非小細胞肺癌PHLPP的表達與順鉑化療預后的關系

陳美芳 林玲 徐有祖 呂冬青 周超 鄭海紅

[摘要] 目的 觀察PHLPP的表達與順鉑化療預后的關系。 方法 收集2015年3月～2017年3月86例經病理確診的Ⅳ期非小細胞肺癌患者，PHLPP、P-Akt、P-ERK的表達用免疫組化的方法評估，分析PHLPP的表達與臨床病理特征以及順鉑化療預后的關系。 結果 PHLPP的表達在P-Akt陰性組與陽性組之間差異有統計學意義（P<0.05），在P-ERK陰性組與陽性組之間差異有統計學意義（P<0.05）;PHLPP的表達水平與P-Akt、P-ERK的表達呈負相關。單因素分析發現PFS與P-Akt、P-ERK的表達呈負相關，PFS與PHLPP的表達呈正相關，多因素分析發現PHLPP（OR值63.673，95%CI：14.858～272.865，P<0.001）、P-Akt（OR值1.912，95%CI：1.363～4.396，P=0.032）、P-ERK（OR值3.347，95%CI：1.810～6.186，P<0.001）是PFS的獨立預測因子。 結論 PHLPP可能通過負向調節Akt及ERK通道調控順鉑化療預后。

[關鍵詞] 非小細胞肺癌;PHLPP;順鉑;化療預后

[中圖分類號] R734.2 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）29-0032-05

Relationship between expression of PHLPP and prognosis of cisplatin chemotherapy in non-small cell lung cancer

CHEN Meifang1 ? LIN Ling1 ? XU Youzu1 ? LV Dongqing1 ? ZHOU Chao2 ? ZHENG Haihong3

1.Department of Respiratory Medicine， the Affiliated Taizhou Hospital of Wenzhou Medical University， Linhai ? 317000， China; 2.Department of Radiotherapy， the Affiliated Taizhou Hospital of Wenzhou Medical University， Linhai ? 317000， China; 3.Department of Pathology， the Affiliated Taizhou Hospital of Wenzhou Medical University， Linhai ? 317000， China

[Abstract] Objective To observe the relationship between the expression of PHLPP and the prognosis of cisplatin chemotherapy. Methods A total of 86 patients with stage Ⅳ non-small cell lung cancer diagnosed by pathology were collected from March 2015 to March 2017. Expression of PHLPP， P-Akt， and P-ERK was assessed by immunohistochemistry. The relationship between the expression of PHLPP and clinicopathological features and the prognosis of cisplatin chemotherapy was analyzed. Results The expression of PHLPP was statistically significantly different between the P-Akt negative group and the positive group（P<0.05）. There was a statistically significant difference between the P-ERK negative group and the positive group （P<0.05）; the expression level of PHLPP was negatively correlated with the expression of P-Akt and P-ERK. Univariate analysis found that PFS was negatively correlated with the expression of P-Akt and P-ERK. PFS was positively correlated with the expression of PHLPP. Multivariate analysis found that PHLPP （OR value： 63.673， 95%CI： 14.858-272.865， P<0.001）， P-Akt （OR value： 1.912， 95%CI： 1.363-4.396， P=0.032）， and P-ERK （OR value： 3.347， 95%CI： 1.810-6.186， P<0.001） were independent predictive factors of PFS. Conclusion PHLPP may regulate the prognosis of cisplatin chemotherapy by negatively regulating Akt and ERK channels.

[Key words] Non-small cell lung cancer; PHLPP; Cisplatin; Chemotherapy prognosis

肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其發病率及死亡率呈明顯增高趨勢，其中非小細胞肺癌（no small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的80%[1]，多數患者確診時已處于晚期且預后差[2]。以鉑類為基礎的化療是晚期NSCLC的主要治療手段，然而晚期NSCLC的5年總生存率仍未超過16%[3]，對以鉑類為基礎的化療藥物產生耐藥是導致晚期NSCLC患者治療失敗的主要原因。

PH結構域富含亮氨酸重復序列的蛋白磷酸酶（PH domainleucine-rich repeats protein phosphatase，PHLPP）是一個新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，具有促進細胞凋亡的作用，已證實其為腫瘤抑制基因的角色[4]。PHLPP能負向調節蛋白激酶B（protin kinase，Akt）及細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protin kinase，ERK）信號通道，從而抑制腫瘤的增殖、分化，促進腫瘤細胞的死亡[4-5]，國內學者體外細胞實驗發現，順鉑的治療能激活Akt及ERK通道而產生耐藥[6]，從而提示PHLPP可能通過調節Akt和ERK水平調控NSCLC對順鉑化療的預后。本研究目的在于探索PHLPP在非小細胞肺癌中的表達與順鉑化療預后的關系?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

