大巖桐試管正常苗與玻璃化苗葉表結構比較

韋梅琴 +唐楠++張文蓮+胡鮮寧

摘要：以大巖桐試管苗為試材，用改良過的過氧化氫-醋酸離析法制片，光學顯微鏡下觀察并比較試管正常苗與玻璃化苗的葉表結構。結果發現，2類試管苗的上下表皮均有氣孔器、腺毛、表皮毛的分布，但它們的數量與氣孔特征具有顯著差異。與試管正常苗相比，玻璃化苗上下表皮細胞單位面積表皮毛、腺毛、氣孔器密度減少，保衛細胞形態異常，氣孔器的長度差異不明顯，但氣孔器寬度、相對開張度均較正常苗顯著增大，是正常試管苗的2倍。此外，玻璃化苗與外界進行氣體和水分交換量明顯大于正常苗，從而導致玻璃化苗持水能力弱、易失水，這是試管玻璃化苗在繼代、生根培養中不能正常生長、極易死亡的主要原因。

關鍵詞：大巖桐；試管正常苗；玻璃化苗；葉表皮；比較

中圖分類號： Q945.45文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0093-03

大巖桐（Sinningia speciosa）屬苦苣苔科苦苣苔屬多年生草本植物，別稱落雪泥，原產于巴西，是點綴和裝飾室內及窗臺的理想盆花。目前圍繞大巖桐做了過量表達CFL以及激素處理改變花的發育與調控作用及其機理研究、再生體系的建立和優化及遺傳轉化等研究[1-9]；大巖桐常規的繁殖方法一般用播種、枝插、分球莖等方法來進行，但繁殖系數低，滿足不了人們的需求。而利用組織培養的方法可有效提高繁殖系數，為大巖桐的快繁提供保障；但在組織培養過程中不可避免地出現異常苗，胡鑫等對大巖桐再生植株經過連續組織培養以后，發現了如葉序的改變和花的同源異型現象等表型突變[9]，在大巖桐后期的繼代培養中見到了玻璃化苗，其增殖能力較低，難以生根成苗，對組培體系的穩定性和種苗生產造成嚴重的影響[2，9]。本試驗針對大巖桐試管正常苗和玻璃化苗的葉片，進行葉表結構比較，試圖從解剖學的角度探討試管玻璃化苗在繼代培養中不能正常生長、極易死亡的原因，為深入研究試管玻璃化苗的機理提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

取溫室中生長較為健壯的大巖桐莖尖，經過初代培養、繼代培養獲得試管正常苗與試管玻璃化苗。

1.2方法

以大巖桐試管正常苗和試管玻璃化苗為試材，2類苗各取6株，從頂端向下取第3張葉片，將葉片中上部主葉脈兩側部位剪成1 cm左右的方塊。將上述葉片方塊用改良過的過氧化氫-醋酸離析法對上、下表皮進行離析，1%番紅染色，中性樹膠封片；在奧特BK-5000（OPTEC-BK5000）光學顯微鏡下觀察、拍照；利用測微軟件TSView對上、下表皮的氣孔進行觀察計數，測定氣孔的長和寬，氣孔開口長、開口寬等指標；所得數據均為20個視野下的平均值。

氣孔密度：

[JZ]D=S/M。

式中：D為氣孔器密度；S代表整個視野內的氣孔數目；M代表每個視野的面積。

氣孔相對開張度：

[JZ]氣孔相對開張度=氣孔開口寬/氣孔開口長×100%。

1.3數據分析

數據用Excel2003及SPSS 13軟件進行方差分析。

2結果與分析

2.1大巖桐試管正常苗和玻璃化苗形態特征

取溫室中生長的大巖桐莖尖，經過離體培養獲得無菌初代培養物，在初期的培養中試管苗生長健壯無異常現象，在后期的繼代培養中才可見玻璃化苗，并隨培養代數增加，玻璃化加重。離體培養條件下的試管正常苗和試管玻璃化苗的葉的形狀和株高差異不大，其株高均在7～8 cm左右，葉對生，卵圓形或長橢圓形，有鋸齒；但葉片的大小與顏色有明顯的不同，即試管正常苗的葉片小而厚、葉色呈深綠色，而玻璃化苗的葉片大而薄，整個葉片明顯失綠，色澤呈粉紅色，僅在葉片的葉脈附近可見少量綠色，未有腫脹或明顯的水浸狀，這類苗增殖分化能力較低，難以進行生根培養（圖1）。

