慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者呼吸道病毒分布及危險因素分析

郝璐 張志亮 趙玲 左麗娜

[摘要] 目的 探討慢性阻塞性肺疾病急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）呼吸道病毒感染特點及危險因素。 方法 納入2017年5月～2019年6月在徐州醫科大學附屬醫院呼吸內科住院的患者。采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測患者病毒感染情況，記錄患者一般情況、合并癥及實驗室檢查結果，應用Logistic回歸分析探討病毒感染的危險因素。 結果 共收集 AECOPD患者107例。PCR病毒檢測陽性例數41例（38.32%）。多因素Logistic回歸分析顯示，COPD急性加重患者病毒感染的危險因素為1年內急性加重次數（P=0.035）、煙草暴露（P=0.032）、糖尿?。≒=0.001）、呼吸衰竭（P=0.075）四種因素。 結論 AECOPD 患者呼吸道病毒感染以鼻病毒及流感病毒最為常見。AECOPD 患者呼吸道病毒感染的重要危險因素是1年內急性加重次數、煙草暴露、糖尿病及呼吸衰竭，對于危險因素的識別及預防可降低 AECOPD 發生率。

[關鍵詞] 慢性阻塞性肺疾病;急性加重;呼吸道病毒;危險因素

[中圖分類號] R725.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）36-0048-04

Prevalence of respiratory viral infection and risk factors in patients with acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease

HAO Lu? ?ZHANG Zhiliang? ?ZHAO Ling? ?ZUO Li'na

Department of Respiratory Medicine， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University， Xuzhou? ?221000， China

[Abstract] Objective To investigate the characteristics and risk factors of respiratory virus infection in acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease （AECOPD）. Methods Patients hospitalized in the respiratory department of Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University from May 2017 to June 2019 were included in this study. Polymerase chain reaction （PCR） was applied to detect the virus infection in patients， and the general situation， complications and laboratory test results were recorded. Logistic regression analysis was used to identify the risk factors of virus infection. Results A total of 107 patients with AECOPD were collected， of whom 41 cases （38.32%） were positively confirmed by PCR. Multivariate Logistic regression analysis showed that the risk factors of virus infection in COPD patients with acute exacerbation were acute exacerbation times in 1 year（P=0.035）， tobacco exposure（P=0.032）， diabetes mellitus（P=0.001）， respiratory failure（P=0.075）. Conclusion Rhinovirus and influenza virus are the most common respiratory virus infections in AECOPD patients. The key risk factors of respiratory virus infection in patients with AECOPD are the number of acute exacerbation in 1 year， tobacco exposure， diabetes and respiratory failure. The identification and prevention of risk factors may reduce the incidence of AECOPD.

[Key words] Chronic obstructive pulmonary disease; Acute exacerbation; Respiratory virus; Risk factors

慢性阻塞性肺疾?。╟hronicobstructive pulmonary disease，COPD）是世界范圍內發病率和死亡率最高的疾病之一。該疾病的臨床病程因病情反復急性加重，導致呼吸功能螺旋式下降，引起癥狀加重和死亡風險增加[1]。越來越多的證據表明，大多數COPD病情惡化與呼吸道病毒和細菌感染有關[2]。對AECOPD患者呼吸道病毒分布和危險因素研究，可為有效預防AECOPD提供重要依據。本研究通過收集患者鼻拭子標本，運用聚合酶鏈反應技術擴增標本中病原學特異性DNA，尋找COPD急性加重患者的呼吸道病毒病特點，并分析造成感染的危險因素，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月～2019年6月在徐州醫科大學附屬醫院呼吸內科住院的患者為研究對象。根據診斷標準及排除標準，篩選慢阻肺急性加重患者107例，所有患者入選前均知情同意并簽署知情同意書。

1.1.1 納入標準? ①患者有吸煙、粉塵等危險因素暴露史;慢性咳嗽、氣喘病史>2年，每年持續發作>3個月;②呼吸道癥狀較平日加重，如咳嗽頻率增加，咳膿性痰，憋喘加重，需要改變治療方案。③吸入舒張藥物后肺功能FEV1/FVC<70%;④發病至入院前未使用抗感染藥物。

