滋陰明目方通過Akt/FoxO1/FasL通路抑制感光細(xì)胞凋亡治療視網(wǎng)膜色素變性的機(jī)制研究

〔摘要〕 目的 觀察滋陰明目方對視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）小鼠視網(wǎng)膜組織中磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）、叉頭框蛋白1（forkhead box transcription factor O1，F(xiàn)oxO1）以及凋亡相關(guān)因子配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）表達(dá)的影響，探討滋陰明目方抑制感光細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法 將60只rd10小鼠隨機(jī)分為模型組、滋陰明目方低劑量組[10 g/（kg·d）]、滋陰明目方中劑量組[20 g/（kg·d）]、滋陰明目方高劑量組[40 g/（kg·d）]、維生素A組[5 g/（kg·d）]，每組12只；選取12只C57小鼠作為空白對照組（等量生理鹽水），每組連續(xù)干預(yù)28 d。通過眼底照相觀察小鼠眼底形態(tài)改變；進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖檢查并記錄A波和B波振幅；HE染色觀察病理形態(tài)學(xué)變化并測定外核層厚度；Western blot法檢測小鼠視網(wǎng)膜組織p-Akt、FoxO1、FasL、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白（cysteine aspartate-specific protease，Caspase）-3和Caspase-8蛋白表達(dá)。結(jié)果 與空白對照組比較，模型組小鼠視盤蒼白、變形，血管萎縮，視網(wǎng)膜電圖的A波與B波振幅均降低（Plt;0.01），視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)模糊，各層界限不清，感光細(xì)胞大量喪失，外核層明顯變?。≒lt;0.01），視網(wǎng)膜組織中p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.01），F(xiàn)oxO1、FasL、Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01）。與模型組比較，滋陰明目方中、高劑量組及維生素A組小鼠眼底血管較清晰，無視盤蒼白表現(xiàn)；視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列相對整齊。與模型組、滋陰明目方低劑量組比較，滋陰明目方中、高劑量組的A波與B波振幅、視網(wǎng)膜外核層厚度均明顯升高（Plt;0.01），維生素A組的B波振幅、視網(wǎng)膜外核層厚度明顯升高（Plt;0.01）；與滋陰明目方中劑量組比較，滋陰明目方高劑量組的A波與B波振幅、視網(wǎng)膜外核層厚度均明顯升高（Plt;0.01），維生素A組的A波與B波振幅均明顯降低（Plt;0.01）；與滋陰明目方高劑量組比較，維生素A組的A波與B波振幅、視網(wǎng)膜外核層厚度均明顯降低（Plt;0.01）。與模型組比較，滋陰明目方低、中、高劑量組和維生素A組p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01），F(xiàn)oxO1、FasL和Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0.05，Plt;0.01），滋陰明目方中、高劑量組Caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.01）。與滋陰明目方低劑量組比較，滋陰明目方高劑量組和維生素A組p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01），滋陰明目方中、高劑量組FoxO1、FasL、Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.01）。與滋陰明目方中劑量組比較，滋陰明目方高劑量組和維生素A組p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01），滋陰明目方高劑量組FoxO1、Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.01），維生素A組FoxO1、FasL、Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01）。與滋陰明目方高劑量組比較，維生素A組p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.01），F(xiàn)oxO1、FasL、Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01）。結(jié)論 滋陰明目方可能通過調(diào)控Akt/FoxO1/FasL通路，增強p-Akt表達(dá)，抑制FoxO1及下游基因FasL、Caspase-3和Caspase-8的蛋白表達(dá)，從而減少rd10小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡，保護(hù)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能，延緩RP的進(jìn)展。

〔關(guān)鍵詞〕 視網(wǎng)膜色素變性；滋陰明目方；磷酸化蛋白激酶B；叉頭框蛋白1；凋亡相關(guān)因子配體；感光細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

〔中圖分類號〕R276.7 " " " " 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A " " " " "〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.02.005

