磷霉素聯合亞胺培南對攜帶blaNDM的耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌的體外抗菌活性

摘要：目的 探究磷霉素與亞胺培南聯合使用對攜帶blaNDM的耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌（carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE）的體外抗菌活性。方法 收集2021—2022年蘇州大學附屬第二醫院醫學檢驗中心臨床分離的非重復CRE，并通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction， PCR）篩選出攜帶blaNDM的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae， CR-KP）和耐碳青霉烯類大腸埃希菌（carbapenem-resistant Escherichia coli， CR-E. coli）。通過微量肉湯稀釋法測定菌株對常用抗生素的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）和瓊脂稀釋法測定菌株對磷霉素的MIC；采用棋盤法分別測定磷霉素與6種抗生素聯用的部分抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentration index， FICI）以判定藥物聯合效果；通過時間殺菌實驗判斷磷霉素與亞胺培南體外聯合殺菌效果；采用結晶紫染色法檢測菌株生物膜形成能力；通過熒光定量PCR檢測不同抗生素條件下菌株blaNDM、fosA、mrkA和murA基因的轉錄水平。結果 PCR篩選出24株攜帶blaNDM基因的CR-KP（12/24）和CR-E. coli（12/24）。棋盤試驗顯示磷霉素聯合亞胺培南的協同作用（FICI≤0.5）相較其他抗生素效果最好（70.8%）。時間殺菌實驗顯示，磷霉素聯合亞胺培南作用24 h內細菌數降低≥3 log10CFU/mL，呈現出較強的殺菌效應。結晶紫染色結果顯示磷霉素與亞胺培南聯合可以抑制細菌生物膜形成。熒光定量PCR結果顯示，磷霉素與亞胺培南聯合處理后，生物膜形成與Ⅲ型菌毛合成重要基因mrkA表達相較對照組和亞胺培南組顯著下調，而細胞壁形成重要基因murA表達相較其他兩組上調。結論 磷霉素與亞胺培南聯用可以抑制細菌生長，其可能通過減少生物膜形成、影響菌毛和細胞壁形成等方面對攜帶blaNDM的CR-KP與CR-E. coli發揮協同抗菌或殺菌作用。

關鍵詞：磷霉素；亞胺培南；聯合用藥；肺炎克雷伯菌；大腸埃希菌

中圖分類號：R969.3 文獻標志碼：A

In vitro antibacterial activity of fosfomycin combined with imipenem against blaNDM-positive carbapenem-resistant Enterobacterales strains

Lin Jiayao， Zhu Jie， Wen Yicheng， Wang Liang， Zhai Yaxuan， Qian Yan， and Du Hong

（Department of Clinical Laboratory， the Second Affiliated Hospital of Soochow University， Suzhou 215004）

Abstract Objective To explore the in vitro antibacterial activity of fosfomycin combined with imipenem against blaNDM-positive carbapenem-resistant Enterobacterales （CRE） strains. Methods Non-duplicate CRE strains were collected from the Department of Clinical Laboratory of the Second Affiliated Hospital of Soochow University during 2021-2022. And carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae （CR-KP） and carbapenem-resistant Escherichia coli （CR-E. coli） carrying blaNDM were screened by polymerase chain reaction （PCR）. Minimum inhibitory concentrations （MIC） of the strains against common antibiotics were determined by the microbroth dilution method， and the MIC of fosfomycin was determined by the agar dilution method. The effects of fosfomycin combined with other 6 antibiotics were described by fractional inhibitory concentration index （FICI） via checkerboard methods. A time-kill assay was conducted to observe the bactericidal effects of the combination of fosfomycin and imipenem in vitro. The ability of the biofilm formation was determined by crystal violet staining. Moreover， the transcription levels of blaNDM， fosA， mrkA， and murA genes under different antibiotic conditions were detected by fluorogenic quantitative PCR. Results A total of 24 strains of CR-KP （12/24） and CR-E. coli （12/24） carrying the blaNDM gene were screened out by PCR. The checkerboard tests showed the best synergistic effect （FICI≤0.5） in the combination of fosfomycin with imipenem （70.8%） compared with other antibiotics. The time-kill assays showed that the combination of fosfomycin with imipenem reduced the number of bacteria to at least 3 log10CFU/mL within 24 hours， indicating a strong bactericidal effect. Crystal violet staining showed that fosfomycin combined with imipenem could inhibit the formation of bacterial biofilm. Fluorogenic quantitative PCR showed that mrkA， an important gene for biofilm and type Ⅲ fimbriae formation， was significantly down-regulated under the combination of fosfomycin and imipenem compared with control groups and imipenem groups， while the important gene murA for cell wall formation was up-regulated compared with the other two groups. Conclusion The combination of fosfomycin with imipenem can inhibit bacterial growth， which may exert a synergistic antibacterial or bactericidal effect on blaNDM-positive CR-KP and CR-E. coli by reducing biofilm formation， affecting fimbriae and cell wall formation.

