Stathmin對卵巢癌C13K細胞增殖和順鉑敏感性影響研究

石英+張軍港+王常玉

[摘要] 目的 探討微管調節蛋白Stathmin對卵巢癌順鉑耐藥細胞C13K增殖和化療敏感性的影響。 方法 應用蛋白質印記法檢測卵巢癌順鉑敏感性OV2008細胞和耐藥性C13K細胞Stathmin表達差異；選擇C13K為實驗細胞，應用siRNA靶向沉默Stathmin（Stathmin-siRNA組），以未轉染細胞為空白對照組，以轉染陰性干擾為陰性對照組，利用蛋白質印記法檢測siRNA轉染效果，MTT法測定轉染對細胞增殖和順鉑敏感性的影響，流式細胞儀測定轉染對順鉑引起的細胞周期的變化。 結果 Stathmin在細胞C13K的表達較OV2008的表達明顯增加。與空白對照組和陰性對照組相比，Stathmin-siRNA組中Stathmin表達明顯降低，C13K細胞的增殖明顯抑制，Stathmin-siRNA組順鉑半數致死量IC50[（15.41±1.08）μg/mL]明顯降低。Stathmin-siRNA組順鉑誘導的G2/M期（27.48±0.76）%明顯高于順鉑處理的對照組。 結論 干擾Stathmin能明顯抑制C13K細胞的增殖，增強卵巢癌對順鉑的敏感性，為卵巢癌治療提供新的前景。

[關鍵詞] Stathmin；卵巢癌；siRNA；增殖；順鉑

[中圖分類號] R737.31 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）32-0001-04

Influences of stathmin on C13K cell proliferation and chemosensitivity of cisplatin in ovarian cancer

SHI Ying1，3 ZHANG Jungang2 WANG Changyu3

1.Department of Obstetrics and Gynecology， Zhejiang Provincial Peoples Hospital， Hangzhou 310014， China； 2.Hepatobiliary and Pancreatic Surgery， Zhejiang Provincial Peoples Hospital， Hangzhou 310014， China； 3.Department of Gynecology， Tongji Hospital， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430030， China

[Abstract] Objective To explore the role of stathmin on the C13K cell proliferation and chemosensitivity of cisplatin in ovarian cancer. Methods The stathmin expression in cisplatin-sensitive OV2008 and resistant C13K cells was detected by western blot. Effective stathmin siRNA was transfected into ovarian cancer C13K cells（Stathmin-siRNA group）. Non-transfected cells were used as blank control and negative siRNA as negative control. Western blot was used to verify the siRNA interference result. MTT was used to measure the cell proliferation and the change of chemosensitivity to cisplatin. Flow cytometry was used to detect the change of cisplatin-induced cell cycle arrest. Results Stathmin expression in C13K cells was higher than that in OV2008 cells. Compared to blank control group and negative control group， Stathmin protein was significantly reduced and the proliferation was significantly inhibited in stathmin-siRNA group， and the IC50 of cisplatin in stathmin-siRNA group [（15.41±1.08） μg/mL] was significantly lower. The cell cycle in G2/M phase induced by cisplatin in stathmin-siRNA group [（27.48±0.76）%] was significantly higher than those in control group. Conclusion Interfering with stathmin can effectively inhibit the proliferation of C13K cell and effectively increase cisplatin chemosensitivity， and provide new prospects for ovarian cancer treatment.

[Key words] Stathmin； Ovarian cancer； siRNA； Proliferation； Cisplatin

卵巢癌是一種常見的嚴重威脅婦女生命健康的惡性疾病，它的多藥耐藥性已成為影響患者生存的主要因素之一，因此尋找新的靶點進行干預以增強化療的效果是治療卵巢癌的關鍵點之一[1，2]。Stathmin是一種重要的微管調節蛋白，能有效調控細胞增殖、細胞周期進展、分化和運動等生物學行為過程[3，4]。Stathmin在多種腫瘤表達上調，下調Stathmin的表達可抑制腫瘤的增殖[5-7]，我們前期的研究結果發現Stathmin蛋白在卵巢癌組織中呈明顯高表達，與卵巢癌的臨床分期、病理分級和淋巴轉移的病理特征密切相關[8]。但Stathmin在體外對卵巢癌細胞的增殖和順鉑敏感性尚未明確。本研究設想通過檢測卵巢癌順鉑耐藥細胞株C13K和順鉑敏感細胞株OV2008中Stathmin的表達，明確其表達差異，進而通過干預Stathmin表達觀察卵巢癌細胞增殖和順鉑敏感性變化，為臨床更有效地治療卵巢癌提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