Mechanism of Ziyin Mingmu Fomula in treating retinitis pigmentosa by inhibiting photoreceptor apoptosis through Akt/FoxO1/FasL pathway

AI Min1， LI Danyang1， ZHOU Pai1， PENG Jun1，2， YANG Yijing1， PENG Qinghua1，2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Hospital of Hunan

University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of Ziyin Mingmu Fomula （ZYMMF） on the expressions of phosphorylated protein kinase B （p-Akt）， forkhead box transcription factor O1 （FoxO1）， and Fas ligand （FasL） in the retinal tissue of mice with retinitis pigmentosa （RP）， so as to explore the mechanism of ZYMMF in inhibiting photoreceptor apoptosis. Methods A total of 60 rd10 mice were randomized into model group， low-， medium-， and high-dose ZYMMF groups [10 g/（kg·d）， 20 g/（kg·d）， and 40 g/（kg·d）， respectively]， and vitamin A group [5 g/（kg·d）]， with 12 mice in each group. Additionally， twelve C57 mice were used as blank control group （equal amount of normal saline）. Each group was continuously intervened for 28 d. Fundus photography was used to observe the morphological changes of the fundus of mice， and electroretinography was performed to record a- and b-wave amplitudes. HE staining was used to observe the pathological changes in the retinal tissue of mice and determine the thickness of the outer nuclear layer， and Western blot was used to check the protein expressions of p-Akt， FoxO1， FasL， cysteine aspartate-specific protease （Caspase）-3， and Caspase-8 in the retinal tissue. Results Compared with blank control group， the retina in model group showed pale and deformed optic disc， vascular atrophy， reduced amplitudes of both a- and b-waves in the electroretinogram （Plt;0.01）， blurred retinal structure， unclear boundaries of each layer， massive loss of photoreceptor cells， significant thinning of the outer nuclear layer （Plt;0.01）， significantly lower p-Akt protein expression level （Plt;0.01）， and markedly higher protein expression levels of FoxO1， FasL， Caspase-3， and Caspase-8 （Plt;0.01）. Compared with model group， the fundus blood vessels in medium- and high-dose ZYMMF groups and vitamin A group were clearer， the optic disc showed no paleness， each layer of the retina was structured clearly， and the cells were arranged relatively neatly. Compared with model and low-dose ZYMMF groups， medium- and high-dose ZYMMF groups showed significantly increased a- and b-wave amplitudes and thicker outer nuclear layer of retina （Plt;0.01）， and vitamin A group showed significantly increased b-wave amplitude and also obviously thicker outer nuclear layer of retina （Plt;0.01）. Compared with medium-dose ZYMMF group， high-dose ZYMMF group showed significantly elevated a- and b-wave amplitudes and thicker outer nuclear layer of retina （Plt;0.01）， while vitamin A group showed significantly decreased a- and b-wave amplitudes （Plt;0.01）. Compared with high-dose ZYMMF group， vitamin A group showed obviously decreased a- and b-wave amplitudes and thinner outer nuclear layer of retina （Plt;0.01）. Compared with model group， the protein expression level of p-Akt in low-， medium-， and high-dose ZYMMF groups and vitamin A group was significantly higher （Plt;0.01）， while those of FoxO1， FasL， and Caspase-3 were lower （Plt;0.05， Plt;0.01）; the Caspase-8 protein expression level in medium- and high-dose ZYMMF groups was significantly reduced （Plt;0.01）. Compared with low-dose ZYMMF group， the p-Akt protein expression level in high-dose ZYMMF and vitamin A groups was obviously elevated （Plt;0.01）， and the protein expression levels of FoxO1， FasL， Caspase-3， and Caspase-8 in medium- and high-dose ZYMMF groups were significantly reduced （Plt;0.01）. Compared with medium-dose ZYMMF group， the p-Akt protein expression level in high-dose ZYMMF and vitamin A groups was significantly higher （Plt;0.01）， the protein expression levels of FoxO1， Caspase-3， and Caspase-8 in high-dose ZYMMF group were significantly lower （Plt;0.01）， and those of FoxO1， FasL， Caspase-3， and Caspase-8 in vitamin A group were significantly higher （Plt;0.01）. Compared with high-dose ZYMMF group， vitamin A group showed obviously lower p-Akt protein expression level （Plt;0.01） but significantly higher protein expression levels of FoxO1， FasL， Caspase-3， and Caspase-8 （Plt;0.01）. Conclusion ZYMMF may enhance p-Akt expression and inhibit protein expressions of FoxO1 and its downstream genes such as FasL， Caspase-3， and Caspase-8 by regulating Akt/FoxO1/FasL pathway， thereby reducing the retinal apoptosis in rd10 mice， protecting the retinal structure and function， and delaying the progression of RP.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 retinitis pigmentosa; Ziyin Mingmu Fomula; phosphorylated protein kinase B; forkhead box transcription factor O1; Fas ligand; photoreceptor cell; apoptosis

