基質金屬蛋白酶2，9，12與慢性阻塞性肺疾病的臨床研究

李敏王宇宏李巍

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基質金屬蛋白酶2，9，12與慢性阻塞性肺疾病的臨床研究

李敏①王宇宏①李巍①

【摘要】目的：探討慢性阻塞性肺疾病（COPD）與血清基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶12（MMP-12）的相關性。方法：選取COPD患者80例，其中急性加重期（AECOPD）40例，臨床緩解期40例，健康對照者45例，采用雙抗夾心ELISA法測定所有研究對象的血清MMP-2、MMP-9、MMP-12含量，并做統計學分析。結果：COPD患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平均明顯高于健康對照者，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；且AECOPD患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平顯著高于臨床緩解期患者（P＜0.01）。穩定期COPD患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平與第1秒用力呼氣容積（FEV1）成負相關（r＝-0.529，P＜0.01；r＝-0.385，P＜0.05；r＝-0.627，P＜0.01）。結論：COPD患者血清MMP-2、MMP9、MMP-12水平均明顯升高，且與疾病嚴重程度成正相關。

【關鍵詞】基質金屬蛋白酶； 慢性阻塞性肺疾病； 第1秒用力呼氣容積

①吉林省吉林市中心醫院 吉林 吉林 132011

【Key words】 Matrix metalloproteinase； Chronic obstructive pulmonary disease； Forced expiratory volume in first second

First-author’s address：The Central Hospital of Jilin City，Jilin 132011，China

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是持續性氣流受限為特征的可以預防和治療的疾病，其氣流受限呈可逆性進行性進展，與氣道和肺組織對香煙煙霧等有害氣體或顆粒的異常慢性炎癥反應。COPD的發生與炎癥機制、蛋白酶和抗蛋白酶失衡、氧化應激機制以及自主神經系統功能紊亂、營養不良等有關。氣道壁纖維化、細支氣管平滑肌增生和肺泡壁變薄、肺泡腔變大是COPD氣道重塑的主要病理特征。支氣管肺泡組織中彈性成分的降解是肺氣腫發生發展的最主要原因。細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的合成與降解之間的平衡對維持肺泡結構和肺功能具有重要作用。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是調節ECM的主要限速酶，在維持正常組織結構、組織細胞分化、細胞信號傳導、血管形成等多種病理生理過程中發揮著重要作用[1]。蛋白酶增加或抗蛋白酶不足均可以導致肺組織機構的破壞，產生肺氣腫。自上個世紀60年代提出蛋白酶和抗蛋白酶失衡是導致COPD的重要機制以來，MMPs在COPD的發病過程中得到深入研究。本試驗基于理論與基礎研究，通過測定COPD患者血清的MMP-2、MMP-9、MMP-12的水平，探索MMPs在COPD中的表達及其相關性。

1　資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年12月-2014年12月在本院特診呼吸科住院的COPD患者80例，所有入選對象均按照《慢性阻塞性肺疾病指南》標準[2]，入組前均簽署知情同意書。按患者入院時病情輕重分為急性發作期（AECOPD）、臨床緩解期，其中急性加重期40例，臨床緩解期40例；男46例，女34例，平均年齡（72.00±11.00）歲。同時選取同期健康體檢對象45例作為健康對照組。詳細采集所有入選對象的一般資料及既往病史（性別、年齡、吸煙史、家族史），行心電圖、肺CT、肺功能、肝功、腎功能、心彩等檢查。排除標準：急性心、腦血管疾病、急性肺栓塞、風濕結締組織疾病、嚴重肝腎功能不全以及其他呼吸系統疾病以及惡性腫瘤等疾病患者。根據肺功能檢查結果，FEV1占預計值的百分比將臨床緩解期40例患者分為4組。輕度組，FEV1％ pred≥80％，共5例，平均年齡（65.56±8.23）歲；中度組，50％≤FEV1％ pred＜80％，共18例，平均年齡（68.30±9.18）歲；重度組，30％≤FEV1％ pred＜50％，共11例，平均年齡（72.66±9.34）歲。極重度組，FEV1％ pred＜30％，共6例，平均年齡（75.12±8.54）歲。健康對照組45例，平均年齡（61.24±9.54）歲。COPD組與對照組的年齡、性別、高血壓、吸煙、體重等基線資料比較差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法 所有研究對象于入院24 h內抽取靜脈血3 mL，2000 r/min離心20 min收集上層血清，采用雙抗體夾心ELISA法測定血清MMP-2、MMP-9、MMP-12含量。檢測試劑盒由上海酶聯生物技術有限公司提供，嚴格按照試劑盒操作進行。

1.3統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗，兩因素之間相關性分析采用Pearson直線相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1COPD組與對照組血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平比較 COPD組患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），AECOPD組患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平均顯著高于臨床緩解期組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　COPD組與對照組血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平比較（±s） ng/mL