人卵巢癌OV2008及C13K細胞株由加拿大Ben jam in K，Tsang 博士（Department of Obstetrics and Gynecology and Molecular University of Ottowa）惠贈。Stathmin siRNA 由上海Invitrogen技術有限公司設計并合成，Lipo2000陽離子脂質體購買于上海Invitrogen公司，Stathmin和GAPDH兔抗人一抗均購買于美國Santa Cruz公司。順鉑（DDP）和碘化丙啶（propidium iodine，PI）購買于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 OV2008及C13K細胞用PRMI 1640培養基（含10%胎牛血清）在37℃含5%CO2的細胞培養箱中培養，兩種卵巢癌細胞均呈貼壁性生長，選用對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 蛋白質印記法檢測Stathmin蛋白表達 細胞經SDS蛋白裂解液裂解獲得蛋白后，BCA蛋白定量法測定細胞蛋白含量。蛋白變性后取30 μg蛋白上樣，使用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入1∶500稀釋的一抗4℃孵育過夜，加入1∶2000稀釋的二抗室溫孵育90 min，ECL增強發光顯影，使用Bandscan 5.0圖像分析軟件進行光密度積分值分析。

1.2.3 轉染細胞 將處于對數生長期的卵巢癌細胞接種于相應的培養板中（6孔板接種細胞數約為5×105/孔，96孔板約為1×105/孔），PRMI 1640培養基中不能含抗生素；細胞生長到融合度為30%～50%時，按OligofectamineTM Reagent（Invitrogen公司）說明書步驟進行寡核苷酸的細胞轉染。Stathmin-siRNA和negative RNAi的干擾序列分別為5'-CUCCAGGGAAAGAUCCUUCUU-3'和5'-CUCAAGCGACGAUAGCUUCUU-3'。應用siRNA靶向沉默Stathmin作為Stathmin-siRNA組，以未轉染細胞為空白對照組，以轉染陰性干擾為陰性對照組。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖變化 將C13K細胞以5×103/孔接種于96孔板中，細胞貼壁后可進行瞬時轉染，每組細胞均設復孔4個，轉染24 h、48 h和72 h后在各組細胞中加入MTT溶液（終濃度1 mg/mL），細胞培養箱中避光培養4 h，小心丟棄上層培養液，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL于水平搖床輕搖20 min使其充分溶解，酶標儀檢測波長490 nm處的吸光度值（A）并繪制相應增殖曲線。

1.2.5 MTT法檢測Stathmin siRNA干擾對順鉑敏感性的影響 將C13K細胞以5×103/孔接種于96孔板中，使用不含血清的1640培養液饑餓6 h，轉染24 h后加入不同濃度的順鉑（終濃度分別為0 μg/mL、7.5 μg/mL、15 μg/mL、22.5 μg/mL和30 μg/mL）繼續培養24 h，每孔加入MTT溶液（終濃度為1 mg/mL）培養4 h，小心丟棄上層培養液，加入DMSO 150 μL，輕搖20 min至結晶完全溶解，酶標儀檢測波長490 nm處吸光值，計算半數抑制量數值（IC50）。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞周期的變化 將細胞以1×105/孔接種于6孔板中，當細胞達到30%～50%融合度時，按Invitrogen公司操作說明書進行瞬轉；轉染后48 h細胞融合度能達到70%～80%，加順鉑（終濃度15 μg/mL）繼續培養24 h；收集各處理組細胞，加入70%濃度的冰乙醇固定過夜（-20℃），1200 rpm/min離心5 min，離心半徑為10 cm，使用PBS重懸洗滌細胞離心，再加入10 μg/mL PI溶液（含0.1%RNase A）500 μL，室溫下避光染色1 h，半小時內流式細胞儀上機測定細胞周期。

