溫度對(duì)衍生的影響：將代謝物溶于酸性甲醇-水溶液中，分別于37、50 ℃和60 ℃水浴條件下衍生，測(cè)定衍生產(chǎn)物含量。

1.3.3 樣品前處理的優(yōu)化

將用藥1 d后的南美白對(duì)蝦肌肉勻漿為樣品，分別考察不同提取方式（水浴振蕩法（150 r/min、37 ℃）、水浴超聲法（37℃、35 kHz、強(qiáng)度100%））、不同質(zhì)量濃度TCA的提取液（20、50、100、150 g/L）、衍生提取時(shí)間（2、4、8、12、16、20、24 h），以及凈化時(shí)不同液相萃取試劑（二氯甲烷、乙酸乙酯）對(duì)結(jié)果的影響。具體測(cè)定過程如下：

稱取試樣（5.00 g）置于具塞離心管中，加提取液（15 mL），均質(zhì)，用5 mL提取液洗滌刀頭。加入1 mL衍生化試劑，密封，于控溫水浴搖床振蕩衍生提取（180 r/min）。之后取出，4 000 r/min離心5 min，取上清液；沉淀再加入提取液（10 mL）懸浮洗滌，離心、合并上清液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗。加一定量10 mol/L氫氧化鈉以及5 mL乙酸銨緩沖液調(diào)節(jié)并維持pH值中性后，加50 mL液相萃取劑充分振蕩萃取，分層后棄去水層。再加入一半體積蒸餾水洗滌萃取劑層。收集萃取液于45 ℃水浴條件下減壓蒸發(fā)至近干。加0.5 mL 30%的乙腈-水溶液和1 mL異辛烷溶解殘?jiān)x心分層后，取下層液體，過0.22 ?m濾膜，注入高效液相色譜儀器測(cè)定。

1.3.4 色譜條件的優(yōu)化

比較不同檢測(cè)波長和流動(dòng)相對(duì)色譜分離檢測(cè)的影響，其他色譜條件不變：色譜柱Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 ?L；檢測(cè)波長：280～300 nm；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸銨-乙腈（30∶70，V/V），用氨水或乙酸調(diào)節(jié)pH值至3.6～7.0。

1.3.5 藥物在對(duì)蝦體內(nèi)的代謝實(shí)驗(yàn)

配制含呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮藥物飼料，含量各約為1g/kg。將養(yǎng)殖至體長4～5 cm的對(duì)蝦放入試驗(yàn)池，養(yǎng)殖密度約200尾/m3；按每天喂養(yǎng)呋喃類藥劑100 mg/kg（以體質(zhì)量計(jì)）的劑量投料，連續(xù)投喂3 d。最后一次投藥后2 h開始采樣檢測(cè)，連續(xù)采樣直至所有代謝物不檢出，期間日換水量10%，養(yǎng)殖水溫（27±2） ℃。

1.3.6 計(jì)算公式

樣品中硝基呋喃代謝物的含量按以下公式計(jì)算：

式中：X為樣品中代謝物的含量/（μg/kg）；C為提取液中代謝物的濃度/（nmol/mL），即液相色譜儀測(cè)定的值；V為提取液最終定容體積/mL；M為代謝物摩爾質(zhì)量/（g/mol）；m為樣品的稱取量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生條件的優(yōu)化

硝基呋喃代謝物與鄰氯苯甲醛反應(yīng)生成較穩(wěn)定的西佛堿化合物，結(jié)果表明反應(yīng)體系酸強(qiáng)度對(duì)衍生結(jié)果影響不大，該反應(yīng)無論在酸性或中性條件下進(jìn)行，結(jié)果均相同。因此，反應(yīng)時(shí)只需粗略控制pH值在7.0以下。

圖1 溫度對(duì)衍生效果的影響Fig.1 Effect of different temperatures on the derivatization reactions

如圖1所示，在各溫度條件下衍生，產(chǎn)物在10 min即達(dá)到最大值。但隨著衍生時(shí)間延長，37 ℃時(shí)產(chǎn)物的含量無明顯變化，而在較高溫度條件下（50、60 ℃），衍生產(chǎn)物逐漸減少，尤其AMOZ和AOZ的衍生產(chǎn)物降解明顯。結(jié)果表明，衍生反應(yīng)不宜在較高溫條件下進(jìn)行，本方法選擇在37 ℃條件下衍生。

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

圖2 提取方式對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of different extraction methods on the yield of nitrofuran metabolites