Key words Fosfomycin; Imipenem; Drug combination; Klebsiella pneumoniae; Escherichia coli

碳青霉烯類抗生素被認為是治療多重耐藥腸桿菌目細菌感染的最后一道防線，但隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應用，耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌目細菌（carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE）檢出率日趨增多。CRE已被WHO列為最高等級“緊急威脅”之一[1]。在國內，CRE的耐藥機制主要是產碳青霉烯酶KPC和NDM，目前針對產KPC的CRE已經有了較好的治療選擇[2-4]，但對產NDM的CRE的治療方案較少，亟須尋找有效的治療方案。

磷霉素單藥使用時，組織分布良好，耐受性好，相比黏菌素與替加環素等主流藥物價格低[5]，不良反應少。但磷霉素血藥濃度較低，單藥治療時需要的劑量較大[6]，容易引起耐藥。因此，臨床較少單獨使用磷霉素進行抗感染治療。另一方面，磷霉素有較獨特的作用機制，其交叉耐藥性低，可以為其他抗生素提供協同作用[7]。因此，磷霉素與其他抗生素聯合使用可能是一種更為有效的治療措施。聯合用藥不僅可以減少抗生素的用量和降低藥物毒性[8]，而且相比單一用藥具有更好的殺菌效果，能減少細菌耐藥現象的發生[9]。近期相關研究證明了磷霉素與頭孢噻肟等頭孢菌素聯合治療金黃色葡萄球菌感染的有效性[10]，體外和體內試驗也驗證了磷霉素與多黏菌素或美羅培南聯合對于產KPC酶的腸桿菌目細菌的抑菌作用[11]。目前針對磷霉素聯合不同抗生素用于產NDM酶的腸桿菌目細菌的研究較少，其作用機制也不甚清晰。因此，本文旨在通過體外實驗，來評估磷霉素和亞胺培南聯合使用對攜帶blaNDM的CRE的體外殺菌活性，為臨床治療產NDM腸桿菌提供更多的用藥選擇。

1 儀器與材料

1.1 材料

菌株：大腸埃希菌（Escherichia coli，E. coli）標準菌株ATCC25922為本實驗室保存的菌株，24株臨床菌株均分離于蘇州大學附屬第二醫院醫學檢驗中心。分離菌株均用30%甘油凍存于-80 ℃冰箱中。

藥品及試劑：Dream TaqTM Green PCR Master Mix（2×）（Thermo）、磷霉素（Abcam，CAS：AB141215）、亞胺培南（MCE，CAS：74431-23-5）、頭孢他啶（MCE，CAS：72558-82-8）、環丙沙星（MCE，CAS：85721-33-1）、黏菌素（MCE，CAS：1264-72-8）、替加環素（Abcam，CAS：AB142000）、慶大霉素（BioFRoxx，CAS：1405-41-0）、細菌RNA提取試劑盒（諾唯贊）、HiScript Ⅲ RT SuperMix kit（諾唯贊）、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix kit（諾唯贊）。

培養基：M-H瓊脂（蘇州偉沃生物科技有限公司）、M-H肉湯培養基（蘇州偉沃生物科技有限公司）、腦心浸液肉湯（上海博微生物科技有限公司）。

1.2 儀器

PCR擴增儀（Applied Biosystems公司）、超凈純水儀（杭州永杰達凈化科技有限公司）、凝膠電泳儀（Bio-Rad公司）、凝膠成像系統分析儀（Bio-Rad公司）、電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）、全自動微生物生長曲線檢測儀（FLUOstar Omega公司）、恒溫震蕩培養箱（知楚儀器公司）、生化恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）、微量核酸蛋白測定儀（Eppendorf公司）、實時熒光定量PCR儀（ThermoFisher Applied Biosystems公司）。

