水蛭腸道微生物的研究進展

陳亞莉　王貴虎　張全星等

摘要 水蛭（螞蝗）是一種重要的中藥材，其唾腺分泌的水蛭素具有抗凝血作用，被廣泛應用于醫療手術和心血管疾病治療，具有較高的醫療價值與經濟價值。水蛭腸道微生物與水蛭的消化、營養、免疫和抗菌等功能密切相關，也可能與水蛭素的分泌有關。對水蛭腸道微生物的研究方法、菌群組成及作用等方面的研究進展進行了綜述，以期為水蛭腸道微生物的深入研究和利用提供理論和方法參考，為推動水蛭養殖業發展和擴展水蛭和水蛭素的醫學應用提供理論基礎。

關鍵詞 水蛭；腸道微生物；研究方法

中圖分類號 S917.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-164-03

The Research Progress of Leech Gut Microbes

CHEN Yali1 ， WANG Guihu2， ZHANG Quanxing1 et al

（1. Shaanxi Normal University， Xian， Shaanxi 710062； 2. National Local Joint Engineering Research Center of Biodiagnostics & Biotherapy， Xian Jiao Tong University， Xian， Shaanxi 710004）

Abstract Leech is a traditional Chinese medicine with great importance， its salivary gland secretion hirudin has been widely used into medical surgery， therefore， has a very high economic value. Microbes dwell in leech gut have several functions， such as synthesizing the necessary nutrients for their hosts， stimulating the immune system， and defensing the extraneous pathogens， closely related to the secretion of hirudin and the health of leech. In this research， a review of the study methods， composition and activity of the microbe communities dwell in the Leech gut was given， in order to provide some theoretical and methodological guidance for the further study of gut microbiota in leech， setting theoretical basis for the development of the leech aquaculture industry and for the further expansions of the medical application of hirudin and leech.

Key words Leech； Gut microbes； Research method

動物腸道內棲息著大量的微生物，經過長期共同進化，最終形成復雜且呈動態平衡的微生物群落。大量研究表明，這些消化道內的微生物對宿主健康有極其重要的意義，如果微生態平衡失調，機體正常的生理功能便會紊亂，引發疾病[1]。動物的食性選擇和覓食行為也是經歷長期而復雜的選擇壓力的進化結果[2]，動物自身缺失合成某些營養物質的能力，導致其必須依賴體內的共生菌來完成相應功能，比如幫助宿主從食物中進一步攝取營養物質，合成一些關鍵代謝反應的化合物[3]。因此，動物腸道微生物對宿主的影響及其與疾病等的聯系已成為近年來研究的熱點問題[4-6]。

水蛭（Leech）隸屬環節動物門、蛭綱，俗稱螞蟥。目前全世界已報道的水蛭共有300多種[7]，我國已知2目8科33屬約76種和亞種，廣泛分布于我國大部分地區[8]。絕大多數水蛭靠吸血生存，吸血水蛭每次攝取血液的量相當于其自身體重的2.5～10.0倍，吸食1次血液可維持長達1年的生存需求[7]。此過程中，水蛭前端的吸盤將刺吸性口器刺入皮膚，其咽頭和食道外側分布的大量唾液腺能分泌具有阻止血液凝固的抗凝劑水蛭素（Hirudin）、麻醉劑以及能使血管寄主擴張的類組胺（Histamine）物質，這類物質能夠促使傷口血流量增大，抗凝劑能阻止攝入水蛭消化道內的血液凝固。在此過程中，腸道微生物也起著重要的作用，如合成必要的營養物質、刺激免疫系統和抵抗外來致病菌的侵襲等[9]。水蛭素具有很好的抗凝血、抗血栓和抗纖維化等作用[10]，在當今的醫療領域中不僅應用于術后緩解靜脈充血，而且廣泛應用于整形外科手術中，提高了手術的成功率[11]。

傳統的腸道微生物的分離大多采用培養方法，但絕大多數腸道微生物因為無法培養而未能進行研究和鑒定。隨著新的分子生物學技術在腸道微生物研究中的不斷應用，尤其是一些分子生物學方法（如末端限制性片段長度多態性（Terminalrestriction fragment length polymorphism，TRFLP）和熒光原位雜交（Fluorescent in situ hybridization，FISH）等）的應用，使研究中對培養方法的依賴大大降低。這些方法能夠將難以培養以及不能培養的微生物直接進行分子鑒定，對于全面了解腸道微生物的組成、分布及其功能有很大的幫助。筆者對水蛭腸道微生物的研究方法、腸道微生物的菌群組成以及腸道微生物的作用等方面進行了綜述，以期為推動水蛭腸道微生物的研究提供理論及方法參考。