1.1.2 排除標準? ①合并支氣管哮喘、肺炎、活動性肺結核、肺癌、肺栓塞、肺膿腫、彌漫性間質性肺病、氣胸等其他肺部疾病;②嚴重的心、肝、腎等臟器功能不全或其他惡性腫瘤;③嚴重的呼吸衰竭，需有創性氣管插管，呼吸機支持患者。④無法完成慢阻肺評估問卷（chronic obstructive pulmonary assessment test，CAT）、改良英國醫學研究學會呼吸困難指數問卷（modified medicalresearch council scale，mMRC）及微型營養評估問卷（micro nutritional assessment，MNA）。

1.2 方法

入院當日采集患者鼻拭子標本，運用聚合酶鏈反應技術檢測 11種呼吸道病毒。包括：鼻病毒（rhinovirus，HRV），流感病毒甲型、乙型（influenza virus，IV A/B），副流感病毒 1、2、3及4型（parainfluenza virus，PIV 1/2/3/4），呼吸道合胞病毒 A、B型（respiratory syncytial virus，RSVA/B），人類偏肺病毒（human meta-pneumo virus，HMPV），腺病毒（adenoviridae，ADV）。

1.2.1 儀器及試劑? 熒光PCR擴增儀：美國羅氏公司Light cycler480;低溫高速離心機：意大利ALCPM180R型，微量恒溫器：北京萬通達科技有限公司，熒光顯微鏡：日本Olympus公司;病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒：QIAamp ViresDNA/RNA Kit;呼吸道病原體多重熒光定量RT-PCR/PCR反應試劑盒：美國Roche公司。PCR純化試劑盒：QIAquick PCR purification Kit;蛋白酶K上海如吉生物科技有限公司，RNA助沉劑：上海研生實業有限公司，無RNA酶水：美國ThermoFisher公司。

1.2.2 核酸提取? 應用病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒提取鼻拭子標本中的DNA和RNA。取咽試子標本液200 μL，用25 μL蛋白酶K消化，每管加入28 μg RNA助沉劑，乙醇沉淀后，加入硅膠柱中吸附，洗滌后經6700×g離心，用50 μL無RNA酶水洗脫硅膠柱中的核酸。提取病毒核酸-70℃冰箱保存。

1.2.3 RT-PCR步驟? 應用熒光定量RT-PCR/PCR反應試劑盒，以反應混合液9.8 μL、酶混合液0.2 μL及模版RNA 10 μL制備反應體系;反應條件：①42℃逆轉錄30 min;②92℃變性3 min;③92℃ 10 s，45℃ 30 s，72℃ 1 min，循環5次;④92℃ 10 s，60℃ 30 s，循環40次;延伸階段采集熒光信號，擴增片段在450 bp為HRV，212 bp為IVA，362 pb為IVB，416 pb為HMPV，279 pb為RSVA，180 pb為RSVB，230 pb為PIV1，170 pb為PIV2，260 pb為PIV3，335 pb為PIV4，450 pb為ADV。

引物序列（5-3）：HRV 上游GGTGTACCTCTCTACTCTC下游CTCTGACTAAGGGGATTTTG;IVA上游CAGAGACTTGAAGATCTCTTTGCTGG下游GCT-CTGTCCATGTTATTTG;IVB上游 AAAATTACACTG-TTGGTTCGGTG下游AGCGTTCCTAGTTTTACTTG;PIV1型 上游TGTAGGAAGTGGGATAGATTGAAA下游GTGTCGCCTTGGAGCGGAGTT;PIV 2型上游AAGTGACAACCAGCAGAGATTCAA下游TGTTGGAACTC-TTCACTGCTCATAC;PIV3型上游CAACCATATGCTGCGCTATACC下游CAAGACCTCCATATCCGAGAA-ATATT;PIV4型上游ATGGGCCGTATCAACACTC-CAG下游GGTTTAACCCAACCTTCACATCAT;RSVA 上游GGAACAAGTTGTTGGTTTATGAATATGC下游TTCTGCTGCAAGTCTAGTACACTGTAGT;RSVB 上游GGTGTACCTCTGTACTCTCGGGACCAA下游TGGCCCCATTAAATGTGTCCTGCCTGAA;HMPV上游CCCTTTGTTTCAGGCCAA下游GCAGCTTCAACAGTA-GCTG;ADV上游 CACGGTGGGGTTTCTAAACTT下游GCCCCAGTGGTCTTACATGCACA。

