紅酸湯的抗氧化活性研究

周紹琴，李鳳蘭，吳映梅，劉小藝，張清海，周艷*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025)

紅酸湯是貴州黔東南地區(qū)苗族人民的一種特色食品，以番茄為主要原料，經(jīng)自然發(fā)酵而成，其色澤紅亮，有“酸、鮮、香”的風(fēng)味特征。將紅酸湯用作火鍋底料,口味醇厚、酸味純正、咸味適中，具有增強(qiáng)食欲的獨(dú)特作用，現(xiàn)已走向全國(guó)市場(chǎng)，深受?chē)?guó)內(nèi)消費(fèi)者的青睞，它也被評(píng)定為繼小肥羊、麻辣火鍋后的中國(guó)第三大火鍋底料。

自由基是機(jī)體在氧化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性。當(dāng)自由基清除過(guò)少或者產(chǎn)生過(guò)多時(shí)，會(huì)損害機(jī)體的細(xì)胞和組織，引發(fā)相關(guān)慢性疾病及衰老效應(yīng)[1-2]。因此，適當(dāng)補(bǔ)充天然抗氧化劑有利于機(jī)體自由基的清除。

番茄是紅酸湯的主要原料，由于番茄中含有豐富的抗氧化物質(zhì)，研究顯示[3-7]：番茄中維生素C的含量為(116.76±5.29)mg/kg，番茄紅素的含量為(15.65±0.48)mg/kg。因此，以番茄為主要原料制成的紅酸湯具有一定的抗氧化能力。陳文瑩等[8]研究顯示：紅酸湯中的全反式番茄紅素含量為25 mg/100 g。魯青松等[9-10]研究顯示：紅酸湯中有機(jī)酸有較好的O2-清除能力，將其制成口服液具有一定的抗氧化能力，其清除率DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基的IC50值分別為18.89%、37.79%、19.09%。但不同來(lái)源的紅酸湯抗氧化物質(zhì)的組成、自由基清除能力的差異、發(fā)揮自由基清除活性的主要物質(zhì)尚不清楚。

因此，本試驗(yàn)選擇貴州地區(qū)商業(yè)化和農(nóng)家自制紅酸湯產(chǎn)品為研究對(duì)象，檢測(cè)不同來(lái)源的紅酸湯中抗氧化物質(zhì)(維生素C、總黃酮、總酚和番茄紅素)的含量和自由基清除活性，并將兩者進(jìn)行相關(guān)性分析，探索影響紅酸湯抗氧化活性的可能因素，為高抗氧化活性紅酸湯產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)和超市購(gòu)買(mǎi)9個(gè)品牌(1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#)的紅酸湯產(chǎn)品和農(nóng)家自制產(chǎn)品1份，共10份，每份3個(gè)樣品，共30個(gè)樣品。產(chǎn)品的產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。

表1 不同品牌的酸湯產(chǎn)地Table 1 The places of origin of different brands of sour soup

碳酸氫鈉、碳酸鈉、無(wú)水乙醇、草酸(均為分析純):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；DPPH標(biāo)準(zhǔn)品：北京索萊寶科技有限公司；L(+)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品。

1.1.2 主要儀器

721型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司；LT1002C型電子天平 常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 常州朗越儀器制造有限公司；Agilent 1100型高效氣相色譜儀、Agilent 1100型高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pH值的檢測(cè)方法

采用pH計(jì)測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.2.2 滴定酸度的檢測(cè)方法

參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 12293-1990[11]測(cè)定紅酸湯的滴定酸度，將試樣充分搖勻，用天平稱取10 g，放入50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻待測(cè)，用濾紙過(guò)濾即得樣品。用移液管吸取10 mL樣液，加入酚酞指示劑5～10滴，用0.1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至出現(xiàn)微紅色30 s內(nèi)不褪色為終點(diǎn)，記下所消耗的體積V1。試樣的可滴定酸度以每 100 g氫離子毫摩爾數(shù)表示，按下式計(jì)算：