視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）是一組以感光細(xì)胞持續(xù)性死亡為主要特征的視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病，具有高度的遺傳異質(zhì)性。RP的主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性夜盲、向心性視野縮窄、雙眼特征性眼底改變等，晚期致盲率較高。目前，全球的RP患者約有250萬，我國患病率為1/4 016～1/3 467，RP已成為導(dǎo)致不可逆失明的重要原因之一[1]。臨床上，通常使用維生素A緩解RP伴發(fā)的夜盲癥狀，部分臨床試驗證明維生素A可以改善RP患者的視力丟失，但目前仍然沒有完全治愈RP的方法[2-3]。

RP在中醫(yī)學(xué)中屬于“高風(fēng)內(nèi)障”“高風(fēng)雀目”范疇?！吨T病源候論·雀目候》記載“人有晝而睛明，至瞑則不見物，世謂之雀目，言其如雀鳥，瞑便無所見也”，認(rèn)識到夜盲是該病的臨床表現(xiàn)之一。關(guān)于RP的病因病機(jī)，歷代醫(yī)家均有論述。《雜病源流犀燭·目病源流》曰：“雀目者，日落即不見物也，此由肝虛血少?！秉S庭鏡在《目經(jīng)大成·陰風(fēng)障血十六》中寫道：“人而陽不勝陰，則氣必下陷，陽氣下陷則陰氣上騰，縱有不光月色，終不能睹?！薄堆劭平痃R》記載該病是由于“陽光不足，腎陰虛損所致”所致[4]。總體而言，醫(yī)者多認(rèn)為本病多由“肝虛血少”“陽不勝陰”“陰虛”等致病。彭清華教授結(jié)合臨床實際，認(rèn)為RP患者除有“虛證”的表現(xiàn)外，還存在“血瘀”的病理現(xiàn)象，治療上采用“補虛活血法”療效較好[5]。

目前研究認(rèn)為，RP導(dǎo)致的視力下降，甚至失明，主要是由感光細(xì)胞的死亡引起[6]。細(xì)胞的程序性死亡是細(xì)胞受某信號或刺激影響時，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種主動性消亡過程，而凋亡屬于其主要形式之一。課題組使用皇家外科學(xué)院（Royal College Surgeon，RCS）大鼠進(jìn)行RP的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)枸杞子-丹參能降低促凋亡蛋白的表達(dá)，減少RCS大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡[7]。本研究通過觀察滋陰明目方對RP小鼠的療效及對磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）、叉頭框蛋白1（forkhead box transcription factor O1，F(xiàn)oxO1）以及凋亡相關(guān)因子配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteine aspartate-specific protease，Caspase）-3和Caspase-8蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討滋陰明目方治療RP的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 "實驗動物

4周齡SPF級rd10小鼠60只，購自美國Jackson Laboratory公司，證書編號：1911A11353，rd10小鼠是常染色體隱性RP的動物模型。4周齡SPF級C57小鼠12只，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號：SYXK（湘）2019-0004，動物質(zhì)量合格證號：430727231102059373。雌雄各半，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，溫度23～25 ℃、濕度50%～55%，環(huán)境12 h明暗循環(huán)，自由攝食、飲水。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號：LL2021042605。