1.3 統計學分析

所有數據重復3次，所有數據使用均數±標準差（x±s）表示，使用SPSS 16.0軟件進行統計學處理分析，兩組間數據比較采用Students t-test，多組間數據比較可采用單因素方差分析和LSD檢驗，P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Stathmin在OV2008和C13K細胞中的表達

采用蛋白質印記法研究發現Stathmin在卵巢癌順鉑耐藥細胞株C13K中表達（0.82±0.02）明顯高于卵巢癌順鉑敏感細胞株OV2008（0.18±0.02），差異有顯著統計學意義（t=34.80，P<0.01）。見圖1。

2.2 Stathmin siRNA干擾對C13K細胞Stathmin蛋白的影響

與空白對照組（1.69±0.04）和陰性對照組（1.62±0.03）相比，轉染Stathmin siRNA至48 h后，C13K細胞中的Stathmin 蛋白表達量均明顯下降（0.37±0.02），三者差異有統計學意義（F=1023，P<0.0l）。而空白對照和陰性對照組比較，兩者無統計學差異（P>0.05）。見圖2。

2.3 siRNA轉染對C13K細胞增殖的影響

用MTT法檢測空白對照組、陰性對照組、Stathmin-siRNA組細胞增殖變化。結果顯示轉染siRNA 0 h、24 h、48 h后對細胞的增殖無明顯影響；而在轉染72 h后，Stathmin-siRNA組細胞的增殖能力（OD=0.55±0.05）明顯低于空白對照組（OD=1.35±0.06）及陰性對照組細胞（OD=1.26±0.08），差異具有統計學意義（F=142.6，P<0.01），而空白對照和陰性對照組比較，無統計學差異（P>0.05）（圖3）。

圖3 轉染siRNA對C13K細胞增殖能力的影響

vs空白對照組和陰性對照組，bP<0.01

2.4 siRNA轉染對C13K細胞順鉑敏感性的影響

順鉑作用24 h時對空白對照組的半數致死劑量IC50為（27.22±2.12）μg/mL，陰性對照組的IC50為（25.05±1.29）μg/mL，而Stathmin-siRNA組IC50為（15.41±1.08）μg/mL，三者比較，F=31.04，P<0.01，即Stathmin-siRNA干擾后能顯著提高C13K細胞對順鉑的敏感性，而與空白對照組相比，陰性對照組的順鉑敏感性無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4。

圖4 MTT法檢測轉染前后細胞對順鉑敏感性的影響

vs空白對照組和陰性對照組，aP<0.05、bP<0.01

2.5 Stathmin-siRNA對順鉑致C13K細胞周期性的影響

細胞轉染48 h再經順鉑（15 μg/mL）作用24 h后，與順鉑作用的空白對照組[（4.33±0.34）%]和陰性對照組[（3.31±0.35）%]相比，Stathmin-siRNA組G2/M期細胞明顯增多[（27.48±0.76）%]，差異具有統計學意義（F=1362，P<0.01）。同時對G0/G1期的影響無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 轉染siRNA對C13K細胞周期的影響（x±s，%）

3 討論

化療耐藥是一個多因素、多環節相互作用、相互影響的復雜過程。既往研究發現卵巢癌耐藥的發生發展受多個基因的重要調控，例如野生型P53的突變[9]，BRAC1二次突變[10]，凋亡蛋白抑制分子XIAP[11]等在鉑類耐藥的發生發展中都發揮了重要作用。Kigawa等研究發現野生型P53缺失能增強腫瘤對順鉑的耐受，相反，wtP53基因的重建增強了化療敏感性[12]。P53的突變使腫瘤細胞喪失了G1/S檢測點的調控，DNA損傷修復明顯減少，最終增強了順鉑化療敏感性[13]。因此尋找新的基因治療靶點并進行靶向干預，能有效逆轉化療藥物的耐受，為卵巢癌的診治和延長患者生命提供有益的幫助。