1.3 觀察指標

1.3.1 收集患者的臨床信息? 包括年齡、性別、煙草暴露、體育鍛煉、規律用藥、急性加重次數、合并癥（糖尿病、高血壓、冠心病、呼吸衰竭）。

1.3.2 營養狀態評估? 采用Guigoz等[3]制定的MNA問卷對患者營養狀態進行評估，MNA問卷分兩個部分：營養篩檢共6項內容，每項0～3分，一般評估共12項內容，每項0～2分，MNA問卷總計30分。總分≥24分營養狀態良好;總分17～23分存在營養不良風險;總分<17分明確存在營養不良。

1.3.3 呼吸困難程度評估? 采用Jones等[4]制定的CAT問卷及mMRC問卷對患者穩定期狀態及呼吸困難進行評估。CAT問卷共8項，每項0～5分，總分0～40分，得分越高呼吸困難程度越嚴重。mMRC問卷：0級：僅在費力運動時出現呼吸困難;1級：平地快步行走或爬小坡時出現氣短;2級：由于氣短，平地行走比同齡人慢或需要停下;3級：在平地行走100 m左右或數分鐘后需要停下來喘氣來喘氣;4級：因嚴重呼吸困難以至于不能離開家，或在穿衣服/脫衣服時出現呼吸困難。評定級別越高呼吸困難程度越嚴重。

1.3.4 肺功能評價? FEV1 患者最大深吸氣后做最大呼氣，最大呼氣第一秒呼出的氣量的容積，正常范圍為男（3.18±0.12）L，女（2.31±0.05）L。FEV1%pred：FEV1和預計值的比值，輕度：≥80%;中度：50%～79%;重度：30%～49%;危重度：<30%。

1.3.5 血常規及血氣分析? 血常規：核酸熒光染色流式細胞術法檢測白細胞、中性粒細胞及淋巴細胞計數。血氣分析：玻璃電極選擇性測定pH值，氣敏電極直接測定Pa02，電化學法測定PaC02。

1.4 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間各指標的平均水平采用獨立樣本t檢驗或非參數檢驗。計數資料采用頻數及百分比表示，兩組間率的比較采用χ2檢驗。選取患者的臨床資料、住院期間檢查結果的相關變量進行單因素回歸分析。單因素分析中具有統計學意義的因素再行多因素Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病毒檢測

呼吸道病毒PCR檢測陽性例數41例（41/107， 38.32%），病毒檢出率依次為鼻病毒（HRV）9例（9/41， 21.95%）、甲型流感病毒（IVA）8例（8/41，19.51%）、副流感病毒3型（PIV3）6例（6/41，14.63%）、呼吸道合胞病毒A（RSVA）6例（6/41，14.63%）、人類偏肺病毒（HMPV）3例（3/41，7.32%）、副流感病毒1型（PIV1）3例（3/41，7.32%）、乙型流感病毒（IVB）3例（3/41， 7.32%）、腺病毒2例（ADV）（2/41，4.88%）、副流感病毒4型（PIV4）1例（1/41，2.44%）。見表1。

表1? ?病毒檢出情況（n=41）

2.2 AECOPD患者基本資料比較

病毒陰性及陽性兩組AECOPD患者資料，見表2。統計結果顯示，兩組患者在年齡、mMRC分級、營養狀況、臨床檢測結果（血常規、血氣分析、肺功能）等差異均無統計學意義（P>0.05）。

2.3 AECOPD患者呼吸道病毒感染危險因素分析

單因素結果顯示，煙草暴露、糖尿病、呼吸衰竭、規律用藥及1年內急性加重次數對AECOPD感染呼吸道病毒有統計學意義（P<0.05）。見表3。

病毒感染風險多因素Logistic回歸分析：在α=0.05的水平上，得到1年內急性加重次數、煙草暴露、糖尿病、呼吸衰竭為COPD急性加重期患者病毒感染的危險因素（P<0.05），見表4。