收集2015年3月～2017年3月我院病理組織庫采集的86例肺癌病例支氣管鏡活檢標本，所有患者ECOG評分0或1分、有足夠的基線器官功能、白細胞計數>4×109/L（中性粒細胞絕對值>2×109/L，血小板計數>100×109/L，正常的肝功能，血清肌酐水平<1.4 mg/dL）、無其他嚴重并發癥?；颊叻制诟鶕嗀JCC的TNM分期系統（第7版，2009）。所有病例均首次接受含順鉑藥物化療，化療前均未接受放療且除外并發感染，包括鱗癌48例，腺癌38例，均屬于Ⅳ期患者。男56例，女30例，年齡41～71歲，中位年齡60歲。

1.2 試劑和儀器試劑

PHLPP抗體（abcam公司，編號ab89833），P-AKT抗體（arigo公司，編號ARG56418），P-ERK1/2抗體（arigo公司，編號ARG10568）。主要儀器：低溫離心機、組織均漿器、分光光度計、酶標儀、Leica切片機、全自動放免γ計數儀器、Leica顯微鏡。

1.3 方法

每份標本均用4%多聚甲醛固定，石蠟固定包埋。免疫組化測定采用PowerVision二步法，按試劑盒說明書進行：（1）取石蠟切片烤片后，脫蠟、脫水后;（2）0.3%H2O2，室溫15 min（避光），封閉內源性過氧化物酶;（3）切片置入0.01 M（10 mM）檸檬酸緩沖液（pH 6.0）微波修復法修復抗原;（4）正常山羊血清處理，37℃，10～15 min;（5）滴加第一抗體（PHLPP、P-AKT及P-ERK等），放置濕盒內37℃孵育2 h;（6）PBS洗滌后，滴加二抗（GTVision+/HRP），37℃，30 min;（7）PBS洗滌5 min，滴加預備好的顯色劑DAB工作液，即于光鏡下控制顯色。顯色完全后，置于蒸餾水中終止顯色;（8）流水沖洗，蘇木素復染，藍化;（9）脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡觀察。結合細胞陽性著色程度及陽性細胞比率分析各樣本的目的蛋白表達水平。

1.4 觀察指標

記錄每位患者從開始化療到出現疾病進展的時間，稱為無進展生存期（progression-free survival，PFS）。觀察各組PHLPP的表達情況;PHLPP表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系;PFS與非小細胞肺癌臨床病理特征關系的單因素分析;PFS與非小細胞肺癌臨床病理特征關系的多因素分析;PFS曲線的結果分析。

1.5 免疫組化結果

判斷標準由一名高年資病理科主任醫師與一名高年資病理科主治醫師雙盲法統計染色結果，主要定位于胞漿內。根據癌巢及正常組織中，計數陽性癌細胞占總癌細胞數的百分比，陽性細胞≥25%為陽性，<25%為陰性。

1.6 統計學分析

采用SPSS22.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗。單因素分析采用Log-rank分析，多因素分析采用COX回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PHLPP的表達情況

在非小細胞肺癌組織中高表達、低表達以及P-Akt陽性、P-ERK陽性的免疫組化圖像，見封三圖3。計數陽性細胞占總癌細胞≥25%為陽性，<25%為陰性。

2.2 PHLPP表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系

本研究共對86例經病理證實的晚期NSCLC患者進行評價，男56例（65.12%），女30例（34.88%），中位年齡60歲，所有患者均給予順鉑藥物化療，記錄每位患者的PFS。PHLPP、P-Akt、P-ERK在肺癌的表達是通過免疫組化方法進行評估的，對PHLPP的表達與肺癌臨床病理特征的關系進行分析，見表1。結果顯示PHLPP高表達（2～3分）35例（40.70%），低表達（0～1分）51例（59.30%），PHLPP表達水平在不同年齡、性別、病理類型、有無吸煙史組間比較差異無統計學意義（P>0.05），在P-Akt陰性組與陽性組之間差異有統計學意義（χ2=6.631，P=0.010），在P-ERK陰性組與陽性組之間差異有統計學意義（χ2=4.072，P=0.044），PHLPP的表達水平與P-Akt、P-ERK的表達呈正相關。

2.3 PFS與非小細胞肺癌臨床病理特征關系的單因素分析

PFS在不同年齡、性別、病理類型、有無吸煙史組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。PFS在P-Akt陰性組與陽性組之間比較差異有統計學意義（χ2=3.293，P=0.001），在P-ERK陰性組與陽性組之間比較差異有統計學意義（χ2=5.139，P<0.001），PFS與P-Akt、P-ERK的表達呈負相關;PFS在PHLPP高表達組與低表達組之間差異有統計學意義（χ2=13.976，P<0.001），且PHLPP表達與PFS呈正相關，見表2。