Stathmin，是細胞內與細胞周期調控相關的一種重要微管調節蛋白，主要通過磷酸化和去磷酸化過程的相互切換調節微管系統動力平衡來參與多種腫瘤的發生發展、侵襲轉移及獲得性多藥耐藥等生物學過程，然而它的具體作用機制還未研究清楚。Wang F等[4]發現Stathmin在食管癌中高表達，與腫瘤分化程度，腫瘤浸潤深度，淋巴結轉移和TNM分期密切相關。Xu JP等[14]通過二維電泳技術發現Stathmin在阿霉素化療耐受的白血病細胞中表達量更高，提出Stathmin 可能與白血病的耐藥密切相關[14]。Werner HM等[15]研究發現Stathmin干擾后能明顯增強子宮內膜癌對紫杉酚的敏感性，同時Stathmin的高表達的患者接受紫杉酚化療后其生存率更低[15]。本研究發現Stathmin在順鉑耐藥型卵巢癌細胞中的表達高于化療敏感細胞株，這與Balachandran R等[16]的研究結果相一致[16]，提示Stathmin可能參與了這兩種細胞不同的表型差異，在卵巢癌的順鉑耐藥中可能起重要作用。

RNA干擾（RNAi）是利用同源性的雙鏈RNA誘導特異性序列的基因靶向沉默，能快速有效抑制基因的表達及其活性。siRNA是一種具有21～23個堿基的雙鏈RNA小分子干擾片段，能特異性識別靶基因的序列，已廣泛用于基礎實驗研究和部分臨床藥物的研發過程[17-19]。我們利用RNA干擾下調卵巢癌C13K細胞中Stathmin的表達，進而進行相關體外實驗研究。本研究觀察到沉默卵巢癌細胞Stathmin的表達后，細胞的體外增殖能力明顯抑制，表明Stathmin參與了調節卵巢癌細胞的增殖及分化，促進腫瘤細胞的生長過程。Stathmin的以上作用可能受PCNA、P53、FOXM1等增殖相關通路的重要調控作用。我們發現抑制Stathmin的表達能明顯降低C13K細胞化療藥物順鉑的IC50值，增強其化療的敏感性，提示Stathmin的干擾片段同化療可聯合應用，提高卵巢癌的治療效果。同時，我們也發現較低劑量的順鉑能使卵巢癌細胞阻滯在S期，這樣的效果一方面可以使DNA的合成明顯受阻，另一方面使癌細胞有充足的時間啟動DNA損傷修復機制，更容易誘導獲得性耐藥的產生。Shin SY等[20]研究發現跨越S期增加G2/M期阻滯能有效增加腫瘤細胞對順鉑的敏感性。本研究證實Stathmin的siRNA轉染能明顯降低順鉑導致的S期阻滯，增加G2/M期細胞比例。由此推測，Stathmin可能通過周期調節分子相互作用，影響細胞周期檢測點功能或DNA損傷修復機制，從而影響鉑類耐藥。當然其具體作用機制還需要進一步研究。因此，Stathmin不僅影響直接作用于微管的化療藥物如紫杉醇等的耐藥性，而且對卵巢癌的順鉑耐藥也有一定影響。當然，腫瘤的發生發展受多個基因聯合調控，單獨研究某一基因或分子對于徹底治愈腫瘤遠遠不夠，全面研究并繪制宏觀的基因調控網絡圖至關重要。

綜上所述，干擾Stathmin的表達可顯著抑制卵巢癌細胞的增殖，同時通過促使細胞周期阻滯在G2/M期來增強C13K細胞對順鉑的藥物敏感性，提示Stathmin基因可能是治療卵巢癌的有效靶點。

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（收稿日期：2014-07-24）

綜上所述，干擾Stathmin的表達可顯著抑制卵巢癌細胞的增殖，同時通過促使細胞周期阻滯在G2/M期來增強C13K細胞對順鉑的藥物敏感性，提示Stathmin基因可能是治療卵巢癌的有效靶點。

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（收稿日期：2014-07-24）

綜上所述，干擾Stathmin的表達可顯著抑制卵巢癌細胞的增殖，同時通過促使細胞周期阻滯在G2/M期來增強C13K細胞對順鉑的藥物敏感性，提示Stathmin基因可能是治療卵巢癌的有效靶點。

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（收稿日期：2014-07-24）