1 水蛭腸道的結構

水蛭腸道依據形態和功能可分為前腸、中腸和后腸。前腸由咽和食管組成，主要功能是攝取寄主血液（體液）；中腸由嗉囊和嗉囊盲囊組成，主要功能是貯藏食物（寄主血液）。大多數水蛭的嗉囊有1～12對向兩側伸展的盲囊，其中最后1對最長并且彎向身體的后方。嗉囊是在水蛭攝食后儲存血液的主要區域，可以吸收血液中的水和鹽；后腸由腸和直腸組成。腸可以是1根寬闊的縱管，也可以是具有4對細長的側盲囊，對血液的消化和吸收在此進行。腸的后端通過一括約肌開口在一短而薄壁的直腸上[8]。

2 水蛭腸道微生物的研究方法

2.1 傳統分類鑒定方法

由于腸道微生物個體小、種類多、結構簡單，形態特征上很難區分。以前腸道微生物的研究主要采用微生物分離培養技術，分為直接觀察法和純培養法。在水蛭腸道微生物的研究中主要采用的是純培養法，即使用不同營養成分的固體培養基對可培養的微生物進行分離培養，然后根據微生物的菌落形態及其菌落數來計測微生物的數量及其類型，若要得到種類信息，則需進一步地分離、純化和鑒定[12]。人工培養所能獲得的只有自然環境中很小部分的微生物（0.10%～0.15%），大多數微生物種類由于不能在普通培養基上生長而不能被檢出，一些形態和生化指標也易受到操作方法和判斷主觀性影響，從而影響到鑒定結果的準確性[13]。

2.2 分子生物方法

20世紀60年代，隨著分子技術的發展，越來越多的生物學技術應用到水蛭腸道微生物的研究中來。新的方法大大地降低了對微生物培養的依賴性，能將腸道中無法培養以及難以培養的細菌分離出來，因此廣泛應用于微生物群落結構分析。水蛭腸道微生物研究中較常用的分子生物學技術主要有熒光原位雜交技術、末端限制性片段長多態性和宏基因組技術等[14]。

末端限制性片段長度多態性技術可以分析樣品中微生物的組成和不同微生物的種屬關系，從而進行各種微生物群落之間比較群落的多樣性、結構特征等方面的研究。目前，TRFLP 技術已被廣泛用于分析各種環境中（如腸道和土壤等）某類微生物的群落結構[15-16]，其原理是采用一端熒光標記的引物進行PCR，擴增全長16S rRNA 基因，然后用合適的限制性內切酶消化 PCR產物，由于不同菌的16S rRNA 基因序列存在差異，因此酶切后會產生不同長度特征的限制性片段[17]。該技術具有快速、重復性高、靈敏、高通量等優點，其缺點是由于 PCR 擴增存在偏好性，即使使用通用引物，也有可能忽略微生物生態群落中某些功能重要但數量稀少的細菌[18]。

熒光原位雜交技術是20世紀80年代末在已有放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳學技術，根據核酸堿基互補配對原理，用半抗原標記DNA或者RNA探針與經過變性的單鏈核酸序列互補配對，通過帶有熒光基團的抗體去識別半抗原進行檢測，或者用熒光基團對探針進行直接標記并與目標序列結合，最后利用熒光顯微鏡直接觀察目標序列在細胞核、染色體或切片組織中的分布情況[19]。熒光原位雜交具有安全、快速、靈敏度高、檢測信號強和雜交特異性高等優點，目前已廣泛應用于細胞遺傳學、 腫瘤生物學、基因定位、基因作圖、基因擴增、產前診斷及染色體進化研究等領域[20] 。

2.3 宏基因組技術

宏基因組學（Metagenomics）是指在特定環境樣品中基因組的總和，宏基因組學顯著的特征包括非傳統培養方法獲得環境微生物基因組，所獲得的基因包含可培養的不能培養的微生物的總基因，從而避免了微生物分離培養的難題，能最大限度地挖掘微生物資源，并研究其功能和彼此之間的關系和相互作用，從而揭示其內在規律[21]。宏基因組學研究策略包括宏基因組DNA的提取、宏基因組測序樣品及DNA提取、宏基因組測序和宏基因組文庫的制備[22]。宏基因組學技術克服了傳統培養方法的限制，在微生物多樣性、新基因發現及新生物活性物質等方面展現出了前所未有的魅力，現已被已泛應用于農業、林業、土壤、海洋、人體醫學和藥物等各個領域[23]。