1.2.3 維生素C的檢測(cè)方法

參考國(guó)標(biāo)GB 5009.86-2016[12]。稱取各樣品10 g于燒杯中，用偏磷酸溶液(20 g/L)轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，然后過(guò)濾。除去濾液顏色(每 1 g樣品加0.4 g白陶土脫色后再過(guò)濾),然后取過(guò)濾液10 mL于50 mL錐形瓶中，用標(biāo)定過(guò)的2,6-二氯靛酚溶液滴定，直至溶液呈粉紅色15 s不褪色為止。同時(shí)做空白試驗(yàn)，按下式計(jì)算維生素C含量：

式中：X為試樣中L(+)-抗壞血酸含量，mg/100 g；V為滴定試樣所消耗的2,6-二氯靛酚溶液的體積，mL；V0為滴定空白所消耗的2,6-二氯靛酚溶液的體積，mL；T為2,6-二氯靛酚溶液的滴定度，即每毫升2，6-二氯靛酚溶液相當(dāng)于抗壞血酸的毫克數(shù)；A為稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g。

1.2.4 總酚含量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteus法測(cè)定樣品中總酚的含量[13]，并稍作修改。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取沒(méi)食子酸(0.110±0.001)g，用水溶解到100 mL 容量瓶中，配制成濃度為1000 mg/L的沒(méi)食子酸溶液，以此溶液為母液，配制成濃度為0，10，20，30，40，50 mg/L的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，依次加入1 mL 福林酚、3 mL 7.5%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至10 mL，避光反應(yīng)30 min，在765 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.2004x+0.0268，R2=0.997。

樣品的測(cè)定：取一定質(zhì)量的紅酸湯，離心后取1 mL上清液，依次加入1 mL福林酚、3 mL 7.5%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至10 mL，避光反應(yīng)30 min，然后在765 nm下測(cè)其吸光度，其總酚含量由以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算。

1.2.5 總黃酮含量的測(cè)定

采用NaNO2-Al(NO3)3法測(cè)定樣品中總黃酮的含量[14]，并稍作修改。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用60%甲醇溶解蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為1.0 mg/mL的溶液，稀釋溶液配制成0.1，0.2，0.4，0.8 mg/mL的溶液，分別取上述溶液1 mL，各加入60% 甲醇3.0 mL、5% NaNO2溶液0.3 mL，混合均勻放置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，混合均勻放置6 min，然后加入 4% NaOH水溶液4.0 mL，定容至10 mL，混合均勻，反應(yīng)15 min 后，以60%甲醇為空白對(duì)照，于500 nm下測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.7125x+0.0159，R2=0.999，單位為mg/mL。

樣品測(cè)定：取一定質(zhì)量的紅酸湯以4500 r/min的轉(zhuǎn)速離心后取上清液1 mL，取稀釋一定倍數(shù)的上清液1 mL于試管中，加入60%甲醇3.0 mL、5% NaNO2溶液0.3 mL，混合均勻放置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，混合均勻放置6 min，而后加入 4% NaOH水溶液4.0 mL，定容至10 mL，混合均勻，反應(yīng) 15 min后，以60%甲醇為空白對(duì)照，于500 nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮含量。

1.2.6 總番茄紅素含量的檢測(cè)方法

參考余越等[15]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在1 mg的總番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品中加入10 mL的乙酸乙酯進(jìn)行溶解，配制成0.1 mg/mL的溶液；按照逐級(jí)稀釋的方法，將總番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品濃度配制成10，8，6，4，2 μg/mL。在450 nm的條件下測(cè)其吸光值，得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.1255x-0.0532，R2=0.997。

樣品的測(cè)定：用95%的乙醇進(jìn)行除雜處理，紅酸湯樣品與乙醇95%按照1∶5(g/mL)混合，振蕩后靜置15 min，以2000 r/min離心10 min，棄去上清液，并倒置離心管于濾紙上吸干。取前處理的1 g左右的紅酸湯樣品按照樣品與溶劑為積比1∶8加入溶劑，在25 ℃恒溫水浴鍋中水浴30 min，然后過(guò)濾取濾液，取0.1 mL樣品用乙酸乙酯定容到2 mL，在450 nm下測(cè)定其吸光度。