圖3 TCA質(zhì)量濃度對(duì)提取量的影響Fig.3 Effect of different concentrations of trichloroacetic acid on the yield of nitrofuran metabolites

2.2.1 提取方式的確定如圖3所示，在37 ℃水浴振蕩條件下提取12 h，4 種代謝物提取量隨著TCA質(zhì)量濃度的增加而增加，TCA質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí)達(dá)最大值，再增加TCA質(zhì)量濃度，提取量不再增加。

2.2.3 提取時(shí)間的確定

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取量的影響Fig.4 Effect of different extraction durations on the yield of nitrofuran metabolites

提取時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響如圖4所示，衍生產(chǎn)物含量隨時(shí)間的延長而上升，提取12 h后達(dá)到最高值，之后隨時(shí)間變化增長不明顯。因此提取時(shí)間應(yīng)大于12 h。

2.2.4 提取次數(shù)的確定

為考察方法的提取能力，實(shí)驗(yàn)以含藥南美白對(duì)蝦肌肉為樣品，加入15 mL提取液（100 g/L TCA）和1 mL衍生化試劑，均質(zhì)，37 ℃水浴振蕩提取12 h，離心，取上清液，為1 次提取液；再分別提取第2、3 次，測(cè)定衍生物含量。結(jié)果如表2所示，使用規(guī)定方法提取樣品中4 種代謝物，1 次提取其提取率達(dá)75%以上可滿足日常樣品分析，樣品經(jīng)2 次提取則超過96%，方法提取效果較好。為縮短檢測(cè)時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)采用1 次提取后再加少量提取液洗滌沉淀的操作方式，其提取率可達(dá)80%以上，可滿足分析要求。

表2 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響Table 2 Effect of different extraction cycles on the yield of nitrofuran metabolites

2.2.5 凈化溶劑的確定

用二氯甲烷和乙酸乙酯分別萃取水相中衍生產(chǎn)物，結(jié)果表明二氯甲烷萃取能力較弱，1 次萃取率（萃取體積比1∶1時(shí)）不足50%，而乙酸乙酯萃取效果較好，能達(dá)90%以上。為確定適合的試劑用量，對(duì)比了不同萃取比的萃取效率，結(jié)果如表3所示。當(dāng)乙酸乙酯和樣品液體積比1.5∶1時(shí)，1 次萃取率超過95.9%，再增加用量對(duì)結(jié)果提升不明顯。另外，在萃取時(shí)用等體積水對(duì)乙酸乙酯層進(jìn)行洗滌，可以有效除去乙酸乙酯層的水溶性雜質(zhì)，且不會(huì)對(duì)衍生物造成損失。

表3 溶劑體積比對(duì)萃取率的影響Table 3 Effect of different volume ratios of ethyl acetate to extract on the recovery of nitrofuran metabolites%

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相的pH值對(duì)AMOZ衍生物的出峰時(shí)間及峰形有一定影響，其出峰時(shí)間隨著pH值變化而變化，對(duì)其他3 種則影響不大。當(dāng)pH值為5.2時(shí)，AMOZ與AOZ峰重疊不能分開；pH＞5.6時(shí)，AMOZ在AOZ之后出峰，出峰

如圖2所示，超聲波提取和振蕩提取2 種方法提取4 種代謝物的效率相當(dāng)，在相同的時(shí)間內(nèi)提取量相近，無明顯地區(qū)別。這結(jié)果表明超聲波并不能更有效促進(jìn)代謝物從蛋白質(zhì)結(jié)合物中解離。反而在長時(shí)間提取過程中，造成樣品溫度上升，這也可能是在提取60 min后超聲波提取AMOZ和AOZ結(jié)果低于振蕩提取的原因，因二者產(chǎn)物在較高溫度條件下降解較快。兩種方法中，短時(shí)間內(nèi)SEM提取量低于其他3 種代謝物，可能是因?yàn)镾EM與蛋白質(zhì)的結(jié)合較牢固，需要更長時(shí)間水解才能解離出來。顯然，振蕩法更適合于硝基呋喃類藥物代謝物的提取。

2.2.2 提取液中TCA質(zhì)量濃度確定較靠后，峰寬變寬；4.3＜pH＜4.8時(shí)，AMOZ在AHD與AOZ之間出峰，各峰互不干擾，峰形對(duì)稱；pH＜3.6時(shí)，AMOZ最早出峰，與樣品雜質(zhì)峰重疊，不能分開。以0.05 mol/L磷酸銨-乙腈（30∶70，pH 4.6）作為流動(dòng)相，各峰分離較好，峰形對(duì)稱美觀（圖5、6）。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.5 Chromatogram of mixed standard solution of nitrofuran metabolites