3 水蛭腸道微生物的菌群組成及作用

3.1 水蛭腸道微生物菌群

水蛭腸道的微生物對于攝取的血食的消化有重要關系。以前以培養為基礎的研究認為，醫蛭腸道內的微生物主要是氣單胞菌屬（Aeromonas），而且該屬是水蛭消化道里唯一的共生體[24]。隨著分子生物學技術的發展，越來越多的方法和技術被應用到腸道微生物的研究中。Paul 等通過末端限制性片段長度多態性研究了側紋醫蛭（Hirudo verbana）腸道微生物，證實了側紋醫蛭腸道細菌群體的主導菌是維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）和clone PW3。其中，clone PW3屬于理研菌科（Rikenellaceae）的新種。此外，在腸道中還檢測到細菌有α變形菌門、γ變形菌門、δ變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）[15]。Alison等運用培養和非培養的限制性片段長多態性的方法研究東方醫蛭（Hirudo orientalis）的消化道微生物，結果證實在消化道中的細菌有維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、簡達氣單胞菌（Aeromonas jandaei）、類似于理研菌屬（Rikenella）的菌和脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）[25]。隨著研究技術的進一步發展，近年來有學者將宏基因技術應用到水蛭腸道微生物的研究中。Michele A.Maltz等應用宏基因組的高通量測序進一步對水蛭腸道微生物菌群進行了探究，結果表明消化道內的主要的共生體是：類似于理研菌屬（Rikenella）的菌、維氏氣單胞菌（Aeromonas.veronii）和變形桿菌屬（Proteus）。此外，檢測到的細菌有梭菌屬（Clostridium）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）和梭桿菌屬（Fusobacterium）[26]。

3.2 水蛭腸道微生物的作用

高通量測序技術的發展促進了對大多數不能培養的細菌生理特性、代謝功能及在環境中的作用的研究，采用轉錄組測序技術研究醫蛭腸道微生物的特性[27]。在一些水蛭腸道中發現維氏氣單胞菌是革蘭氏陰性的兼性厭氧菌，并且許多氣單胞菌屬的菌已經鑒定為人以及一些動物包括魚和兩棲類的致病菌[28]，能夠引起傷口感染和敗血癥等，預防性的抗生素能夠減少感染的發病率[29]。最近的研究熱點是探究水蛭腸道微生物菌群與抗菌素的敏感性[30]。

關于水蛭腸道微生物的相關功能，早期的研究者認為腸道微生物有3個主要功能：①輔助血食的消化；②提供必要的營養物質；③抵抗外來致病菌的侵襲[31]。隨后的許多研究表明在腸道里存在宿主產生的蛋白酶，在消化時細菌產生的蛋白酶可能有重要的作用[32]。在后期的研究中發現水蛭所攝食的血液的消化與腸道的微生物的關系可能是提供抵抗外來有害或致病菌的侵入，特定的腸道微生物能夠為消化攝取的血液提供最佳的營養環境[33]。

4 展望

目前，盡管通過傳統培養與非培養的方法在水蛭腸道微生物的研究中取得了一些進展，但腸道微生物與宿主之間的作用機制以及與水蛭素的分泌、水蛭素的質量及保存中的作用等問題研究較少。由于水蛭素在醫學上具有舉足輕重的作用，因此水蛭腸道微生物的功能和作用機制的研究是今后研究的方向。深入了解水蛭腸道微生物群落組成和功能以及腸道微生物對水蛭素的影響機制，對于醫療以及相關腸道疾病的研究都有重要的意義。

參考文獻

[1] ANDERSON K E，SHEEHAN T H，ECKHOLM B J，et al.An emerging paradigm of colony health：microbial balance of the honey bee and hive（Apis mellifera）[J].Insectes Sociaux，2011，58（4）：431-444.

[2] MORAN N A.Symbiosis（A primer）[J].Current Biolology，2006，16：866-71.

[3] LEY R E，HAMADY M，LOZUPONE C，et al.Evolution of mammals and their gut microbes[J].Science，2008，320（5883）：1647-1651.

[4] GILL S R，POP M，DEBOY R T，et al.Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome[J].Science，2006，312（5778）：1355-1359.

[5] TURNBAUGH P J，LEY R E，HAMADY M，et al.The human microbiome project：exploring the microbial part of ourselves in a changing world[J].Nature，2007，449（7164）：804.

[6] UPADHYAY V，POROYKO V，KIM T，et al.Lymphotoxin regulates commensal responses to enable dietinduced obesity[J].Nature Immunology，2012，13（10）：947-953.

[7] 宋大祥，馮鐘琪.螞蟥[M].北京：科學出版社，1978：1.

[8] 楊潼.中國動物志：環節動物門·蛭綱[M].北京：科學出版社，1996：15-37.

[9] 相輝，黃勇平.腸道微生物與昆蟲的共生關系[J].昆蟲知識，2008，45（5）：687-693.