2 方法

2.1 blaNDM耐藥基因的檢測

采用PCR法對臨床收集到的所有CRE進行耐藥基因blaNDM的篩選。引物序列為NDM-F：5'-CCAATATTATGCACCCGGTCG-3'；NDM-R：5'-GCGGAATGGCTCATCACG-3'。反應體系為15 μL，含7.5 μL 2×Taq PCR Master Mix、0.75 μL NDM-F、0.75 μL NDM-R、4.5 μL ddH2O和1.5 μL模板DNA。反應條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共30個循環，最后72 ℃終延伸7 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，置于凝膠成像系統觀測擴增條帶。

2.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定

采用微量肉湯稀釋法[12]，分別測定亞胺培南（imipenem，IMP）、頭孢他啶（ceftazidime，CAZ）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、黏菌素（colistin，COL）、替加環素（tigecycline，TGC）和慶大霉素（gentamicin，GEN）的MIC。采用瓊脂稀釋法測定磷霉素（fosfomycin，FOS）的MIC。以ATCC25922作為參考菌株，參照2022年美國臨床和實驗室標準化協

會[13]（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）和2024年歐洲藥敏試驗委員會[14]（European Commitee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）推薦的規范和折點實施試驗和判讀結果。實驗重復3次。

2.3 聯合藥敏試驗

棋盤法測定FOS分別與IMP、CAZ等6種藥物的聯合藥敏，每種抗生素的藥物濃度測試范圍是細菌對應MIC分別上推2～3個梯度和下推4～5個梯度[12]。部分抑菌濃度指數（FICI）作為聯合藥敏試驗結果的判斷依據：FICI=MICA聯/MICA單+MICB聯/MICB單。FICI≤0.5為協同作用，0.5lt;FICI≤1為相加作用，1lt;FICI≤2為無關作用，FICIgt;2為拮抗作用[15]。

2.4 時間殺菌實驗

設置對照組、1×MIC IMP組、1×MIC FOS組、1×MIC IMP+1×MIC FOS組，將過夜搖菌的菌液濃度調至2×105 CFU/mL，分別加入對應的抗生素，使終濃度分別為對應菌株的1×MIC IMP、1×MIC FOS、1×MIC IMP+1×MIC FOS。在0、4、8、12和24 h時取100 μL菌液稀釋不同倍數后涂板計數[16]。實驗重復3次。判讀標準：協同效應：在24 h時聯合用藥比單藥中最有效的藥物使菌量減少≥2 log10CFU/mL；拮抗效應：在24 h內聯合用藥比單藥中最有效的藥物使菌量增加≥2 log10CFU/mL；無關效應：在24 h時聯合用藥比單藥中最有效的藥物使菌量減少lt;2 log10CFU/mL；殺菌效應：在24 h時菌量比初始接種量減少gt;3 log10CFU/mL[17]。

2.5 生長曲線

設置對照組、1×MIC IMP組、1×MIC FOS組、1×MIC IMP+1×MIC FOS組。用LB（Luria-bertani broth）液體培養基稀釋好抗生素后，分別加入96孔板，設置3個復孔，每孔100 μL。最后加入10 μL的A600=0.3的菌液。放入全自動微生物生長曲線檢測儀，測定600 nm波長時每個孔的A值，以對照組調零并繪制細菌生長曲線。實驗重復3次。

2.6 抗菌藥物對的生物膜的影響

設置對照組、1×MIC IMP組、1×MIC FOS組、1×MIC IMP+1×MIC FOS組。用腦心浸液肉湯（brain heart infusion，BHI）稀釋好抗生素后，分別加入96孔板，設置3個復孔，每孔100 μL。最后加入10 μL的A600=0.3的菌液，37 ℃孵育48 h。孵育結束后用PBS洗3次，再用甲醛固定30 min，結晶紫染色20 min，流水緩慢沖洗后靜置96孔板至其干燥，最后用95%乙醇溶解，測定每個孔595 nm波長時的A值，以對照組調零。實驗重復3次。

