大蒜素在體外腦出血細胞模型中的抗炎和抗氧化應激作用

［摘要］" 目的： 探討體外腦出血模型中大蒜素的作用。方法： 選擇新生SD大鼠提取原代星形膠質細胞（astrocyte，ASC）；分別采用氧化血紅素和炎癥因子（IL-1α、TNF-α、C1q）處理原代ASC，構建對應的模擬腦出血后氧化應激損傷和炎癥反應的細胞模型，并用不同濃度大蒜素進行干預。采用CCK-8法檢測細胞活力，CFDA探針檢測細胞內活性氧聚集水平，Tunel染色法觀察凋亡程度，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，蛋白免疫印跡檢測凋亡相關蛋白、ASC表型相關蛋白及血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）等表達變化。結果： 大蒜素處理可增強ASC對血紅素毒性的抵抗作用，減少血紅素引起的活性氧蓄積，減少細胞凋亡，降低促凋亡蛋白表達，并且可抑制A1表型蛋白C3表達，上調A2表型蛋白S100和轉化生長因子表達。此外，大蒜素干預能夠上調Nrf2和HO-1表達。結論： 大蒜素在體外腦出血模型中可減輕氧化應激損傷和炎癥反應，發揮神經保護作用。

［關鍵詞］" 腦出血；星形膠質細胞；大蒜素；炎癥；凋亡；氧化應激

［中圖分類號］" R743.34" ［文獻標志碼］" A" ［文章編號］" 1671-7783（2024）05-0414-09

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230139

［引用格式］桂如林，陸聰，張昊，等. 大蒜素在體外腦出血細胞模型中的抗炎和抗氧化應激作用［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2024， 34（5）： 414-422.

［基金項目］國家自然科學基金青年基金資助項目 （81901250）

［作者簡介］桂如林（1997—），女，碩士研究生；吳衛疆（通訊作者），博士，講師，E-mail： jiang7607@163.com

Anti-inflammatory and anti-oxidative stress effects of allicin in intracerebral hemorrhage cell model

GUI Rulin， LU Cong， ZHANG Hao， ZHANG Xingxing， SHE Jie， WU Weijiang

（School of Medicine， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212013， China）

［Abstract］" Objective： To investigate the effect of allicin in vitro intracerebral hemorrhage model. Methods： Primary astrocyte （ASC） was extracted from neonatal SD rats. Primary ASC was treated with oxidized heme and inflammatory factors （IL-1α， TNF-α and C1q）， respectively， and the corresponding cell model of oxidative stress injury and inflammatory response after intracerebral hemorrhage was constructed， and various concentrations of allicin were chosen for further experiments. The cell viability was evaluated by CCK-8， the intracellular reactive oxygen species accumulation level was measured by CFDA probe， the degree of apoptosis was observed by Tunel staining， the apoptosis rate was detected by flow cytometry， and the changes of apoptosis-related proteins， ASC phenotype-related proteins and HO-1， Nrf2， and so on were detected by Western blotting. Results： Allicin treatment could enhance the resistance of ASC to hemin toxicity， reduce the accumulation of reactive oxygen species caused by hemin， cell apoptosis and the expression of pro-apoptotic proteins， and also inhibit the expression of A1 phenotype protein C3 and up-regulate the expression of A2 phenotype protein S100 and TGF. In addition， allicin intervention could increase the expression of NRF2 and HO-1， and promote the nuclear translocation of Nrf2. Conclusion： Allicin could reduce oxidative stress and inflammatory response in an in vitro cerebral hemorrhage model， and exert neuroprotective effects.