圖6 蝦肉空白（A）和加標(biāo)30nmol/kg（B）色譜圖Fig.6 Chromatograms of a blank sample of shrimp alone (A) and spiked with nitrofuran metabolites (B) (30 nmol/kg)

2.3.2 檢測(cè)波長的選擇

圖7 280 nm和300 nm檢測(cè)波長處的樣品色譜圖Fig.7 Chromatogram of sample at 280 and 300 nm

4 種代謝物在280 nm波長處有最強(qiáng)吸收，但在280 nm波長處檢測(cè)樣品時(shí)，樣品中的基質(zhì)也有較強(qiáng)的吸收，對(duì)目標(biāo)峰造成干擾。圖7為蝦肉加標(biāo)樣品色譜圖，在280 nm波長處檢測(cè)時(shí)，基線波動(dòng)較大，且有明顯雜質(zhì)峰干擾。使用300 nm作為檢測(cè)波長時(shí)，雜質(zhì)峰明顯減小，尤其AMOZ右側(cè)的干擾物質(zhì)基本不出峰，基線相對(duì)較平穩(wěn)，信噪比比280 nm時(shí)高，因此選擇300 nm作為檢測(cè)波長。

2.4 方法線性范圍、檢出限和回收率

配制不同濃度代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)液，加入提取液后，經(jīng)衍生、萃取、濃縮等處理，用液相色譜分析，測(cè)定不同濃度工作液的峰面積，繪制峰面積-濃度校正曲線，在0.1～50 nmol/mL范圍內(nèi)，各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.990，以各峰信噪比為3時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度作為檢出限，代入公式計(jì)算各物質(zhì)濃度，得各物質(zhì)檢出限。用規(guī)定方法測(cè)定SEM、AHD、AMOZ和AOZ檢出限依次為0.75、1.2、2.0、1.0 ?g/kg（表4）。

表4 硝基呋喃類藥物代謝物線性方程及檢出限Table 4 Linear equations and detection limits of nitrofuran metabolites

另以陰性蝦樣為樣品，添加代謝物水平分別為0.020、0.20、2.0 ?mol/kg，每個(gè)水平做3個(gè)平行，加標(biāo)充分混勻，靜置2 h以上后，樣品按規(guī)定方法進(jìn)行提取、凈化、檢測(cè)，4 種代謝物在蝦樣中的回收率在81.9%～92.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）為1.4%～7.9%（表5），準(zhǔn)確度較高。

表5 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table 5 Recoveries and relative standard deviations for spiked blank samples (n= 3)

2.5 藥物在對(duì)蝦體內(nèi)的代謝規(guī)律

2.5.1 代謝物在對(duì)蝦肌肉內(nèi)殘留情況

硝基呋喃藥物在蝦體內(nèi)殘留測(cè)定結(jié)果見表6。用藥后SEM、AHD、AMOZ和AOZ在蝦體內(nèi)富集最高含量分別為51.5、35.8、79.3 μg/kg和127 μg/kg；前期藥物代謝較快，停藥2 d后分別降為17.0、9.27、22.1 μg/kg和29.2 μg/kg，分別約消除67.0%、74.2%、72.2%和77.0%；但該類藥物后期代謝較慢，分別在第24、12、12、24天后低于檢出限。

表6 硝基呋喃類藥物代謝物在對(duì)蝦肌肉內(nèi)的代謝情況Table 6 Nitrofuran metabolite residues in shrimp muscle μg/kg

2.5.2 代謝物在對(duì)蝦肌肉中代謝規(guī)律分析

表7 代謝物在對(duì)蝦肌肉中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 7 Pharmacokinetic parameters of SEM, AHD, AMOZ and AOZ in shrimp muscle

硝基呋喃類藥物代謝物在對(duì)蝦肌肉中殘留數(shù)據(jù)經(jīng)DAS 2.0分析，其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表7。4種代謝物在肌肉中的SEM、AHD和AOZ代謝半衰期同為69.315 h，AMOZ為62.205 h。在本研究中，以半衰期推算，代謝物在對(duì)蝦肌肉中殘留量低于0.5 μg/kg所需代謝時(shí)間分別約為：SEM 21 d、AHD 15 d、AMOZ 17 d、AOZ 23 d。