[10] 袁紅霞，張莉芹，馬瑾，等.水蛭藥用成分及主要藥理功效研究進展[J].甘肅醫藥， 2013，32（4）：270-273.

[11] WHITAKER I S，JOSTY I C，HAWKINS S，et al.Medicinal leeches and the microsurgeon：A fouryear study，clinical series and risk benefit review[J].Microsurgery，2011，31（4）：281-287.

[12] 劉淮德.應用微生物分子生態學方法研究對蝦腸道細菌組成及其變化規律[D].北京：中國科學院，2010.

[13] AMANN R I，LUDWIG W，SCHLEIFER K H.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J].Microbiological Reviews，1995，59（1）：143-169.

[14] 黃遵錫.胃腸道微生物及其分子生態學技術研究進展[J].微生物學通報，2014，41（1）：136-145.

[15] WORTHEN P L，GODE C J，GRAF J.Cultureindependent characterization of the digestivetract microbiota of the medicinal leech reveals a tripartite symbiosis[J].Applied and Environmental Microbiology，2006，72（7）：4775-4781.

[16] 葛蕓英，陳松，孫輝，等.土壤細菌群體多樣性的TRFLP分析應用探討[J].中國法醫學雜志，2008，23（2）：104-107.

[17] OSBORN A M，MOORE E R B，TIMMIS K N.An evaluation of terminalrestriction fragment length polymorphism（TRFLP）analysis for the study of microbial community structure and dynamics[J].Environmental Microbiology，2000，2（1）：39-50.

[18] 賈俊濤，宋林生，李筠.TRFLP 技術及其在微生物群落結構研究中的應用[J].海洋科學，2004，28（3）：64-68.

[19] SPEICHER M R，CARTER N P.The new cytogenetics：blurring the boundaries with molecular biology[J].Nature Reviews Genetics，2005，6（10）：782-792.

[20] 王忠華，李旭晨.熒光原位雜交技術在植物學中的應用[J].植物學通報，2001，18（1）：40-45.

[21] 張冰，崔岱宗，趙敏.宏基因組學技術及其在微生物學研究中的應用[J].黑龍江醫藥，2014（2）：267-271.

[22] 斯日古楞，特木侖，明亮，等.宏基因組學及其應用前景[J].中國畜牧獸醫，2014，41（3）：115-118.

[23] LOPEZ J F，SHI Y，TYSON G W，et al.Microbial community gene expression in ocean surface waters[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2008，105（10）：3805-3810.

[24] GRAF J.Symbiosis of Aeromonas veronii biovar sobria and Hirudo medicinalis，the medicinal leech：a novel model for digestive tract associations[J].Infection and Immunity，1999，67（1）：1-7.

[25] LAUFER A S，SIDDALL M E，GRAF J.Characterization of the digestivetract microbiota of Hirudo orientalis，a European medicinal leech[J].Applied and Environmental Microbiology，2008，74（19）：6151-6154.

[26] MALTZ M A，BOMAR L，LAPIERRE P，et al.Metagenomic analysis of the medicinal leech gut microbiota[J].Frontiers in Microbiology，2014，5（151）：1-12.

[27] BOMAR L，MALTZ M，COLSTON S，et al.Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics[J].American Society for Microbiology，2011，2（2）：12.

[28] JANDA J M，ABBOTT S L.The genus Aeromonas：taxonomy，pathogenicity，and infection[J].Clinical Microbiology Reviews，2010，23（1）：35-73.

[29] SIDDALL M E，WORTHEN P L，JOHNSON M，et al.Novel role for Aeromonas jandaei as a digestive tract symbiont of the North American medicinal leech[J].Applied and Environmental Microbiology，2007，73（2）：655-658.

[30] SIVACHANDRAN P，MARIMUTHU K，RAVICHANDRAN M，et al.Antibiotic susceptibility of body surface and gut microflora of two aquatic leech species（Hirudinaria manillensis and Hirudinaria javanica）in Malaysia[J].Journal of Coastal Life Medicine，2013，1（1）：76-80.

[31] GRAF J，KIKUCHI Y，RIO R V M.Leeches and their microbiota：naturally simple symbiosis models[J].Trends in Microbiology，2006，14（8）：365-371.

[32] ROTERS F J，ZEBE E.Proteinases of the medicinal leech，Hirudo medicinallis：Purification and partial characterization of three enzymes from the digestive tract[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Comparative Biochemistry，1992，102（3）：627-634.

[33] NELSON M C，GRAF J.Bacterial symbioses of the medicinal leech Hirudo verbana[J].Gut Microbes，2012，3（4）：322-331.