［Key words］" intracerebral hemorrhage; astrocytes; allicin; inflammation; apoptosis; oxidative stress

腦出血是指由非外傷因素導致腦實質出血，又稱自發性出血［1］。腦出血發病迅猛，可在較短時間內造成嚴重腦損傷，具有較高的發病率和死亡率［2-4］。腦出血引起的大腦損傷分為原發性損傷和繼發性損傷兩類［3］；繼發性神經損傷包括毒性反應、炎癥反應和氧化應激損傷。腦出血發生后，從壞死和受損組織中釋放出滲出性血液成分如補體、免疫球蛋白、凝血因子等以及血紅蛋白的降解產物［5-6］。

星形膠質細胞（astrocyte，ASC）作為中樞神經系統中最主要的膠質細胞，廣泛分布于腦組織神經細胞間和血管外間隙中，在調節神經元存活、遞質代謝、信號傳遞以及維持血腦屏障等方面發揮重要作用［7］。當中樞神經系統受到創傷、缺血和發生神經退變時，為應對各種損傷，ASC從靜息態變為反應性，這已成為中樞神經系統病變的病理標志［8-9］。反應性ASC包含多種亞群，在繼發性神經損傷和組織修復中具有雙重作用，基于基因表達的差異，可分為具有神經毒性的A1型和具有神經保護作用的A2型兩種表型，A1型ASC表達C3標志蛋白，A2型ASC表達S100a10、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）標志蛋白［10］。

大蒜素是大蒜中存在的主要生物活性化合物之一，屬于一種有機含硫化合物，通過與蛋白質中的谷胱甘肽和巰基發生氧化還原反應從而發揮生物活性［11-12］。大蒜素及其產生的一系列具有生物活性的有機硫化合物在抗氧化、抗凋亡和免疫調節方面發揮作用，其多效性可能與其產生的蛋白質翻譯后修飾有關［13-14］。此外，大蒜素通過與多種信號通路相互作用，減輕炎癥反應所致的神經損傷并改善認知功能［12，15］。

大蒜素在缺血性腦卒中、蛛網膜下腔出血等神經性病變中表現出神經保護作用［15-16］，但其在腦出血中的作用尚不清楚。因此，本研究擬通過建立模擬腦出血后繼發性炎癥反應和氧化應激損傷的細胞模型，觀察大蒜素的作用并探討其可能的作用機制。

1" 材料與方法

1.1" 材料

出生1～3 d的SD大鼠，雌、雄各5只，購自江蘇大學實驗動物中心，許可證編號：SCXK 2018-0012。

高糖型DMEM和青霉素鏈霉素購自美國Hyclone公司；大蒜素和血紅素購于上海麥克林生化科技公司；CCK-8細胞計數試劑盒、一步法Tunel染色試劑盒、活性氧試劑盒和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司；RIPA裂解緩沖液、PMSF、Cocktail和ECL發光液購自武漢Servicebio公司；DAPI購自美國Sigma公司；鼠抗Tubulin抗體、HRP標記的羊抗鼠、HRP標記的羊抗兔、488標記的羊抗兔二抗和Cy3標記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物公司；兔單抗半胱氨酸蛋白酶Caspase3、Cleaved-caspase3、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）、磷酸化PKB/Akt（phosphorylated PKB/Akt，p-PKB/p-Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷酸化MAPK（phosphorylated MAPK，p-MAPK）、核因子-κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）、NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）、磷酸化IκB（phosphorylated IκB，p-IκB）抗體購自美國CST公司；兔單抗血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗體購自美國Proteintech公司；補體3（complement 3，C3）、BCL-2相關X蛋白（BCL-2-associated X protein，Bax）抗體購自英國Abcam公司；兔單抗S100抗體購于美國Thermo公司；兔單抗TGF-β抗體購自美國Affinity Biosciences公司。

1.2" 方法

1.2.1" 原代ASC提取" 將新生的SD大鼠浸泡于75%乙醇中進行處死并消毒，隨后置于超凈工作臺，剪開頭皮并剝去顱骨，取出全腦。在預冷PBS中去除小腦，并將兩側大腦半球分離，在手術放大鏡下剝除腦膜、血管和海馬體。剩余的大腦皮質用0.25%胰蛋白酶消化10 min，并通過輕柔地吹打解離。于25 ℃行1 000×g離心7 min收集細胞沉淀，重懸于含90% DMEM、10%胎牛血清和100 U/mL青霉素鏈霉素的培養基中。將細胞置于含5% CO2的37 ℃細胞培養箱中，每3 d更換1次培養基。細胞融合后通過振蕩搖落法清除上層小膠質細胞，采用免疫熒光染色驗證ASC純度。