1.2 "藥品及主要試劑

滋陰明目方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)彭清華教授在滋陰明目丸的基礎(chǔ)上根據(jù)具體情況化裁而成。滋陰明目方組成：當(dāng)歸10 g，丹參10 g，山藥10 g，川芎10 g，茯苓15 g，川牛膝5 g，牡丹皮10 g，羌活10 g，枸杞子15 g，山茱萸10 g，酒黃精10 g，菟絲子10 g，石菖蒲10 g，熟地黃15 g，楮實子10 g，三七粉5 g。以上中藥飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診藥房，批號分別是：TH23042502、HH23041001、NG23031303、GW23040301、NG23042401、GW23941？鄄

202、HH23040302、NG23041703、YY23042701、HY23？鄄

032902、2023030102、2023032905、221201、2302173、2208051、81221201，均符合《中華人民共和國藥典（2020年版）》規(guī)范[8]。維生素A膠囊[國藥控股星鯊制藥（廈門）有限公司，國藥準(zhǔn)字H35020246，25 000 IU/粒]。

蘇木精和伊紅染色試劑盒（北京太陽生物生命科學(xué)有限公司，批號：G1315）；p-Akt、FoxO1、FasL、Casp？鄄

ase-3、Caspase-8抗體（澳大利亞Affinity Biosciences生物科技公司，批號分別是AF0016、AF6416、AF0157、AF6311、AF6442）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG（美國Immunoway生物技術(shù)公司，批號分別是RS23710、RS23920）。

1.3 "主要儀器

眼底照相機(jī)、視網(wǎng)膜電圖儀（美國Phoenix Research Labs公司，型號分別為：Phoenix Micron IV、Granzfeld ERG）；JB-P5包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5）；RM2016病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）；成像系統(tǒng)（日本尼康公司，型號：DS-U3）；熒光成像（美國LICOR公司，型號：Odyssey CLX）；電泳電源[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，型號：Universal500V-2.5A-500W）]；SpectraMax酶標(biāo)儀[（美谷分子儀器（上海）有限公司，型號：SpectraMax M5E）]；微量分光光度計（美國NanoDrop 公司，型號：NanoDrop 2000）。

2 方法

2.1 "藥物制備

將中藥飲片倒入煎藥鍋內(nèi)，加入10倍量蒸餾水，浸泡30 min，煮至沸騰后轉(zhuǎn)小火再煮30 min，過濾出藥液。隨后，再加入2倍量蒸餾水，煮至沸騰后續(xù)煮30 min，將2次煎煮的藥液混合后過濾。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將藥液濃縮成濃度為4 g/mL的200 mL混懸液。滅菌后放入4 ℃冰箱冷藏備用。維生素A先溶于DMSO溶劑中，隨后配制成1 g/mL溶液備用。

2.2 "動物分組與給藥

rd10小鼠是由野生型C57小鼠雜交形成的遺傳性純合子基因突變（Pde6b-/-，P-/-）模型，是經(jīng)典的RP動物模型。rd10小鼠一般在出生后3～4周開始出現(xiàn)視網(wǎng)膜變性改變、色素上皮排列紊亂及功能障礙[9]。隨機(jī)選取4周齡rd10小鼠進(jìn)行眼底照相和視網(wǎng)膜電圖檢測進(jìn)行模型評估，若出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素沉積及視網(wǎng)膜電圖異常，可初步判斷模型制備成功[9]。

實驗選用60只4周齡rd10小鼠，將其隨機(jī)分為模型組，滋陰明目方低、中、高劑量組和維生素A組，每組均為12只；選用12只4周齡C57小鼠作為空白對照組，雌雄分籠飼養(yǎng)。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，空白對照組每天予以生理鹽水0.1 mL/10 g灌胃。滋陰明目方臨床用藥1～2 g/d，按照人體和動物體表面積比換算[10]將成人每天1.1 g的劑量等效換算為滋陰明目方低劑量10 g/（kg·d），滋陰明目方中、高劑量組按低劑量的2倍、4倍設(shè)置，即中藥組分別予以滋陰明目方10、20、40 g/（kg·d）灌胃。維生素A組予以維生素A溶液5 g/（kg·d）灌胃，每組連續(xù)干預(yù)28 d。