2.7 熒光定量PCR

設置對照組、1×MIC IMP組、1×MIC IMP+1×MIC FOS組。按照諾唯贊細菌RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒說明書分別提取細菌總RNA和進行RNA的逆轉錄，再采用相對定量的方法，以16sRNA為內參基因，按照2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix操作步驟進行熒光定量PCR。本研究選取碳青霉烯酶基因blaNDM、磷霉素修飾酶基因fosA、細菌細胞壁合成相關基因murA和生物膜形成與Ⅲ型菌毛合成重要基因mrkA[18]進行熒光定量PCR實驗，檢測基因表達量的變化。根據Ct值計算相對表達量，目的基因相對表達量=2-ΔΔCt。引物序列見表1。

2.8 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.3.0對數據進行統計學分析及圖表繪制，多組間采用方差分析，之后采用Tukey's multiple comparisons test進行兩兩比較，以Plt;0.05表明差異有統計學意義。

3 結果

3.1 blaNDM耐藥基因的檢測與MIC測定

2021—2022年蘇州大學附屬第二醫院臨床分離的非重復的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）和E. coli共271株，通過PCR篩選出24株攜blaNDM的KP（12/24）和E. coli（12/24），見圖1。

通過微量肉湯稀釋法檢測菌株對不同抗生素的MIC。24株菌對CAZ和IMP的耐藥率為100%，對CIP和GEN的耐藥率分別為79.1%和70.8%，對COL和TGC高度敏感，敏感率分別為100%和87.5%，見表2。

3.2 磷霉素與亞胺培南等抗生素的聯合藥敏

棋盤試驗結果表明，FOS與IMP聯合對24株CRE體外抑菌效果最顯著，17株表現為協同作用，協同率為70.8%，3株表現為相加作用；其次為CAZ，9株表現為協同作用，協同率為37.5%，10株為相加作用。FOS與GEN、COL和CIP的協同率分別為25%、20.8%和16.7%。協同作用最差的是FOS與TGC聯合，僅有1株表現為協同作用。綜上，FOS與IMP的協同率遠高于FOS與其他抗生素，表明FOS與IMP聯合后可以提高對攜帶blaNDM腸桿菌目細菌的抑制作用，見表3～4和圖2。

3.3 磷霉素與亞胺培南聯合時間殺菌曲線

基于棋盤法實驗結果，選取4株協同作用的菌株（9363、10754、11101和11109）和1株相加作用的菌株（8856）進行體外時間殺菌曲線實驗。FOS聯合IMP對菌株8856的殺菌曲線顯示，1×MIC FOS+1×MIC IMP組在24 h內細菌菌落數相比FOS和IMP單藥應用時減少lt;2 log10CFU/mL，兩藥聯合表現為無關效應。FOS聯合IMP對菌株9363、10754、11101和11109的殺菌曲線顯示，聯合組在4 h后的細菌菌落數較單獨用藥組降低gt;3 log10CFU/mL，差異有統計學意義（Plt;0.05），說明兩藥聯合具有殺菌效應，見圖3。

3.4 磷霉素與亞胺培南聯合生長曲線

由圖4可見，對照組中細菌快速生長2 h進入對數生長期。FOS組與對照組菌株8856生長情況一致，IMP組生長被輕微抑制，而聯合組細菌生長被抑制得更為明顯； 菌株9363中， IMP組與對照組生長情況基本一致，但是FOS組細菌生長被抑制，聯合組細菌生長抑制現象更為顯著；菌株10754和11101的生長曲線顯示，IMP組細菌生長被輕微抑制， FOS組與聯合組細菌生長被顯著抑制，尤其是聯合組，細菌分別在4 h處才進入對數生長期； IMP組與FOS組菌株11109生長被輕微抑制，聯合組細菌生長被明顯抑制。結果表明FOS聯合IMP顯著抑制細菌生長，有統計學意義（Plt;0.05），見圖4。

3.5 磷霉素與亞胺培南聯合對生物膜形成的影響

與對照組相比，單藥組生物膜形成能力增強或不變，聯合組僅菌株9363在1×MIC FOS+1×MIC IMP處理下生物膜形成能力減弱（Plt;0.05）。與單藥組相比，菌株8856、9363和10754的聯合組細菌生物膜形成能力均減弱（Plt;0.05）。而菌株11101和11109的聯合組分別與單藥組間生物膜形成能力有差別，但均不具有統計學意義（Pgt;0.05）。表明FOS或IMP單藥使用會促進細菌生物膜形成，而兩者聯合對CRE生物膜形成具有抑制作用，見圖5。