1.2.7 DPPH自由基清除能力的檢測(cè)方法

參考王勝利等[16]的方法并稍作修改，測(cè)定各樣品DPPH自由基的清除能力。準(zhǔn)確稱取4 mg DPPH自由基用無(wú)水乙醇溶解并定容至150 mL，于4 ℃避光保存，備用。取一定質(zhì)量的樣品經(jīng)4500 r/min離心5 min，取上清液。分別取稀釋一定倍數(shù)的樣品1 mL，加入DPPH自由基乙醇溶液4 mL，在室溫下避光反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇代替樣品為空白對(duì)照，測(cè)定其在517 nm處的吸光度，以無(wú)水乙醇代替樣品為空白對(duì)照。DPPH消除率按照下式計(jì)算：消除率/%=[A0-(Ai-A1)/(A0-A1)]×100%。式中：空白吸光值為A0；樣品吸光值為Ai；樣品溶液本底的吸光值為A1。

1.2.8 ABTS自由基清除能力的檢測(cè)方法

取7.4 mmol/L的ABTS原液與等量2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀混合,在黑暗中放置12～14 h，將ABTS溶液用無(wú)水乙醇稀釋至在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.70±0.02，得到ABTS溶液[17-18]。樣品經(jīng)過(guò)離心后取40 μL，加水稀釋至1 mL，加入6 mL ABTS溶液，混合均勻后在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，以無(wú)水乙醇作為空白，ABTS清除率按照下式計(jì)算：清除率/%=[A0-(Ai-A1)/(A0-A1)]×100%。式中：空白吸光值為A0；樣品吸光值為Ai；樣品溶液本底的吸光值為A1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel計(jì)算出樣品的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 13.0進(jìn)行抗氧化物質(zhì)、自由基清除率的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品牌紅酸湯滴定酸度和pH值

表2不同品牌紅酸湯滴定酸度和pH值Table 2 The titrated acidity and pH values in different brands of red sour soup

由表2可知，10種樣品滴定酸含量范圍為12.17～44 mmol/100 g。除了1#樣品外，其余所有樣本的滴定酸度均高于農(nóng)家自制，滴定酸最高的為3#樣品。pH值范圍為2.51～3.21。與常云鶴等[19]研究的紅酸湯pH值相比，貴州不同品牌紅酸湯及自制紅酸湯的滴定酸及pH值較低，這可能與發(fā)酵工藝、原輔料等有關(guān)，發(fā)酵產(chǎn)物中的有機(jī)酸含量決定了紅酸湯的酸度。鄒大維[20]對(duì)凱里紅酸湯有機(jī)酸的分析研究表明，乳酸和乙酸為主要的有機(jī)酸。乳酸含量較乙酸高(1#樣品除外)，其含量在26.26～96.51 g/kg之間，自制樣品中乳酸含量為67.82 g/kg，2#、3#和7#樣品乳酸的含量高于自制樣品。乳酸可以作為人體細(xì)胞進(jìn)行糖異生(由非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化成葡萄糖的過(guò)程)的原料，糖異生是人體饑餓時(shí)自體補(bǔ)充血糖的重要途徑[21]，因此，可根據(jù)需求選擇適宜的品牌。乙酸的含量在7.74～33.18 g/kg之間，自制乙酸含量為12.79 g/kg，除8#樣品外，其余品牌乙酸的含量均高于自制。

2.2 不同品牌紅酸湯中抗氧化物質(zhì)的含量

維生素C、黃酮、多酚和番茄紅素都是重要的抗氧化物質(zhì)，對(duì)10個(gè)樣品中維生素C、總黃酮、總酚和番茄紅素的含量進(jìn)行檢測(cè)，見(jiàn)表3。

表3 不同品牌紅酸湯中維生素C、總黃酮、總酚、番茄紅素的含量Table 3 The content of vitamin C,total flavonoids,total phenols,lycopene in different brands of red sour