1.2.2" ASC活力測定

1.2.2.1" 測定大蒜素對ASC活力的影響" 將ASC以5×103密度接種于96孔板，分為0、10、50、100、250、500、750、1 000 μmol/L大蒜素組，常規培養24 h，分別更換含有0、10、50、100、250、500、750、1 000 μmol/L大蒜素（用10%二甲基亞砜溶解）的無血清DMEM孵育24 h；將10 μL CCK-8溶液分別加至對應孔中，于37 ℃、5% CO2孵育1.5 h；采用酶標儀檢測450 nm處光密度（D）值，選擇最適大蒜素濃度進行后續實驗。

1.2.2.2" 測定大蒜素抑制血紅素導致的細胞毒性" 選擇200 μmol/L大蒜素作為最適濃度，以不同濃度血紅素處理ASC代表不同毒性強度。將ASC以5×103密度接種于兩塊96孔板，常規培養24 h；一塊96孔板分別更換為含0、5、10、20、30、50 μmol/L血紅素（用10 mmol/L NaOH溶解）的無血清DMEM孵育12 h；另一塊96孔板先用含200 μmol/L大蒜素的常規DMEM孵育24 h，再分別更換為含0、5、10、20、30、50 μmol/L血紅素的無血清DMEM孵育12 h；將10 μL CCK-8溶液分別加至對應孔中，于37 ℃、5% CO2孵育1.5 h；采用酶標儀檢測450 nm處細胞D值。

1.2.3" 血紅素誘導建立氧化應激細胞模型及大蒜素干預

1.2.3.1" 細胞分組" 選擇血紅素對ASC的半數致死量（25 μmol/L）進行實驗。ASC分組如下：對照組，細胞常規培養24 h，更換DMEM孵育24 h，更換無血清DMEM孵育12 h；血紅素組，細胞常規培養24 h，更換DMEM孵育24 h，更換含25 μmol/L血紅素的無血清DMEM孵育12 h；溶劑對照組，細胞常規培養24 h，更換含10 mmol/L NaOH的DMEM孵育24 h，更換無血清DMEM孵育12 h；血紅素+不同濃度大蒜素組，細胞常規培養24 h，分別更換含50、100、200 μmol/L大蒜素的無血清DMEM孵育24 h，更換含25 μmol/L血紅素的DMEM孵育12 h。

1.2.3.2" Tunel染色法檢測細胞凋亡" 將“1.2.3.1”分組處理ASC接種于無菌蓋玻片，用0.3% Triton X-100于冰上處理細胞2 min；隨后將細胞置于50 μL Tunel反應緩沖液中，37 ℃孵育1 h；用 DAPI（1∶5 000稀釋）復染細胞核。采用正置熒光顯微鏡采集圖像（德國Carl Zeiss公司）。

1.2.3.3" Annexin V-FITC檢測細胞凋亡" 將“1.2.3.1”分組處理ASC以1×105密度接種至6孔板，根據Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒說明進行處理，20～25 ℃避光孵育10～20 min；于30 min內采用流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）進行檢測。

1.2.3.4" 細胞活性氧測定" 將“1.2.3.1”分組處理ASC以5×105密度接種至6孔板，將細胞與10 μmol/L DCFH-DA避光孵育30 min；PBS洗滌2次；采用流式細胞儀或熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）檢測熒光。