2.4 PFS與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系的多因素分析

對單因素分析中有統計學意義的危險因素進行COX回歸分析發現，P-Akt：OR=1.912，95%CI：1.363～4.396，P=0.032;P-ERK：OR=3.347，95%CI：1.810～6.186，P<0.001;PHLPP：OR=63.673，95%CI：14.858～272.865，P<0.001。結果提示PHLPP、P-Akt、P-ERK的表達是影響PFS的獨立預測因子，見表3。

2.5 PFS曲線的結果分析

PHLPP高表達患者的PFS明顯長于PHLPP低表達患者[（8.42±0.94）個月vs （4.72±1.37）個月，P<0.001]，差異有統計學意義，見封三圖4;P-Akt陰性患者的PFS明顯長于P-Akt陽性患者[（6.64±2.13）個月vs（4.90±1.92）個月，P<0.001]，差異有統計學意義，見封三圖5;P-ERK陰性患者的PFS明顯長于P-ERK陽性患者[（6.92±1.76）個月vs （4.57±2.30）個月，P<0.001]，差異有統計學意義，見封三圖6。

3 討論

以鉑類為基礎的化療是晚期NSCLC的主要治療手段，化療藥物耐藥是治療失敗和導致死亡率上升的主要原因[7]。降低腫瘤細胞對順鉑治療的耐藥率，對于提高晚期NSCLC的生存率至關重要。順鉑主要通過DNA的鏈內交鏈和鏈間交鏈破壞DNA發揮其抗腫瘤活性[8]，而關于順鉑耐藥的機制，目前尚不明確。

PHLPP家族中包含三個同工酶，分別是PHLPP1α、PHLPP1β和PHLPP2，具有抑制腫瘤細胞生長與遷移能力，促進細胞凋亡的作用，證實其為腫瘤抑制基因的角色[4]。已有研究證實PHLPP在多種腫瘤組織呈低表達，如膠質瘤[8]、結腸癌[9，10]、前列腺癌[11]、胃癌[12]和膽囊癌[13-14]，本研究中PHLPP在肺癌組織中呈低表達，低表達量為59.30%，這與Lv D[15]等報道PHLPP在肺腺癌組織中的表達量明顯減少相一致。Gao T等[4]發現PHLPP蛋白可以拮抗細胞內P13K/Akt信號通路，從而成為Akt的負調節物。也有學者在神經細胞和B細胞模型研究中發現，PHLPP1的超表達能抑制ERK的磷酸化，而SiRNA敲除PHLPP1能提高ERK的磷酸化水平，表明PHLPP能負向調節ERK信號通道[15]，以上體外細胞實驗表明PHLPP能負向調節Akt及ERK通道從而發揮抑制腫瘤的作用[4-5]。本研究中PHLPP表達水平在不同年齡、性別、病理類型、有無吸煙組間比較差異無統計學意義，而與P-Akt以及P-ERK的表達呈負相關，表明PHLPP可能通過負向調節Akt及ERK通道而發揮抗腫瘤的作用，這與前述體外細胞實驗的結果相一致。

已有研究證實，Akt和ERK與腫瘤的發生及化療的預后有關[16-17]，并與肺癌的放化療預后也呈現相關性[18]。國內學者Wang M等研究[6]發現，在A549細胞系中，順鉑治療能使Akt和ERK產生磷酸化而激活，而阻斷Akt和ERK信號通道能增敏A549細胞對順鉑誘導的細胞凋亡，從而證實Akt和ERK通道的活化與肺癌細胞對順鉑的化療預后有關。本研究統計學分析顯示，P-Akt、P-ERK陰性患者比P-Akt、P-ERK陽性患者的PFS明顯延長，差異有統計學意義，PFS與P-Akt以及P-ERK的表達呈負相關，這與Wang M等[6]研究結果一致。Xie Y[19]等報道PHLPP高表達預示著EGFR-TKI靶向治療獲得性耐藥的時間更長，并提示PHLPP可能通過Akt及ERK通道調控EGFR-TKI的獲得性耐藥。本研究中封三圖4～6的PFS曲線可見PHLPP高表達患者比低表達患者PFS明顯延長，差異有統計學意義，表明PHLPP的表達水平與PFS呈正相關，而P-Akt、P-ERK的表達與PFS呈負相關，而COX回歸分析發現PHLPP、P-Akt以及P-ERK的表達均是PFS的獨立預測因子，可以推測PHLPP可能通過負向調節Akt及ERK通道調控腫瘤細胞對順鉑化療的預后。

含鉑藥物化療是治療晚期NSCLC的主要手段，而鉑類藥物耐藥是目前面臨的主要問題，通過本研究發現PHLPP可能通過Akt及ERK通道調控腫瘤細胞對順鉑的化療預后，故進一步探索PHLPP基因可能成為肺癌新治療和改善順鉑耐藥的新靶點。

[參考文獻]

[1] Travis WD，Brambilla E，Noguchi M，et al. International association for the study of lung cancer/american thoracic society/european respiratory society international multidisciplinary classification of lung adenocarcinoma[J]. Thoracic Society，2011，8（5）：381-385.