3 討 論

3.1 樣品提取

硝基呋喃代謝物在樣品中以蛋白結(jié)合物的形式存在，大多數(shù)方法中樣品提取時(shí)使用鹽酸水解[11-15,17-23]，較少使用TCA[8]。研究對(duì)比了兩種酸的提取效果，鹽酸提取液渾濁黏稠，含有大量的雜質(zhì)，主要是由于提取過程促進(jìn)了蛋白質(zhì)的水解而使大量的蛋白多肽溶入，影響了之后的萃取純化；而由于TCA兼具沉淀蛋白的作用，提取液較澄清，雜質(zhì)少。提取液中TCA質(zhì)量濃度對(duì)提取率影響較大，從20 g/L增加到100 g/L，溶劑的提取能力顯著提高，100 g/L時(shí)達(dá)到最高值。提取液中甲醇也有助提作用，僅用含TCA的水溶液提取率低于含甲醇的提取劑，尤其對(duì)AHD、AMOZ、AOZ三種代謝物的影響更為明顯。另外，有些研究者采用冰溫的甲醇和水的混合液洗滌樣品[11-12,15,23]，認(rèn)為有去雜質(zhì)的作用，但本研究中發(fā)現(xiàn)甲醇和水的混合液（8∶1）洗滌喂藥南美白對(duì)蝦樣品，在洗滌液檢測(cè)出了一定含量的AHD、AMOZ和AOZ，造成了目標(biāo)物的損失，因此，不建議使用甲醇溶液洗滌樣品的方式來除雜。

3.2 色譜條件

實(shí)驗(yàn)比較了流動(dòng)相在pH 3.0～7.0之間4 種代謝物衍生物在反相色譜柱上分離情況，除AMOZ外，其余3 種代謝物幾乎不受流動(dòng)相pH值變化影響，當(dāng)流動(dòng)相在pH 4.3～4.8之間時(shí)，4 種代謝物的分離效果較好。比較緩沖鹽使用乙酸銨或磷酸銨對(duì)代謝物的分離效果，結(jié)果表明分離情況相似。磷酸銨緩沖液不需調(diào)節(jié)pH值，避免因調(diào)節(jié)不精確而造成色譜分離不穩(wěn)定的問題。與農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告規(guī)定的方法比較，本方法流動(dòng)相配制簡便。另外，以0.05 mol/L磷酸銨（pH 4.6）-乙腈（30∶70）為流動(dòng)相等度洗脫，樣品在Agilent Zorbax SB-C18、GraceSmart RP-18、Athena C18-WP色譜柱上分離良好，方法的適用性較好。

3.3 藥物消除時(shí)間

一般來說，硝基呋喃類藥物代謝物在動(dòng)物體內(nèi)與蛋白穩(wěn)固結(jié)合，消除緩慢。張海琪等[24]研究呋喃唑酮在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的代謝，AOZ在肌肉中富集最高含量為210 μg/kg，消除半衰期長達(dá)505 h；王明興等[25]研究呋喃西林代謝，其代謝物SEM在對(duì)蝦肌肉內(nèi)富集達(dá)361 μg/kg，消除半衰期也長達(dá)11.75 d；表明了這類藥物一旦使用，短時(shí)間內(nèi)難以消除。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果則為，藥物殘留低于0.5μg/kg所需代謝時(shí)間為SEM 21 d、AHD15 d、AMOZ 17 d和AOZ 23 d，相對(duì)較短。硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)的消除速率，與種屬、用藥方式、富集含量、水溫、期間換水情況等因素有關(guān)[25-27]。本研究對(duì)蝦體內(nèi)藥物富集濃度較低，養(yǎng)殖水溫在25～29 ℃，日換水量達(dá)10%，這可能是本研究藥物代謝周期短的原因。除此之外，也可能與用藥對(duì)象齡期（個(gè)體大小）有較大關(guān)系。趙東豪等[28]對(duì)蝦苗的代謝實(shí)驗(yàn)，SEM（初始含量518 μg/kg）在蝦苗體內(nèi)殘留時(shí)間最長不超過50 d，AOZ（初始含量173 μg/kg）在蝦苗體內(nèi)殘留時(shí)間最長不超過20 d，結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)類似。對(duì)于對(duì)蝦而言，其生長較快，體質(zhì)量成倍增加而引起的稀釋作用影響很大，通常對(duì)小蝦如蝦苗用藥，藥物消除半衰期更短。本研究使用體長約為4.5 cm、體質(zhì)量約為3 g的小蝦為用藥對(duì)象，養(yǎng)殖28 d后，體長增至約6 cm，體質(zhì)量約增至原來3 倍，這可能是硝基呋喃類藥物在本研究中代謝周期較短的一大主因。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立以100g/L TCA-甲醇溶液提取、乙酸乙酯萃取純化、高效液相色譜-紫外法測(cè)定4 種硝基呋喃類藥物代謝物在蝦肉組織中殘留量的方法，優(yōu)化了提取過程和除雜步驟，不需使用固相萃取柱凈化，簡化了操作。方法檢出限分別為SEM 0.75 ?g/kg、AHD 1.2 ?g/kg、AMOZ 2.0 ?g/kg、AOZ 1.0 ?g/kg。使用該方法監(jiān)測(cè)硝基呋喃類藥物代謝物在中等規(guī)格的南美白對(duì)蝦體肌肉內(nèi)的殘留，以模擬在養(yǎng)殖中間階段用藥的情況，結(jié)果表明，代謝物在對(duì)蝦肌肉中殘留量低于0.5 μg/kg所需代謝時(shí)間分別約為：SEM 21 d、AHD 15 d、AMOZ 17 d、AOZ 23 d。