1.2.3.5" 蛋白質印跡測定凋亡相關蛋白表達水平" 將“1.2.3.1”分組處理ASC以5×105密度接種于6孔板，棄上清液并用添加PMSF和Cocktail的RIPA裂解緩沖液制備全細胞裂解物。配制10%凝膠，行60 V電泳，當Marker位置到達濃縮膠底部分界處時，將電壓調為110 V繼續電泳40 min；在冰浴中以300 mA恒流轉膜60 min，將蛋白轉至PVDF膜；5%脫脂牛奶于室溫封閉2 h；4 ℃一抗孵育過夜，兔抗Bax抗體、Caspase3抗體、Cleaved-caspase3抗體、Akt抗體、p-Akt抗體、MAPK抗體、p-MAPK抗體以及內參β-微管蛋白，稀釋比均為1∶1 000；TBST室溫洗膜3次，每次5 min；二抗室溫孵育60 min，稀釋比為1∶5 000；TBST洗滌，在膜上滴加ECL溶液，采用Tanon圖像系統（上海天能公司）進行顯影。

1.2.4" 檢測大蒜素干預對HO-1和Nrf2相對表達的影響

1.2.4.1" 細胞分組" ASC分組如下：對照組，ASC常規培養24 h，更換為常規DMEM孵育24 h；溶劑對照組，ASC常規培養24 h，更換為含二甲基亞砜的DMEM孵育24 h；不同濃度大蒜素組，ASC常規培養24 h，分別更換為含50、100、200 μmol/L大蒜素的DMEM孵育24 h。

1.2.4.2" 蛋白質印跡測定HO-1和Nrf2蛋白相對表達" 取“1.2.4.1”分組處理細胞，以5×105密度接種于6孔板，后續制備全細胞裂解物與蛋白質免疫印跡步驟同“1.2.3.5”，一抗兔抗HO-1、Nrf2及內參β-微管蛋白稀釋比均為1∶1 000，二抗稀釋比為1∶5 000。

1.2.5" 炎癥因子誘導建立炎癥反應細胞模型及大蒜素干預

1.2.5.1" 細胞分組" 將ASC進行如下分組：對照組，ASC常規培養24 h，更換DMEM孵育24 h，再次更換DMEM孵育24 h；炎癥因子組，ASC常規培養24 h，更換DMEM孵育24 h，更換為含3 ng/mL IL-1α、30 ng/mL TNF-α、400 ng/mL C1q的DMEM孵育24 h；炎癥因子+不同濃度大蒜素組，ASC常規培養24 h，分別更換為含50、100、200 μmol/L大蒜素的DMEM孵育24 h，更換為含3 ng/mL IL-1α、30 ng/mL TNF-α、400 ng/mL C1q的DMEM孵育24 h。

1.2.5.2" 蛋白質印跡測定ASC表型轉化相關蛋白表達水平" 取“1.2.5.1”分組處理細胞，以5×105密度接種于6孔板，后續制備全細胞裂解物與蛋白質免疫印跡步驟同“1.2.3.5”，內參β-微管蛋白和兔抗C3抗體、S100a10抗體、兔抗TGF-β抗體、IκB抗體，稀釋比均為1∶1 000，二抗稀釋比為1∶5 000。

1.3" 統計分析

實驗至少獨立重復3次，數據以均數±標準差（x±s）表示。數據統計分析及統計表繪制采用GraphPad Prism 6.0。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey多重比較法。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1" 大蒜素可抑制血紅素對ASC的毒性

用不同濃度大蒜素處理細胞24 h，評估其對ASC的安全濃度。如圖1A所示，與0 μmol/L大蒜素相比，50、100、250 μmol/L大蒜素組細胞活力顯著上升（Plt;0.05），當大蒜素濃度高于250 μmol/L時，細胞活力呈下降趨勢，但差異無統計學意義。因此，選擇50、100、200 μmol/L大蒜素用于后續實驗對比劑量區別；選擇200 μmol/L大蒜素作為最適濃度。

如圖1B顯示，分別與對應濃度血紅素組相比，200 μmol/L大蒜素+20、30、50 μmol/L血紅素組細胞活力顯著上升（Plt;0.01）。此外，血紅素對ASC的半數致死量為25 μmol/L，因此選用該濃度用于后續實驗。

A：大蒜素對ASC活力的影響；B：大蒜素聯合血紅素處理對ASC活力的影響；*：Plt;0.05，與0 μmol/L大蒜素組比較；Δ：Plt;0.01，與對應濃度血紅素組比較