3.6 熒光定量PCR

基于時間殺菌試驗和生物膜形成實驗的結果，選取8856、9363和11109菌株進行熒光定量PCR檢測。與對照組相比，在IMP和IMP+FOS條件下，菌株8856中blaNDM和fosA mRNA水平均明顯上調，而mrkA mRNA水平下調，且IMP+FOS處理后下調更為顯著。與對照組相比，菌株9363中blaNDM和mrkA mRNA水平在IMP作用下明顯增加，但IMP+FOS聯合處理后blaNDM mRNA水平無明顯變化，而mrkA mRNA水平明顯下降；在IMP作用下fosA mRNA水平不變，但IMP+FOS聯合處理下顯著增加。與對照組相比，在IMP和IMP+FOS條件下，菌株11109中blaNDM mRNA水平均明顯上調，但fosA mRNA水平無顯著差異；在IMP條件下mrkA和murA mRNA水平與對照組一致，IMP+FOS聯合處理后mrkA mRNA水平顯著下調，而murA mRNA水平顯著上調。表明FOS與IMP聯合后發揮協同作用與mrkA和murA基因轉錄水平變化有關，見圖6。

4 討論

根據2022年中國細菌耐藥監測網的數據，E. coli和KP是臨床分離菌種中分離率最高的兩種細菌，分別為18.69%和13.99%。有研究表明產NDM腸桿菌目細菌通常攜帶其他耐藥基因，使細菌具有多重耐藥性[19]。多重耐藥細菌的出現和迅速傳播已成為一個重大的公共衛生問題，而且可供選擇的新型抗菌藥物較少[20]，迫切需要尋找新的治療方案。磷霉素通過與丙酮酸-二磷酸尿嘧啶乙酰葡糖胺轉移酶（UDP-N-acetylglucosamine-3- enolpyruvyltransferase，MurA）結合，干擾細菌細胞壁形成來發揮作用，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有較好的抗菌活性[6，21]。此外，也有研究表明磷霉素可以通過抑制生物膜形成來發揮抗菌作用[21-22]。有研究評估了FOS對多重耐藥腸桿菌的抗菌活性及治療其臨床感染有效性，發現FOS是少有的對多重耐藥腸桿菌還保持著較高敏感性的抗生素，是多重耐藥菌的替代療法之一[23]。此外，考慮到FOS治療的有效性與低成本，是臨床治療用藥時的一種較好的選擇。盡管如此，為了避免FOS的濫用及其大量應用后耐藥性的發展，需尋找一種新的合理的用藥方案。有研究表明，FOS由于其獨特的作用機制，與其他抗生素聯合具有廣泛的協同作用[24]。

blaNDM是我國第二常見的碳青霉烯酶基因，僅次于blaKPC [25]。本研究對篩選出的24株攜帶blaNDM的腸桿菌聯合用藥，發現在FOS與多種抗生素的組合中，FOS與IMP的協同作用最佳，聯合MIC比單藥MIC顯著降低，這與另兩項研究結果一致，FOS聯合IMP對多重耐藥鮑曼不動桿菌和KP都展現出較好的協同作用[26-27]，表明FOS聯合IMP有較廣的抗菌譜；此外，FOS聯合不同的碳青霉烯類抗生素對治療患者感染均有較好的臨床效果[28-29]，提示FOS聯合IMP在臨床上治療細菌感染有廣泛的應用前景。本文進一步通過時間殺菌實驗和生長曲線評估了FOS與IMP聯合的協同作用，在時間殺菌實驗中，盡管實驗菌株在FOS與IMP聯合作用下表現出不同的效應，但是在生長曲線實驗中菌株生長都受到了不同程度的抑制，這與另一研究結果類似[30]，表明聯合用藥可以抑制細菌的生長。生物膜是E. coli和KP中一種重要的自我保護機制，同時也是一種耐藥機制[31]，抗生素能夠通過破壞生物膜的形成來達到抑菌甚至殺菌的作用。在我們的研究中， FOS聯合IMP可以有效抑制生物膜的形成，從而發揮協同作用，以此來增強抗菌效果，這與王亞萍等[27]的研究報道一致。值得注意的是，本次實驗中，有菌株在FOS與IMP聯合處理下表現為協同作用，但其生物膜形成能力并未受到抑制，這一結果與另一項研究類似[32]，盡管棋盤試驗中表現為協同作用，但仍然存在生物膜形成不受抑制的情況，這可能是由于FOS與IMP聯合可以通過其他的途徑發揮作用。