[1] BARTEL L C, de MECCA M, CASTRO J A. Nitroreductive metabolic activation of some carcinogenic nitro heterocyclic food contaminants in rat mammary tissue cellular fractions[J]. Food and Chemical Toxicology, 2009, 47(1): 140-144.

[2] VASS M, HRUSKA K, FRANEK M. Nitrofuran antibiotics: a review on the application, prohibition and residual analysis[J]. Veterinarni Medicina, 2008, 53(9): 469-500.

[3] 陳威風(fēng), 陳敬鑫. 肉制品中硝基呋喃類藥物殘留的研究進(jìn)展[J]. 肉類研究, 2011, 25(12): 53-57.

[4] 禁用藥物中孔雀石綠、氯霉素和硝基呋喃類使用頻率高[J]. 海洋與漁業(yè), 2011(11): 2.

[5] 柳愛春, 劉超, 趙蕓, 等. 免疫膠體金法快速檢測(cè)水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 25(1): 95-102.

[6] 潘心紅, 鄧艷芬, 李軍濤, 等. 用膠體金試紙法直接測(cè)定魚肉中硝基呋喃類殘留的方法探討[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2011, 21(3): 568-569.

[7] 潘心紅, 羅曉燕, 李軍濤, 等. 直接測(cè)定蝦類硝基呋喃類殘留量方法的探討[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2010, 20(4): 740-741.

[8] 全國水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì), 水產(chǎn)品加工分技術(shù)委員會(huì). 農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-2—2008 水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定:高效液相色譜法[S]. 2008.

[9] 王媛, 蔡友瓊, 賈東芬, 等. 高效液相色譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量[J]. 分析試驗(yàn)室, 2009, 28(12): 86-90.

[10] DU Nana, CHEN Mingming, SHENG Liangquan, et al. Determination of nitrofuran metabolites in shrimp by high performance liquid chromatography with fluorescence detection and liquid chromatography-tandem mass spectrometry using a new derivatization reagent[J]. Journal of Chromatography A, 2014, 1327: 90-96.

[11] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局, 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 20752—2006 豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定: 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2006.

[12] 農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部公告781-4—2006 動(dòng)物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定: 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 2006.

[13] 于慧娟, 李冰, 蔡友瓊, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定甲殼類水產(chǎn)品中氨基脲的含量[J]. 分析化學(xué), 2012, 40(10): 1530-1535.

[14] 邢麗紅, 孫偉紅, 李兆新, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法快速測(cè)定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物[J]. 環(huán)境化學(xué), 2011, 30(6): 1202-1203.

[15] 劉紅衛(wèi), 高志瑩, 周圍, 等. UPLC-MS/MS法測(cè)定腸衣中四種硝基呋喃類代謝物殘留量[J]. 中國獸藥雜志, 2008, 42(11): 20-23.

[16] 劉輝, 梁德沛, 花鐵果, 等. 食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2013, 4(2): 383-388.

[17] 楊奕, 邵兵. 超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蝦中硝基呋喃代謝物[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2013, 4(1): 135-140.