2.2" 大蒜素處理可抑制血紅素引起的活性氧蓄積

免疫熒光染色結果顯示，與對照組和溶劑對照組相比，血紅素組細胞內綠色熒光信號增強，血紅素+50、100、200 μmol/L大蒜素組細胞內綠色熒光信號減弱，見圖2A。流式細胞儀分析結果顯示，與對照組相比，血紅素組平均熒光強度顯著升高（Plt;0.01）；與血紅素組相比，血紅素+100、200 μmol/L大蒜素組平均熒光強度顯著降低（Plt;0.05或Plt;0.01），血紅素+200 μmol/L大蒜素組平均熒光強度較血紅素+50 μmol/L大蒜素組顯著降低（Plt;0.05），見圖2B、2C。

2.3" 大蒜素處理可抑制血紅素引起的細胞凋亡

Tunel染色結果顯示，與對照組相比，血紅素組中代表凋亡細胞的紅色熒光信號較強，大蒜素處理可以減弱細胞內紅色熒光信號，見圖3A。

流式細胞術結果顯示，與對照組相比，血紅素組細胞凋亡率顯著升高（Plt;0.01）；與血紅素組相比，血紅素+100、200 μmol/L大蒜素組細胞凋亡率均顯著降低（P均lt;0.01），其中，血紅素+200 μmol/L大蒜素組細胞凋亡率顯著低于血紅素+50 μmol/L大蒜素組和血紅素+100 μmol/L大蒜素組（Plt;0.01或Plt;0.05）。見圖3B、3C。

蛋白免疫印跡結果顯示，與對照組相比較，血紅素組中Cleaved caspase-3/caspase-3比值顯著增加（Plt;0.01）；與血紅素組相比較，血紅素+100、200 μmol/L大蒜素組中Cleaved caspase-3/caspase-3比值均顯著下降（P均lt;0.01）；與對照組相比，血紅素組中促凋亡蛋白Bax表達量顯著增加（Plt;0.01），與血紅素組相比，血紅素+50、100、200 μmol/L大蒜素組中Bax蛋白表達均顯著減低（Plt;0.05或Plt;0.01），血紅素+200 μmol/L大蒜素組中Bax蛋白表達顯著低于血紅素+50 μmol/L大蒜素組和血紅素+100 μmol/L大蒜素組（P均lt;0.01）。見圖3D。

2.4" 大蒜素預處理可上調Nrf2/HO-1表達

蛋白免疫印跡結果顯示，與對照組相比，100、200 μmol/L大蒜素組中HO-1表達量顯著增加（P均lt;0.05）；且200 μmol/L大蒜素組中HO-1表達量明顯高于50 μmol/L大蒜素組（Plt;0.05），見圖4A。與對照組相比，100、200 μmol/L大蒜素組中Nrf2表達量顯著增加（P均lt;0.01），100、200 μmol/L大蒜素組中Nrf2表達量均顯著高于50 μmol/大蒜素組（P均lt;0.05），見圖4B。

A：熒光顯微鏡觀察各組ASC內活性氧染色熒光信號（比例尺為200 μm）；B：流式細胞儀檢測各組ASC平均熒光強度；C：各組ASC平均熒光強度比較；① 對照組；② 血紅素組；③ 溶劑對照組；④ 血紅素+50 μmol/L大蒜素組；⑤ 血紅素+100 μmol/L大蒜素組；⑥ 血紅素+200 μmol/L大蒜素組

A：Tunel染色法檢測各組細胞凋亡情況（比例尺為100 μm）；B：流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率；C：細胞凋亡率比較；D：蛋白免疫印跡檢測相關蛋白的相對表達；① 對照組；② 血紅素組；③ 溶劑對照組；④ 血紅素+50 μmol/L大蒜素組；⑤ 血紅素+100 μmol/L大蒜素組；⑥ 血紅素+200 μmol/L大蒜素組