表1　COPD組與對照組血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平比較（±s） ng/mL

*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較；△與臨床緩解期組比較，P＜0.05

組別　MMP-2　 MMP-9　 MMP-12 AECOPD組（n＝40）4.50±1.26**△5.02±1.34**△5.88±1.78**△臨床緩解期組（n＝40）3.07±0.65*　3.47±0.88*　3.32±0.89*對照組（n＝45）　1.31±0.43　 1.13±0.32　 0.94±0.27

2.2血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平與FEV1相關性分析 穩定期COPD患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平與FEV1成負相關（r＝-0.529，P＜0.01；r＝-0.385，P＜0.05；r＝-0.627，P＜0.01），見表2。

表2　血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平與FEV1相關性分析（±s） ng/mL

表2　血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平與FEV1相關性分析（±s） ng/mL

組別　MMP-2　MMP-9　 MMP-12輕度組（n＝5）　1.50±1.09　 1.75±0.68　 1.24±1.02中度組（n＝18）　2.12±1.08　 2.02±1.05　 2.12±1.13重度組（n＝11）　2.40±1.27　 2.89±0.98　 4.02±1.28極重度組（n＝6）　3.96±1.39　 3.65±1.26　 4.46±1.49

3　討論

COPD是以ECM破壞、組織纖維化為特點的慢性炎癥性疾病，其發病率及致殘率高，嚴重影響患者生活質量，全球死因居于第四位。1992年在我國北部和中部地區對102 230名農村成年人進行調查，COPD患病率為3％；近年來對我國地區20 245名成年人進行調查，COPD的患病率占40歲以上人群的8.2％，預計到2020年時COPD將占世界疾病經濟負擔的第五位[3]。目前COPD發病機制主要為炎癥反應、氧化應激、自主神經功能失調、蛋白酶—抗蛋白酶失衡。Montagnana等[4]認為肺泡壁基底膜斷裂，而分泌細胞通過斷裂的基底膜侵入肺泡，導致肺泡細支氣管化，促進肺氣腫形成。現已證明，破壞肺泡壁基底膜的蛋白酶有中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶、MMPs、基質金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）等。MMPs是一個大家族，因其需要Ca2＋、Zn2＋等金屬離子作為輔助因子而得名。MMPs 有26個成員，編號分別為MMP1～26。根據作用底物以及片斷同源性，將MMPs分為6類，分別為膠原酶、明膠酶、彈性蛋白酶類、間質溶解素、模型蛋白酶類和其他型。它們主要由中性粒細胞（PMN）、肺泡巨噬細胞（AM）和呼吸道上皮細胞產生，能夠降解肺實質ECM的所有成分，包括彈性蛋白、膠原蛋白、蛋白多糖、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等[5]。膠原酶包括MMP-2、MMP-9，作用底物為基底膜Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ膠原酶，纖維粘連蛋白、明膠等。MMP-12屬于彈性蛋白酶類，作用底物為彈性纖維、纖維粘連蛋白等。MMP-2、MMP-9及MMP-12在降解ECM占主要地位[6]。

MMP-9在正常肺組織中并不產生，當受到各種因素刺激時，支氣管上皮細胞、肺泡Ⅱ型細胞、成纖維細胞及內皮細胞等均可產生。MMP-9加速呼吸道壁ECM和基底膜崩解，使氣道壁失去正常結構，還能促進炎癥細胞積聚于氣道壁，并釋放炎癥因子，加重呼吸道的炎性反應[7]。它還能刺激并激活生長因子，促進血管生成、成纖維細胞增生，引起氣道重塑，導致肺組織的破壞。Calikoglu等[8]研究發現穩定期COPD患者血清MMP-9水平高于正常對照組，發現大部分COPD患者的血液、痰液以及肺組織活檢中MMP-9的水平與活性均較高。Papakonstantinou等[9]納入97例COPD患者進行試驗，其中44例為AECOPD，測定COPD患者MMP9、TIMP-1、TIMP-2含量、結構，AECOPD患者支氣管肺泡灌洗液中上述指標均顯著升高，且與肺功能呈負相關。Linder等[10]入選594例COPD患者進行研究，對照組為948例健康者，結果COPD 組MMP-9中位數535 ng/mL，對照組為505 ng/mL （P＝0.017）。校正年齡、性別、吸煙量等后，發現MMP-9水平與FEV1％顯著相關（P＝0.033）。吸煙是COPD發病中最主要的危險因素，研究表明80％～90％的COPD患者有吸煙史，而MMP-9與吸煙的相關性也得到證實：吸煙在COPD的發病機制中作為直接刺激因素，有可能導致蛋白酶增多及活性增強。Aviles等[11]報道，COPD患者痰液中MMP-9的濃度顯著高于健康吸煙者，健康吸煙者痰液中MMP-9濃度高于健康非吸煙者，且該濃度與他們吸煙量有一定相關性。MMP-2在正常肺組織中表達極少，主要來源于中性粒細胞、腫瘤細胞、單核細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞等[12]，其在降解細胞間基質成分及基底膜的Ⅳ型膠原中有“鉆頭”的作用。MMP-2在所有MMPs中分布最廣泛，當組織受損或細胞惡變時MMP-2表達增加，其表達增加同時伴有蛋白水解酶活性增強，而后者加速了肺泡壁的破壞。Chen等[13]報道健康人與COPD 0、Ⅰ、ⅡA、ⅡB及Ⅲ級五組MMP-2水平分別為（0.7±0.4）、（4.0±0.9）、（4.5±1.5）、（7.7±3.1）、（11.9±3.5）、（18.5±5.0）microg/L（P＜0.01）。王小莉等[14]研究表明，被動吸煙大鼠支氣管肺泡灌洗液MMP-2的活性和表達明顯增加（P＜0.01）。孔英君等[15]研究MMP-2、MMP-9與COPD氣流阻塞的關系，結果COPD組MMP-2、MMP-9 mRNA均顯著高于對照組（P＜0.01）。MMP-2、MMP-9蛋白廣泛表達在支氣管肺泡組織，而對照組表達非常弱；肺組織MMP-2mRNA及蛋白表達與FEV1占預計值％、FEV1/FVC均呈負相關。