2.2葉表結構

大巖桐的葉表結構由表皮細胞、表皮毛及氣孔器等幾部分組成。2類試管苗的葉表結構差異主要表現在表皮細胞的形狀、氣孔復合體的大小、密度等方面（表1、圖2）。

2.2.1表皮細胞的形狀及其附屬物

光學顯微鏡下2類試管苗葉的表皮細胞形狀明顯不同，即試管正常苗葉片的上、下表皮細胞呈多邊形，垂周壁平直或弓形；試管玻璃化苗的上、下表皮細胞呈不規則形狀其垂周壁上表皮的為淺波形，下表皮的為深波形。大巖桐試管苗表皮細胞上的附

從氣孔長/寬的值看，大巖桐試管正常苗上表皮比值為0.96，下表皮比值為1.01，比值都在1左右，說明大巖桐試管正常苗的氣孔器近乎圓形；玻璃化苗上表皮比值為0.72，下表皮比值為0.88，可見氣孔形狀呈扁圓形（表2、圖2）。同時還存在氣孔發育不完善現象：（1）氣孔器開口極大，開口形狀有長方形、月牙形與圓形等；（2）2個保衛細胞發育不平衡，大小不等（圖2-E至圖2-H）。試管正常苗下氣孔的相對開張度0.51，玻璃化苗的0.98，開口近乎圓形；試管正常苗上氣孔的相對開張度0.34，玻璃化苗的0.64，二者差異顯著。可見，不論是上表皮還是下表皮，玻璃化苗的氣孔的相對開張度是正常試管苗的2倍。

2.2.2.2氣孔密度

大巖桐試管正常苗的上表皮氣孔密度（188.66±14.13）個/mm2，下表皮氣孔密度（191.46±21.90）個/mm2，上、下表皮細胞之間氣孔密度差異不明顯；試管玻璃化苗的上表皮氣孔密度為（135.31±20.67）個/mm2，下表皮氣孔密度（175.66±15.36）個/mm2（表2）。由此可見，同一類型的試管苗表現為下表皮氣孔數量大于上表皮的；不同類型的試管苗，不論上表皮還是下表皮均表現為試管正常苗的氣孔密度多于試管玻璃化苗的氣孔密度，兩者差異顯著，這與槐樹和絲石竹中的結果[10-11]相反。

3結論與討論

玻璃化苗是植物組織培養中特有的一種生理性病變，在組織培養中普遍存在[10-11]。它作為一種畸型苗，在形態特征上一般表現為植株矮小、莖葉腫脹畸形、組織半透明水浸狀、葉色為海綠色、組織質脆易斷等[12]。大巖桐玻璃化苗外部形態與正常苗無明顯差異，植株具有明顯的節與節間，葉片大而薄，沒有腫脹多汁現象，整個葉片明顯失綠，色澤呈粉紅色，僅在葉片的葉脈附近可見少量綠色，未有腫脹或明顯的水浸狀。P[KG-*5]a[DD（-1*2][HT6]^[DD）]ques認為，玻璃化苗可分為外觀形態明顯異常與基本無異常2種類型，大巖桐玻璃化苗形態與后者相似，屬于基本無異常類型[13]。這可能受培養條件的影響，使得外植體在培養基中分別導致非多汁和多汁玻璃苗的產生[14]，同時也與植物種類、基因型的差異有關，長期的組織培養導致內源激素水平發生改變，隨著培養時間的延長，瓶內氣體積累不斷增加，引起植物對物質的利用受阻，從而導致試管玻璃化的發生[15]。

葉片表皮是植物體和外界環境接觸的最外層組織，氣孔器是調節氣體出入和水分蒸騰的重要結構，與植物的光合作用、蒸騰作用直接相關[16]。2類試管苗氣孔器的長度變化不明顯，而氣孔器的寬度和長寬比差異顯著，玻璃化苗的氣孔相對開張度較正常苗顯著增大，是正常試管苗的2倍，說明環境對2類試管苗的氣孔特性的影響程度不同。槐樹、絲石竹、蘋果的離體培養研究表明，玻璃化后葉片上、下表皮氣孔數明顯增多[10-11，17]，而筆者的結果與之相反，但與芥菜的玻璃苗結論[18]一致，即單位面積內氣孔數減少，這可能與玻璃化苗葉片的大小有關。與試管正常苗相比，大巖桐玻璃化苗葉面積顯著增大，使得氣孔在單位葉面積內的分布量下降，可見氣孔密度的變化與葉面積的變化有一定的聯系。