2.3 "眼底照相

1%戊巴比妥鈉腹腔注射0.2 mL麻醉小鼠，隨后用復(fù)方托比卡胺滴眼液進(jìn)行散瞳。自然光線下，使用Phoenix Micron Ⅳ眼底照相機(jī)分別對各組小鼠進(jìn)行眼底拍攝。

2.4 "視網(wǎng)膜電圖

將待檢測的小鼠放入暗室中適應(yīng)8 h以上，使用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，用復(fù)方托比卡胺滴眼液擴(kuò)瞳。在紅光下，使用Granzfeld視網(wǎng)膜電圖分別對各組小鼠進(jìn)行檢查并記錄A波和B波振幅。

2.5 "視網(wǎng)膜病理學(xué)檢測及外核層厚度測量

活體檢測完成后，脫頸處死小鼠。用眼科鑷將小鼠眼球摘下，放進(jìn)眼球固定液中。將眼球組織依次脫水、浸蠟、包埋、切片。切片脫蠟，按照HE染色試劑盒的說明進(jìn)行染色，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢后進(jìn)行圖像采集，再使用Image J軟件進(jìn)行外核層厚度的測量與分析。

2.6 "Western blot法檢測小鼠視網(wǎng)膜組織p-Akt、FoxO1、FasL、Caspase-3及Caspase-8蛋白表達(dá)

小鼠脫頸處死后，摘取雙側(cè)眼球，鏡下冰上剝離視網(wǎng)膜組織，-80 ℃保存。取適量視網(wǎng)膜組織，加入RIPA裂解液后在冰上充分研磨，提取組織總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。加入一抗（稀釋比例1∶1 000），4 ℃孵育過夜；加入二抗（稀釋比例1∶10 000）室溫下孵育1 h，顯影后，使用圖像處理軟件分析結(jié)果。

2.7 "統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 27.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)均以“ｘ±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊者采用LSD檢驗，方差不齊則采用GamesHowell檢驗，以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 "各組小鼠視網(wǎng)膜眼底形態(tài)比較

眼底照相顯示，空白對照組小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)、密度正常，視盤較圓、邊緣清晰，眼底無色素沉積。模型組小鼠視盤蒼白、變形，血管變細(xì)、萎縮，色素上皮萎縮。與模型組相比，滋陰明目方低劑量組小鼠眼底情況無明顯差別；滋陰明目方中、高劑量組小鼠眼底血管清晰可見，視野下所有血管均充盈且顏色紅潤，亦無視盤蒼白表現(xiàn)；維生素A組小鼠眼底血管較清晰，仍有保持正常灌流的血管。詳見圖1。

3.2 "各組小鼠視網(wǎng)膜電圖比較

與空白對照組比較，模型組，滋陰明目方低、中、高劑量組和維生素A組的A波與B波振幅均降低（Plt;0.05，Plt;0.01）；與模型組、滋陰明目方低劑量組比較，滋陰明目方中、高劑量組的A波與B波振幅均明顯升高（Plt;0.01），維生素A組的B波振幅明顯升高（Plt;0.01）；與滋陰明目方中劑量組比較，滋陰明目方高劑量組的A波與B波振幅均明顯升高（Plt;0.01），維生素A組的A波與B波振幅均明顯降低（Plt;0.01）；與滋陰明目方高劑量組比較，維生素A組的A波與B波振幅均明顯降低（Plt;0.01）。詳見表1，圖2。