[18] 王傳現(xiàn), 黃帆, 王敏, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中殘留的硝基呋喃類藥物的代謝物[J]. 色譜, 2013, 31(3): 206-210.

[19] 張秀妍, 馬琳, 王慧龍. 海參和海參苗種中硝基呋喃類代謝物殘留的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)法[J]. 口岸衛(wèi)生控制, 2012, 17(6): 24-28.

[20] 祝偉霞, 袁萍, 楊冀州, 等. 固相支撐液液萃取-平行蒸發(fā)前處理技術(shù)測(cè)定動(dòng)物源性食品中4 種硝基呋喃類代謝物[J]. 食品科技, 2011, 36(2): 300-303.

[21] 孫慧宇, 陳君義, 王玥, 等. 液相色譜-同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類代謝物殘留[J]. 分析試驗(yàn)室, 2011, 30(7): 115-118.

[22] 錢卓真, 位紹紅, 余穎, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鮑魚中硝基呋喃類代謝物殘留量[J]. 福建水產(chǎn), 2010(2): 43-49.

[23] 龐國芳, 張進(jìn)杰, 曹彥忠, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定家禽組織中硝基呋喃類抗生素代謝物殘留的研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(10): 160-165.

[24] 張海琪, 丁雪燕, 薛輝利, 等. 呋喃唑酮在凡納濱對(duì)蝦組織中代謝動(dòng)力學(xué)研究[J]. 寧波大學(xué)學(xué)報(bào): 理工版, 2009, 22(4): 472-476.

[25] 王明興, 吳曉萍, 廖艷, 等. 呋喃西林代謝物在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)代謝及殘留[J]. 食品與機(jī)械, 2013, 29(1): 76-80.

[26] 樊新華, 鄭浩, 錢偉, 等. 呋喃西林代謝物氨基脲在中華絨螯蟹體內(nèi)的衰減研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(6): 368-370.

[27] 蔣原, 丁濤, 徐錦忠, 等. 硝基呋喃類藥物在克氏螯蝦組織中消除規(guī)律的研究[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2008, 40(2): 34-37.

[28] 趙東豪, 黎智廣, 李劉冬, 等. 蝦苗使用呋喃西林和呋喃唑酮的殘留評(píng)估[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2012, 8(3): 54-58.

Determination of Nitrofuran Metabolites by High Performance Liquid Chromatography and Their Metabolism in Shrimp

XIN Shao-ping1,2, DENG Jian-chao1, YANG Xian-qing1, CEN Jian-wei1, WEI Ya1, HAO Shu-xian1, LI Lai-hao1,*
(1. National R＆D Center for Aquatic Product Processing, Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

A high performance liquid chromatography (HPLC) method for the determination of nitrofuran metabolites in shrimp has been established. After being extracted by 100g/L trichloroacetic acid in methanol-water (50:50, V/V), the four metabolites semicarbazide (SEM), 1-aminohydantoin (AHD), 5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxazolidone (AMOZ) and 3-amino-2-oxazolidone (AOZ), were reacted with 2-chlorobenzaldehyde. The analytes were separated in a C18column with 0.05 mol/L ammonium acetate-acetonitrile (30:70, V/V) as the mobile phase and detected by a UV detector. SEM, AHD, AMOZ and AOZ were quantified by external standard method. The response signals were all linearly proportional to concentrations of the four metabolites in the range of 0.1–50 nmol/mL, and the limits of detection (LODs) were calculated as 0.75, 1.2, 2.0 and 1.0 ?g/kg, respectively. The maximum values of the four metabolites accumulated in shrimp muscle were found to be 51.5, 35.8, 79.3 and 127 μg/kg after the discontinuation of the drugs, and the elimination life turns out to be 21, 15, 17 and 23 days in this study, respectively.

high performance liquid chromatography (HPLC); nitrofuran metabolites; metabolism; shrimp

O657.72；R978.25

A

1002-6630（2014）24-0151-07

10.7506/spkx1002-6630-201424029

2014-06-30

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B00）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（羅非魚）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-49）；廣東省水產(chǎn)品質(zhì)量安全專項(xiàng)（2130109A-2-1）；省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合示范基地項(xiàng)目（2011B090500015）；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)（B201300C03）

辛少平（1986—），男，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品加工和質(zhì)量安全研究。E-mail：xinsp86@gmail.com

*通信作者：李來好（1963—），男，研究員，博士，主要從事水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究。E-mail：laihaoli@163.com