此外，玻璃化苗與正常苗在內部解剖結構上也存在明顯差異。與正常試管苗相比，玻璃苗葉片的機械組織較弱、維管束組織發育不良[11，17，19-20]，從而影響體內生長素的極性運輸，使得玻璃化苗的內源生長素分布狀況發生改變，導致營養物質和水分運輸不暢通[20-21]；葉表附屬物——表皮毛及腺毛較少；氣孔器異常、發育不完全，開口較大。這些特點顯示出玻璃化苗與外界進行氣體（包括水、氣）交換的途徑明顯較正常苗的增大[14]，持水能力較弱；同時葉片葉色褪綠，不能行使正常的光合作用，最終導致其新陳代謝和生理功能失調[22-23]，這是試管玻璃化苗在繼代培養、生根培養中不能正常生長，極易死亡的主要原因之一[17]。因此，在大巖桐試管苗的培養過程中，控制繼代培養次數對減少玻璃化的發生至關重要。玻璃化的產生也與培養基成分、培養條件等密切相關，因此如何控制這類物質的用量以防止大巖桐試管苗玻璃化的發生有待進一步研究。

參考文獻：

[1]曹桂萍，王建美. 大巖桐的組織培養與快速繁殖研究[J]. 山東農業科學，2002（5）：16-16，22.

[2]徐全樂，謝亞紅，劉文婷，等. 大巖桐高頻再生體系建立的兩種途徑[J]. 園藝學報，2010，37（1）：135-140.

[3]邵果園，梁國魯，王力超，等. 大巖桐快繁體系優化研究[J]. 西南大學學報（自然科學版），2007，29（4）：127-130.

[4]周鍾信，李建科，朱惠珍，等. 大巖桐開花生物學的觀察及快繁技術的研究[J]. 天津農學院學報，1998，5（2）：1-8.

[5]李達. 大巖桐再生體系的建立及遺傳轉化的研究[D]. 泰安：山東農業大學，2013.

[6]張明哲. 大巖桐過量表達CFL以及激素處理改變花的發育[D]. 杭州：浙江大學，2008.

[7]李曉燕. miR159和miR172表達對大巖桐花發育的調控作用及其機理研究[D]. 杭州：浙江大學，2012.

[8]郭麗. 大巖桐遺傳轉化體系的建立與LEA蛋白基因的導入[D]. 重慶：西南大學，2008.

[9]胡鑫，徐全樂. 連續組織培養引起大巖桐再生植株的表型變化[J]. 西北農業學報，2010，19（5）：167-170.

[10]王紀方，李錫香，賈春蘭，等. 絲石竹玻璃苗生理特性和形成機理初探[J]. 農業生物技術學報，5（1）：72-78.

[11]王喆之，胡正海. 槐樹試管正常苗與超度含水態苗莖葉的比較形態學研究[J]. 植物學報，1997，39（7）：647-652.

[12]Ziv M. Vitrification：morphological and physiological disorders of plants[M]//Debergh P C，Zimmerman R H. Micropropagation，technology and application. Dorderecht：Kluwer Academic Publ，1991：45-70.

[13]Pa[DD（-1*2][HT6]^[DD）]ques M. Vitrification and micropropagation：causes，remedies and prospects[J]. Acta Horticulturae，1991，289：283-290.

[14]Pa[DD（-1*2][HT6]^[DD）]ques M，Boxus P.A model to learn “vitrification”，the rootstock apple M.26 present results[J]. Journol of Geophysical Research Oceans，1991，96（C4）：7023-7048.

[15]Sriskandarajah S，Serek M. Regeneration from phylloclade explants and callus cultures of Schlumbergera and Rhipsalidopsis[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2004，78（1）：75-81.

[16]馬書榮，閻秀峰，陳伯林，等. 遮光條件下裂葉沙參和泡沙參氣孔行為的對比研究[J]. 植物研究，2000，20（1）：63-68.

[17]葛紅娟，梁美霞，戴洪義. 玻璃化與正常蘋果試管苗的葉片和莖的顯微結構比較[J]. 植物生理學通訊，46（3）：223-227.

[18]陳國菊，雷建軍. 芥菜離體培養中玻璃化機理的研究[J]. 西南農業大學學報，22（3）：237-239.

[19]常有宏，張玉嬌，李曉剛，等. “黃冠”梨正常試管苗與玻璃化苗生理生化及超微結構的比較研究[J]. 園藝學報，2011，38（2）：225-232.

[20]韋梅琴，鄭江偉. 東方百合試管正常苗與玻璃苗葉片解剖結構的比較[J]. 北方園藝，2007，（12）：203-205.

[21]梁海曼，周菊華. 試管苗玻璃化現象的生理生化和機理探討[J]. 武漢植物學研究，12（3）：281-288.

[22]楊俊英，羅慶熙，宋明，等. 大蒜試管苗玻璃化機理的研究[J]. 西南農業學報，2005，18（6）：801-805.

[23]李云，田硯亭，羅曉芳. 珠美海棠試管苗玻璃化發生機理的初步研究[J]. 北京林業大學學報，18（1）：52-58.