MMP-12又被稱為人巨噬細胞彈性蛋白酶，體內許多細胞因子（如白介素-4、粒細胞集落刺激因子、低密度脂蛋白）均能誘導或刺激MMP-12在轉錄水平的表達，其具體激活機制目前還不清楚。1993年Shapiro等[16]成功在吸煙者的肺泡巨噬細胞中克隆出MMP-12的cDNA序列。MMP-12不僅能夠降解富含于肺及動脈壁的細胞外基質的大多數成分，還能激活其他MMPs，使蛋白水解的作用放大[17]。1975年Werb等[18]首次在小鼠腹膜巨噬細胞中發現MMP-12基因；敲掉該小鼠的MMP12基因則能夠阻止吸煙小鼠的肺氣腫模型形成，認為MMP-12在動物COPD發生發展過程中起重要作用。Hunninghake等[19]報道MMP-12與吸煙者的COPD發病有關，且與COPD患者FEV1下降存在一定關系。Demedts等[20]發現肺功能輕到中度的COPD患者痰液中MMP-12濃度及活性明顯高于對照組（包括吸煙者、不吸煙者以及既往吸煙者）。Yu等[21]的試驗通過對1751例COPD患者及2472例健康者研究發現，MMP12 rs652438基因為COPD發生的危險因素，MMP12基因多態性與COPD發生密切相關。

綜上所述，MMPs作為細胞外彈性蛋白和膠原蛋白的內切酶，與COPD的發生有密切關系。通過本試驗驗證了MMP-2、MMP-9、MMP-12在COPD患者中顯著升高，其升高水平與肺功能嚴重程度成正相關。TIMPs與MMPs基因多態性在COPD發生發展過程中又起到怎樣的作用，尚需要大量的臨床研究來證實，從而為COPD的防治提供理論基礎及臨床依據。而TIMPs有望成為延緩COPD進展的有效手段之一[6]。

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Clinical Research of Matrix Metalloproteinase 2，9，12 with Chronic Obstructive Pulmonary Disease

/LI Min，WANG YU-hong，LI Wei.//Medical Innovation of China，2016，13（02）：044-047

【Abstract】Objective：To investigate the correlation of patients with chronic obstructive pulmonary disease（COPD） with matrix metalloproteinase2（MMP-2），matrix metalloproteinase9（MMP-9） and matrix metalloproteinase 12（MMP-12） in the serum.Method：Double-antibody sandwich method （ELISA） was used to measure the concentrations of MMP-2，MMP-9，MMP-12 in the serum of 80 patients with COPD，including acute exacerbation （AECOPD） for 40 cases and clinical remission for 40 cases.45 healthy people were selected as the healthy control group.The statistical analysis was conducted.Result：The concentrations of MMP-2，MMP-9，MMP-12 in patients with COPD were significantly higher than those of the healthy control group，the differences were statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.These index in AECOPD group were significantly higher than those in the clinical remission group（P＜0.01）.The concentrations of MMP-2，MMP-9，MMP-12 in stable COPD patients were passively correlated with forced expiratory volume in first second（FEV1）（r＝-0.529，P＜0.01；r＝-0.385，P＜0.05；r＝-0.627，P＜0.01）.Conclusion：The serum level of MMP-2，MMP-9，MMP-12 in COPD patients are obviously higher，and they are positively correlated with the severity of the disease.

收稿日期：（2015-07-17） （本文編輯：歐麗）

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.02.013

通信作者：李敏