耐藥基因表達量的變化、細胞通透性的改變等都是潛在的聯合藥物發揮協同作用的機制[33] 。因此，本研究結合了時間殺菌實驗和生物膜實驗的結果挑選了8856、9363和11109這3株菌，進行了細菌相關耐藥、生物膜合成以及細胞壁合成重要基因的mRNA水平測定，尋找其他FOS與IMP聯用發揮協同作用的機制。Omer等[34]證明FOS與IMP聯合用藥可以通過影響Ⅲ型菌毛形成，降低細菌黏附能力或減少生物膜形成來發揮作用。本研究中， FOS與IMP聯合用藥作用下，mrkA mRNA表達量顯著下降，而murA mRNA表達量增高，提示在藥物聯合作用下，MurA酶表達量增加，為FOS提供更多的作用靶點，FOS與MurA酶結合后影響細菌細胞壁的形成。

綜上所述，FOS與IMP聯用時，可以通過降低細菌生物膜形成能力、影響細菌Ⅲ型菌毛形成和細胞壁形成等方面來發揮抗菌作用。本研究為FOS聯合IMP臨床治療產NDM腸桿菌提供更多的用藥選擇。但目前兩藥的協同作用仍有待體內實驗來進一步驗證。

參 考 文 獻

Tacconelli E， Carrara E， Savoldi A， et al. Discovery， research， and development of new antibiotics： The WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis[J]. Lancet Infect Dis， 2018， 18（3）： 318-327.

Lee Y L， Chen H M， Hii I M， et al. Carbapenemase-producing Enterobacterales infections： Recent advances in diagnosis and treatment[J]. Int J Antimicrob Agents， 2022， 59（2）： 106528.

Huang D， Yu B， Diep J K， et al. In vitro assessment of combined polymyxin B and minocycline therapy against Klebsiella pneumoniae carbapenemase（KPC）-producing K. pneumoniae[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2017， 61（7）： e00073-17.

Diep J K， Jacobs D M， Sharma R， et al. Polymyxin B in combination with rifampin and meropenem against polymyxin B-resistant KPC-producing Klebsiella pneumoniae[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2017，61（2）： e02121-16.

Lv L， Wan M， Wang C， et al. Emergence of a plasmid-encoded resistance-nodulation-division efflux pump conferring resistance to multiple drugs， including tigecycline， in Klebsiella pneumoniae[J]. mBio， 2020， 11（2）：" e02930-19.

Falagas M E， Vouloumanou E K， Samonis G， et al. Fosfomycin[J]. Clin Microbiol Rev， 2016， 29（2）： 321-347.

Antonello R M， Principe L， Maraolo A E， et al. Fosfomycin as partner drug for systemic infection management. A systematic review of its synergistic properties from in vitro and in vivo studies[J]. Antibiotics （Basel）， 2020， 9（8）： 8.

Coates A R M， Hu Y， Holt J， et al. Antibiotic combination therapy against resistant bacterial infections： Synergy， rejuvenation and resistance reduction[J]. Expert Rev Anti Infect Ther， 2020， 18（1）： 5-15.

Igo M， Xu L， Krishna A， et al. A metagenomic analysis for combination therapy of multiple classes of antibiotics on the prevention of the spread of antibiotic-resistant genes[J]. Gut Microbes， 2023， 15（2）： 2271150.

Tsegka K G， Voulgaris G L， Kyriakidou M， et al. Intravenous fosfomycin for the treatment of patients with bone and joint infections： A review[J]. Expert Rev Anti Infect Ther， 2022， 20（1）： 33-43.

Ribeiro A C D S， Chikhani Y C D S A， Valiatti T B， et al. In vitro and in vivo synergism of fosfomycin in combination with meropenem or polymyxin B against KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae clinical isolates[J]. Antibiotics （Basel）， 2023， 12（2）： 237.

Xu X， Xu L， Yuan G， et al. Synergistic combination of two antimicrobial agents closing each other's mutant selection windows to prevent antimicrobial resistance[J]. Sci Rep， 2018， 8（1）： 7237-7243.

Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. 2022， M100-Ed33.

The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters[S]. Version 14.0， 2024.

王保貴， 王娜娜， 周思緒， 等. 多西環素聯合利福平對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌體內外抗菌活性[J]. 中國抗生素雜志， 2023， 48（10）： 1183-1191.