[2] Ellis PM，Vandermeer R. Delays in the diagnosis of lung cancer[J]. Thorac Dis，2011，3（3）：183-188.

[3] Sieqel R，Ward E，Brawley O，et al. The impact of ?eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J]. CA Cancer Clin，2011，61（4）：212-236.

[4] Gao T，Furnari F，Newton AC，et al. PHLPP：A phosphatase that directly dephosphorylates Akt，promotes apoptosis，and suppresses tumor growth[J]. Mol Cell，2005，18（1）：13-24.

[5] Li X，Stevens PD，Liu J，et al. PHLPP is a negative regulator of RAF1，which reduces colorectal cancer cell motility and prevents tumor progression in mice[J]. Gastroenterology，2014，146（5）：1301-12.e1-10.

[6] Wang M，Liu ZM，Li XC，et al. Activation of ERK1/2 and Akt is associated with cisplatin resistance in human lung cancer cells[J]. Journal of Chemotherapy，2013，25（3）：162-169.

[7] Yu J，Zhou J，Xu F，et al. High expression of Aurora-B is correlated with poor prognosis and drug resistance in non-small cell lung cancer[J]. Int J Biol Markers，2018， 33（2）：215-221.

[8] Kelland L. The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy[J]. Nat Rev Cancer，2010，7（8）：573-584.

[9] Molina JR，Agarwal NK，Morales FC，et al. PTEN，NHERF1 and PHLPP from a tumor suppressor network that is diabled in glioblastoma[J]. Oncogene，2012，31（10）：1264-1274.

[10] Liu J，Weiss HL，Rychahou P，et al. Loss of PHLPP expression in colon cancer role in proliferation and tumorigenesis[J]. Oncogene，2009，28（7）：994-1004.

[11] Li X，Stevens PD，Yang H，et al. The deubiquitination enzyme USP46 functions as a tumor suppressors by controlling PHLPP-dependent attenuation of Akt signaling in colon cancer[J]. Oncogene，2013，32（4）：471-478.

[12] Chen M，Prastt CP，Zeeman ME，et al. Identification of PHLPP1 as a tumor suppressor reveals the role of feedback activation in PTEN-mutant prostate cancer progression[J]. Cancer Cell，2011，20（2）：173-186.

[13] Wang Z，Shu H，Wang Z，et al. Loss expression of PHLPP1 correlates with lymph node metastasis and exhibits a poor prognosis in patients with gastric cancer[J]. Surg Oncol，2013，108（7）：427-432.

[14] Qiu Y，Li X，Yi B，et al. Protein phosphatase PHLPP induces cell apoptosis and exerts anticancer activity by inhibiting survivin phosphorylation and nuclear export in gallbladder cancer[J]. Oncotarget，2015，6（22）：19148-19162.

[15] Lv D，Yang H，Wang W，et al. High PHLPP expression is associated with better prognosis in patients with resected lung adenocarcinoma[J]. BMC Cancer，2015，13（10）：687-701.

[16] Audrey K，ONeill， Matthew J，et al. Suppression of survival signallingpathwaya by the phosphatase PHLPP[J]. FEBS Journal，2013，280（2）：572-583.

[17] McCubrey JA，Steelman LS，Abrams SL，et al. Targeting survival cascades induced by activation of Ras/Raf/MEK/ERK，PI3K/PTEN/Akt/mTOR and Jak/STAT pathways for effective leukemia therapy[J]. Leukemia，2008，4（22）：708-722.

[18] Katso R，Okkenhaug K，Ahmadi K，et al. Cellular function of phosphoinositide3-kinases：Implications for development，homeostasis，andcancer[J]. Annu Rev Cell Dev Biol，2001，17（1）：615-675.

[19] Xie Y，Lv D，Wang W，et al. High PHLPP1 expression levels predicts longer time of acquired resistance to EGFR tyrosine kinase inhibits in patients with lung adenocarcinoma[J]. Oncotarget，2017，8（35）：59000-59007.

[20] David O，Jett J，LeBeau H，et al. Phospho-Akt overexpression in non-small cell lung cancer confers significant stage-independent survival disadvantage[J]. Clinical Cancer Research，2004，10（20）：6865-6871.

（收稿日期：2019-06-06）