3.3 "各組小鼠視網(wǎng)膜組織病理及外核層厚度比較

視網(wǎng)膜組織病理結(jié)果顯示，空白對照組小鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)正常，各層結(jié)構(gòu)清晰，染色均勻，細(xì)胞形態(tài)正常且排列整齊；模型組小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)模糊，各層界限不清，色素上皮層、外核層明顯變薄，細(xì)胞排列紊亂、感光細(xì)胞大量喪失；滋陰明目方低劑量組小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)欠清晰，各層分界不清；滋陰明目方中、高劑量組及維生素A組小鼠視網(wǎng)膜厚度較模型組明顯增加，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列相對整齊。

與空白對照組比較，模型組，滋陰明目方低、中、高劑量組和維生素A組視網(wǎng)膜外核層厚度明顯降低（Plt;0.01）；與模型組、滋陰明目方低劑量組比較，滋陰明目方中、高劑量組和維生素A組視網(wǎng)膜外核層厚度明顯升高（Plt;0.01）；與滋陰明目方中劑量組比較，滋陰明目方高劑量組視網(wǎng)膜外核層厚度明顯升高（Plt;0.01）；與滋陰明目方高劑量組比較，維生素A組視網(wǎng)膜外核層厚度明顯降低（Plt;0.01）。詳見表2、圖3。

3.4 "各組小鼠視網(wǎng)膜組織p-Akt、FoxO1、FasL、Caspase-3及Caspase-8蛋白表達(dá)水平比較

與空白對照組比較，模型組，滋陰明目方低、中、高劑量組和維生素A組p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.01），F(xiàn)oxO1、FasL、Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01）。與模型組比較，滋陰明目方低、中、高劑量組和維生素A組p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01），F(xiàn)oxO1和FasL蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.01），滋陰明目方低、中、高劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0.05，Plt;0.01），滋陰明目方中、高劑量組Caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.01）。與滋陰明目方低劑量組比較，滋陰明目方高劑量組和維生素A組p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01），滋陰明目方中、高劑量組FoxO1、FasL、Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.01）。與滋陰明目方中劑量組比較，滋陰明目方高劑量組和維生素A組p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01），滋陰明目方高劑量組FoxO1、Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.01）；維生素A組FoxO1、FasL、Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01）。與滋陰明目方高劑量組比較，維生素A組p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.01），F(xiàn)oxO1、FasL、Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01）。詳見表3、圖4。

4 討論

視網(wǎng)膜色素變性在中醫(yī)學(xué)中屬于“高風(fēng)內(nèi)障”“高風(fēng)雀目”范疇，主要表現(xiàn)為夜盲和視野進(jìn)行性縮窄。該病的病因以“虛”為主：或腎陽虛虧、命門火衰、陽虛而不制陰，或肝腎兩虧、精血不足、陰陽不濟(jì)，或脾胃虛弱、清陽不升、濁陰上行，或氣血不足、氣虛無以攝血等。課題組經(jīng)過大量的臨床和實驗研究證實，RP雖以虛為本，但以實為標(biāo)，血瘀的病理表現(xiàn)貫穿RP發(fā)病的全過程[11]。滋陰明目方以滋補肝腎、活血明目立法，方中熟地黃為君藥，滋補肝腎、益精填髓；枸杞子、菟絲子、山藥、茯苓、楮實子、酒黃精、山茱萸為臣，共奏滋補肝腎之陰、益氣明目之效；佐以丹參、三七粉、牡丹皮、川牛膝、當(dāng)歸養(yǎng)血活血、行血化瘀，川芎、羌活辛散防瘀，又可引藥上行；使以石菖蒲開竅宣通，疏利目中玄府。諸藥合之，共奏滋補肝腎、活血化瘀之功。該方直切病機(jī)，在臨床上可減輕或延緩RP癥狀。團(tuán)隊前期實驗研究表明，補虛活血中藥能抑制凋亡因子Caspase-12前體、Caspase-2成熟體的表達(dá)，保護(hù)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞[12-13]；枸杞子和丹參通過抗氧化、抗衰老、抗凋亡途徑，對視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)有一定保護(hù)作用[14-17]。在青光眼的基礎(chǔ)研究中，發(fā)現(xiàn)補腎活血中藥可以減少感光細(xì)胞凋亡，通過上調(diào)視網(wǎng)膜磷脂酰肌醇（phosphoinositide 3-Kinase， PI3K）/Akt信號通路中MDM2和p-Akt的表達(dá)，達(dá)到保護(hù)視功能的目的[18]。