表3? ?病毒陽性及病毒陰性組臨床資料單因素分析[n（%）]

3 討論

COPD的急性加重，是宿主、呼吸道病原體和環境污染之間復雜的相互作用。COPD患者的肺功能因疾病頻繁發作而不斷下降，細菌感染一直被認為是導致COPD病情惡化的主要原因;然而，隨著聚合酶鏈反應檢測呼吸道病毒的出現，人們已經認識到呼吸道病毒感染可能是COPD急性加重的主要原因[5]。早期的研究使用血清學和病毒培養技術，AECOPD患者病毒檢出率在10%～30%[6]。隨著PCR技術的應用，現在估計有一半的病情惡化與病毒有關[7]。Rohde G等[8]用聚合酶鏈反應技術，檢測出56% AECOPD患者存在呼吸道病毒感染。

病毒誘導慢性阻塞性肺疾病急性加重的發病機制尚不確定，通過研究發現可能和以下機制有關：①呼吸道病毒會攻擊氣道上皮細胞，導致上皮細胞脫落、微血管擴張、水腫和免疫細胞浸潤[9];②呼吸道病毒感染后可產生促炎細胞因子，包括IL-6（Interleukin 6）、IL-8（Interleukin 8）、腫瘤壞死因子-α、生長調節癌基因-α、干擾素-γ誘導蛋白10、細胞間粘附分子-1和中性粒細胞彈性蛋白酶，還能夠激活表皮生長因子受體釋放黏蛋白和IL-8[10]。細胞間粘附分子-1介導的病毒粘附氣道上皮細胞[11]，促進病毒與氣道上皮細胞的結合和進入氣道上皮細胞;③病毒感染后細菌感染的易感性增加，黏液纖毛清除率降低[12]。

鼻病毒（Rhinovirus，HRV）是COPD急性加重期最常見的呼吸道病毒，MAllia P等[13]的人體實驗模型表明，HRV能夠誘發COPD急性加重：HRV感染可以引起COPD患者下氣道微生物群的改變，并引起流感嗜血桿菌的致病趨勢;鼻病毒可能通過減少痰液抗菌肽而降低COPD患者的先天免疫能力，增加細菌的易感性[14]。Singh M等[15]文獻報道HRV編碼的蛋白酶2A可誘導CD4+T細胞和單核細胞來源的樹突狀細胞活化Th1（helper T cell-1）和Th2（helper T cell-2），誘導COPD急性加重期患者病情加重。隨后的Th2反應導致氣道高反應性，并引發更嚴重的呼吸困難和加速肺功能惡化。

流感病毒則是AECOPD期間發現的另一種常見的呼吸道病毒[5]。與正常人相比，COPD患者在流感感染后的致死率增加。繼發細菌性肺炎是流感流行病期間疾病發病率和死亡率的主要原因。其機制可能和流感病毒抑制機體針對肺炎鏈球菌的免疫反應，上調肺炎球菌粘附分子粘附氣道上皮能力;流感也被證明能誘導中性粒細胞凋亡和中性粒細胞功能障礙[16]，并可能抑制巨噬細胞的吞噬功能[17]。

本研究發現HRV及流感病毒為COPD急性加重期常見呼吸道病毒，和國內一些研究結果相同[18]，呼吸道病毒分布具有季節差異性，本研究時間跨度2年，避免了季節分布的影響，但仍有局限性：本研究僅為單中心橫斷面研究，不能避免病毒地域分布不同造成的差異，且納入例數較少，故驗證結果需要多中心隨機對照實驗。

本研究結果還發現1年內急性加重次數、煙草暴露、糖尿病、呼吸衰竭與呼吸道病毒感染引起的COPD急性加重有著密切關聯。吸煙本身為COPD危險因素，而糖尿病則使肺部感染的機率增加，通過相關研究發現這些危險因素均通過調節人體細胞免疫、體液免疫反應來降低對病毒的清除和防御能力[19]，對于危險因素的識別及預防將有效降低AECOPD發生率。

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（收稿日期：2019-10-17）