A：各組ASC中HO-1蛋白相對表達水平比較；B：各組ASC中Nrf2蛋白相對表達水平比較；① 對照組；② 溶劑對照組；③ 50 μmol/L大蒜素組；④ 100 μmol/L大蒜素組；⑤ 200 μmol/L大蒜素組

2.5" 大蒜素預處理可上調p-Akt/Akt和p-MAPK/MAPK比值

如圖5A、5B所示，與對照組相比，血紅素組p-Akt/Akt比值顯著減低（Plt;0.01）；與血紅素組相比，血紅素+50、100、200 μmol/L大蒜素組p-Akt/Akt比值顯著上調（P均lt;0.01），其中，血紅素+200 μmol/L大蒜素組比值顯著高于血紅素+50、100 μmol/L大蒜素組（P均lt;0.01）。

如圖5C、5D所示，與對照組相比，血紅素組p-MAPK/MAPK比值顯著降低（Plt;0.01）；與血紅素組相比，血紅素+50、100、200 μmol/L大蒜素組p-MAPK/MAPK比值均顯著升高（Plt;0.05或Plt;0.01），其中，血紅素+200 μmol/L大蒜素組顯著高于血紅素+50 μmol/L大蒜素組（Plt;0.05）。

2.6" 大蒜素預處理下調ASC A1表型蛋白表達，上調A2表型蛋白表達

如圖6A所示，與對照組相比，炎癥因子組C3相對表達明顯增加（Plt;0.05），與炎癥因子組相比，炎癥因子+100、200 μmol/L大蒜素組C3相對表達顯著下降（Plt;0.05或Plt;0.01）。

如圖6B所示，與對照組相比，炎癥因子組中TGF-β相對表達顯著下降（Plt;0.01）；與炎癥因子組相比，炎癥因子+100、200 μmol/L大蒜素組中TGF-β相對表達顯著增加（Plt;0.01）；與對照組相比，炎癥因子組中S100a10相對表達明顯下降（Plt;0.01），與炎癥因子組相比，炎癥因子+200 μmol/L大蒜素組中S100a10相對表達明顯上升（Plt;0.01）。

如圖6C所示，與對照組相比，炎癥因子組p-IκB表達量增多，p-IκB/IκB比值明顯升高（Plt;0.01）；與炎癥因子組相比，炎癥因子+100、200 μmol/L大蒜素組p-IκB表達量減少，p-IκB/IκB比值明顯下降（P均lt;0.01）。

A：蛋白免疫印跡檢測p-Akt和Akt相對表達；B：蛋白免疫印跡檢測p-MAPK和MAPK相對表達；① 對照組；② 血紅素組；③ 溶劑對照組；④ 血紅素+50 μmol/L大蒜素組；⑤ 血紅素+100 μmol/L大蒜素組；⑥ 血紅素+200 μmol/L大蒜素組

A：各組C3相對表達水平比較；B：各組S100和TGF相對表達水平比較；C：各組p-IκB/IκB比值比較；① 對照組；② 炎癥因子組；③ 炎癥因子+50 μmol/L大蒜素組；④ 炎癥因子+100 μmol/L大蒜素組；⑤ 炎癥因子+200 μmol/L大蒜素組

3" 討論

考慮到腦出血后血紅蛋白引起的繼發性神經損傷是病情惡化的關鍵因素，參考本課題組之前的研究［17］，本實驗采用血紅素誘導的方法構建腦出血后繼發性毒性損傷模型，選用炎癥因子IL-1、TNF-α、C1q作為誘導劑，構建穩定的A1型ASC模型。相比采用凝血酶在體外模擬腦出血的方法，此法簡單、快捷、重復性好，消除了凝血酶濃度差異所致的不穩定因素對實驗結果產生的影響［18-19］。本研究結果顯示，血紅素顯著增加了ASC內的活性氧含量和細胞凋亡，大蒜素可增強ASC對血紅素毒性的抵抗，減少血紅素引起的活性氧蓄積，減少細胞凋亡；炎癥因子可激活ASC形成A1表型，而大蒜素抑制其引起的A1極化。對比不同濃度大蒜素對ASC保護作用的差異，結果表明，在ASC活性氧水平、HO-1和Nrf2蛋白相對表達水平分析中，200 μmol/L大蒜素處理組指標顯著優于50 μmol/L大蒜素組；在ASC凋亡率、Bax、p-Akt/Akt相對表達水平分析中，200 μmol/L大蒜素組指標顯著優于100 μmol/L和50 μmol/L大蒜素組；在p-MAPK/MAPK相對表達水平分析中，200 μmol/L大蒜素組顯著優于50 μmol/L大蒜素組。由此說明，隨著大蒜素濃度升高，作用效果越明顯，在50 μmol/L和200 μmol/L處理濃度的對比中，呈一定的濃度依賴性。