方會慧， 許元寶， 張菁， 等. 抗菌藥物聯合用藥體外研究方法的現狀及進展[J]. 中國感染與化療雜志， 2023， 23（1）： 101-106.

Vidaillac C， Benichou L， Duval R E. In vitro synergy of colistin combinations against colistin-resistant Acinetobacter baumannii， Pseudomonas aeruginosa， and Klebsiella pneumoniae isolates[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2012， 56（9）： 4856-4861.

Paczosa M K， Mecsas J. Klebsiella pneumoniae： Going on the offense with a strong defense[J]. Microbiol Mol Biol Rev， 2016， 80（3）： 629-661.

Dong H， Li Y， Cheng J， et al. Genomic epidemiology insights on NDM-producing pathogens revealed the pivotal role of plasmids on blaNDM transmission[J]. Microbiol Spectr， 2022， 10（2）： e0215621.

Ontong J C， Ozioma N F， Voravuthikunchai S P， et al. Synergistic antibacterial effects of colistin in combination with aminoglycoside， carbapenems， cephalosporins， fluoroquinolones， tetracyclines， fosfomycin， and piperacillin on multidrug resistant Klebsiella pneumoniae isolates[J]. PLoS One， 2021， 16（1）： e0244673.

Kwan A C F， Beahm N P. Fosfomycin for bacterial prostatitis： A review[J]. Int J Antimicrob Agents， 2020， 56（4）： 106106.

Corvec S， Furustrand Tafin U， Betrisey B， et al. Activities of fosfomycin， tigecycline， colistin， and gentamicin against extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli in a foreign-body infection model[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2013， 57（3）： 1421-1427.

向婷， 陳卓. 磷霉素的臨床應用新進展[J]. 華西藥學雜志，" 2021， 36（4）： 485-488.

Tsegka K G， Voulgaris G L， Kyriakidou M， et al. Intravenous fosfomycin for the treatment of patients with bone and joint infections： A review[J]. Expert Rev Anti Infect Ther， 2022， 20（1）： 33-43.

Hu F， Pan Y， Li H， et al. Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae capsular types， antibiotic resistance and virulence factors in China： A longitudinal， multi-centre study[J]. Nat Microbiol， 2024， 9（3）： 814-829.

胡仁靜， 戴越， 沈蘭鳳. 磷霉素和亞胺培南對肺炎克雷伯菌體內協同作用的評價[J]. 中國新藥雜志，" 2021， 30（23）： 2203-2209.

王亞萍， 郭普， 汪華學. 亞胺培南聯合磷霉素對多重耐藥鮑曼不動桿菌的試驗研究[J]. 中國感染控制雜志， 2023， 22（1）： 74-79.

Perdig?o Neto L V， Oliveira M S， Martins R C R， et al. Fosfomycin in severe infections due to genetically distinct pan-drug-resistant Gram-negative microorganisms： synergy with meropenem[J]. J Antimicrob Chemother， 2019， 74（1）： 177-181.

Khawcharoenporn T， Chuncharunee A， Maluangnon C， et al. Active monotherapy and combination therapy for extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa pneumonia[J]. Int J Antimicrob Agents， 2018， 52（6）： 828-834.

茍玉虹. 肉桂醛聯合頭孢曲松治療耐藥性沙門氏菌感染的藥效學研究[D]. 成都： 四川農業大學， 2022.

Wang G， Zhao G， Chao X， et al. The characteristic of virulence， biofilm and antibiotic resistance of Klebsiella pneumoniae[J]. Int J Environ Res Public Health， 2022， 17（17）： 627.

Boncompagni S R， Micieli M， Di Maggio T， et al. Activity of fosfomycin/colistin combinations against planktonic and biofilm Gram-negative pathogens[J]. J Antimicrob Chemother， 2022， 77（8）： 2199-2208.

董春柳. 截短側耳素類藥物與四環素聯用對金黃色葡萄球菌抑菌機制研究[D]. 廣州： 華南農業大學， 2018.

Omer F H， Al-Khafaji N S K， Al-Alaq F T， et al. Synergistic effects of silybin and curcumin on virulence and carbapenemase genes expression in multidrug resistant Klebsiella oxytoca[J]. BMC Res Notes， 2022， 15（1）： 330.