由表3可知，10種樣品維生素C含量范圍在1.92～7.27 mg/100 g，僅1#、3#和5#樣品維生素C的含量低于農(nóng)家自制，其中4#樣品的維生素C含量最高，為7.27 mg/100 g。總黃酮含量范圍在9.99～78.07 mg/100 g，僅2#、7#和9#樣品總黃酮的含量高于或接近農(nóng)家自制，其中7#樣品總黃酮含量最高，為78.07 mg/100 g。總酚含量范圍在168.43～411.94 mg/100 g之間，僅2#樣品中的總酚含量高于農(nóng)家自制，其含量為411 mg/100 g，其他市售紅酸湯總酚含量集中在168～332 mg/100 g。番茄紅素含量范圍是5.98～54.32 mg/100 g，其中農(nóng)家自制紅酸湯番茄紅素含量最高，為55.02 mg/100 g，其次是 8#樣品，其含量為54.32 mg/100 g。由以上數(shù)據(jù)可知，商業(yè)化生產(chǎn)的紅酸湯中維生素C的含量大部分不低于農(nóng)家自制，但總黃酮、總酚和番茄紅素含量高，大部分商業(yè)化生產(chǎn)的紅酸湯低于農(nóng)家自制。此外，農(nóng)家自制紅酸湯中的番茄紅素含量高于魯楊等[22]研究的紅酸湯，其僅含(9.31±5.95)mg/100 g。

2.3 不同品牌紅酸湯自由基清除率

表4 紅酸湯DPPH、ABTS自由基清除率Table 4 The scavenging rates of DPPH,ABTS free radals of red sour

由表4可知，不同品牌紅酸湯抗氧化物質(zhì)的含量差別很大，抗氧化物質(zhì)的含量將直接影響自由基的清除能力，因此，對(duì)不同品牌紅酸湯自由基的清除能力進(jìn)行測(cè)定。10種樣品的DPPH清除率在40.85%～71.77%之間，其中2#樣品的DPPH自由基清除率最高，為71.77%，2#、3#、4#和8#樣品DPPH自由基清除能力高于農(nóng)家自制；10種樣品的ABTS自由基清除率在40.62%～70.34%之間，最高的為農(nóng)家自制樣品，為70.34%。

2.4 抗氧化物質(zhì)與自由基清除活性的相關(guān)性分析

為了找出影響紅酸湯抗氧化活性的主要物質(zhì)，將抗氧化物質(zhì)與自由基清除率進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 抗氧化物質(zhì)、自由基清除率相關(guān)性分析Table 5 The correlation analysis of antioxidant substances and free radical scavenging rates

由表5可知，紅酸湯中總黃酮的含量與ABTS自由基清除率呈顯著的正相關(guān)性(P=0.00，R=0.82)，說(shuō)明紅酸湯中黃酮含量越高，該樣品ABTS自由基清除率越好。多酚與ABTS、DPPH自由基清除率都具有顯著正相關(guān)性，說(shuō)明樣品中總酚的含量越高，樣品對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率活性越強(qiáng)。Vc和番茄紅素的含量與自由基清除之間無(wú)顯著相關(guān)性，此結(jié)果預(yù)示著影響紅酸湯抗氧化活性的主要物質(zhì)是總酚和總黃酮。

3 結(jié)論

通過(guò)以上的試驗(yàn)結(jié)果可知，商業(yè)生產(chǎn)的紅酸湯產(chǎn)品與農(nóng)家自制產(chǎn)品差異不大，優(yōu)于農(nóng)家自制。紅酸湯具有一定的抗氧化能力，Vc在商業(yè)品牌中的含量普遍高于農(nóng)家自制，但總黃酮、多酚和番茄紅素含量比農(nóng)家自制略低；在自由基清除能力上，絕大部分品牌的紅酸湯低于農(nóng)家自制；影響紅酸湯抗氧化活性的主要物質(zhì)成分是總黃酮和多酚。進(jìn)一步研究紅酸湯在釀造過(guò)程中多酚和黃酮的變化趨勢(shì)及其組成，研究能保持或提高紅酸湯抗氧化活性的方式。