HO-1是Nrf2下游基因，可將有毒的血紅素降解為膽紅素，其表達增加是機體對氧化損傷的一種適應性保護反應［20］。研究表明，激活Nrf2/HO-1通路有助于減弱血腫周圍的損傷級聯反應，并減輕腦出血后的腦損傷和神經功能缺損［21-22］。本實驗結果顯示，大蒜素處理可致ASC中Nrf2和HO-1蛋白相對表達量增加，這可能是大蒜素幫助ASC抵御氧化應激損傷的機制，且200 μmol/L大蒜素組指標優于50 μmol/L大蒜素組，呈一定的濃度依賴性。

PI3K/Akt信號通路活化可促進或抑制神經細胞內多種蛋白磷酸化，調控神經細胞存活、增殖、分化、自噬及調控神經細胞突觸可塑性等，與神經系統疾病的發生密切相關［23］。針對藥物作用機制的研究發現，TREM2和CCR4能夠通過促進Akt磷酸化發揮對腦出血后損傷的保護效應［24-25］。MAPK途徑在細胞凋亡、炎癥和應激中起重要作用；MAPK的磷酸化激活是一種防御機制，與促凋亡蛋白的下調和抗凋亡蛋白的上調密切相關，有助于減輕神經元損傷所產生的有害影響，在一些神經疾病模型中具有神經保護作用［26-27］。本研究結果顯示，大蒜素處理可促進Akt磷酸化，且200 μmol/L大蒜素組優于100、50 μmol/L大蒜素組；此外，大蒜素處理可促進MAPK磷酸化，且200 μmol/L大蒜素組顯著優于50 μmol/L大蒜素組，這與大蒜素抗細胞凋亡作用相一致。由此推測，大蒜素在血紅素神經毒性模型中對ASC的保護作用可能與其促進Akt和MAPK磷酸化有關。

A1型ASC介導的免疫級聯反應在腦出血誘導的腦損傷和修復進展中起關鍵作用［28-29］。A1型ASC上調補體成分C3表達，其作用包括分泌神經毒素，抑制突觸形成和誘導神經元快速死亡等［30］。A1型ASC的活化過程與NF-κB通路密切相關［31-32］。A2型ASC則上調一些神經營養因子如S100a10、TGF-β表達，參與神經元存活、生長與分化［33-34］。將抗炎藥物注入神經損傷部位后，可抑制該部位A1型反應性ASC的活化，從而使神經功能得到改善與恢復［35-36］。盡早干預A1型反應性ASC轉化的關鍵機制，如抑制I-κB磷酸化，有助于抑制A1表型的產生［37］。本研究進一步探究了I-κB磷酸化情況，結果表明大蒜素處理可下調I-κB磷酸化水平。由此表明，大蒜素可能通過抑制I-κB磷酸化的方式，從而逆轉由炎癥因子誘導的ASC A1極化現象。

綜上所述，本研究表明大蒜素在模擬腦出血環境的氧化應激損傷和炎癥反應細胞模型中具有良好的神經保護作用，其保護作用與劑量有關，呈一定的濃度依賴性。然而，本研究尚未探討時間效應對大蒜素保護作用的影響。此外，大蒜素在腦出血體內模型中的具體保護作用機制有待后續進一步探討。

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［收稿日期］" 2023-05-22" ［編輯］" 劉星星