小鼠眼底照相結(jié)果顯示，滋陰明目方中、高劑量組小鼠的眼底情況優(yōu)于模型組，血管萎縮情況明顯改善。尤其值得注意的是，與維生素A組小鼠眼底形態(tài)對比發(fā)現(xiàn)，滋陰明目方中、高劑量組中能維持正常血流灌注的血管密度更高，說明其在減少視網(wǎng)膜血管萎縮、改善視網(wǎng)膜組織缺血方面上有一定優(yōu)勢。視網(wǎng)膜電圖檢查主要是用儀器記錄小鼠視網(wǎng)膜受到光刺激后產(chǎn)生的動作電位。A波起源于視網(wǎng)膜的感光細(xì)胞層，其振幅變化反映感光細(xì)胞層的功能改變；而B波源自雙極細(xì)胞，其振幅變化主要反映雙極細(xì)胞對視覺脈沖的傳輸功能。視網(wǎng)膜電圖檢測的A、B波表現(xiàn)為“熄滅型”波時，說明感光細(xì)胞和雙極細(xì)胞遭受嚴(yán)重?fù)p傷，視功能可能嚴(yán)重下降。經(jīng)滋陰明目方治療的小鼠A、B波的振幅均明顯升高[19]。在視網(wǎng)膜病理學(xué)檢測中發(fā)現(xiàn)，滋陰明目方中、高劑量組小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較模型組更清晰、排列整齊，且外核層較厚。視網(wǎng)膜外核層主要由視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞組成，胞體和細(xì)胞核排列密集，其厚度在一定程度上代表了視網(wǎng)膜功能。以上結(jié)果均說明，滋陰明目方對維持RP小鼠視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)與功能及保護(hù)視功能有非常重要的意義。

Akt在維持細(xì)胞增殖、凋亡等方面有著尤為重要的作用，p-Akt參與細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等相關(guān)過程的調(diào)控[20-21]。FoxO轉(zhuǎn)錄因子是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要下游介質(zhì)之一[22-23]，在調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。Western blot結(jié)果提示，在一定劑量的滋陰明目方的作用下，p-Akt在rd10小鼠視網(wǎng)膜組織中高表達(dá)，而FoxO1、FasL、Caspase-3和Caspase-8表達(dá)下降。p-Akt可以激活FoxO亞族轉(zhuǎn)錄因子FoxO1[24]，而FoxO1的入核能夠誘導(dǎo)相關(guān)促凋亡基因FasL的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25-26]，而Caspase-3和Caspase-8作為凋亡相關(guān)因子其表達(dá)量將升高。滋陰明目方通過增強p-Akt的表達(dá)，誘導(dǎo)FoxO1從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移，使其蛋白活性降低，抑制了促凋亡基因FasL的表達(dá)，進(jìn)而降低Caspase-8及Caspase-3的蛋白表達(dá)，從而達(dá)到減少感光細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，滋陰明目方可以減少RP小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡，維持視網(wǎng)膜外核層厚度，保護(hù)視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)及功能。該方對視網(wǎng)膜保護(hù)作用的發(fā)揮可能是通過激活A(yù)kt/FoxO1/FasL通路，上調(diào)p-Akt，下調(diào)FoxO1、FasL的基因表達(dá)水平，進(jìn)而抑制Caspase-8及Caspase-3的表達(dá)實現(xiàn)的。本研究證實，滋陰明目方可能是通過調(diào)控Akt/FoxO1/FasL信號通路減少視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡，從而延緩RP的進(jìn)展，其更深層次的機(jī)制仍有待闡明。

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