溫陽解郁顆粒對皮質酮損傷型小鼠海馬神經元HT22細胞的保護作用

［摘要］ 目的： 通過體外構建小鼠海馬神經元HT22細胞皮質酮損傷模型，探究溫陽解郁顆粒對海馬神經元細胞的保護作用。方法： 將HT22細胞分為正常組、模型組、溫陽解郁組和氟西汀組，除正常組外，其余各組細胞均經皮質酮處理，溫陽解郁組、氟西汀組給予相應的含藥血清作用24 h，模型組用10%的空白血清培養24 h。CCK-8法檢測細胞存活率，倒置顯微鏡觀察細胞形態，酶聯免疫法檢測LDH活性，Hoechst染色法觀察細胞存活數，免疫熒光法檢測Brdu、Neun熒光表達并觀察HT22細胞的再生情況，流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果： 與正常組相比，模型組HT22細胞受損嚴重、細胞數量減少、存活率顯著降低（ P lt;0.01），LDH含量顯著升高（ P lt;0.01），Brdu/Neun雙染熒光強度顯著降低（ P lt;0.01），細胞凋亡率顯著升高（ P lt;0.01）；與模型組相比，溫陽解郁顆粒含藥血清作用于皮質酮損傷HT22細胞后，HT22細胞存活率升高（ P lt;0.05），LDH含量降低（ P lt;0.05），細胞凋亡率降低（ P lt;0.01），Brdu/Neun熒光強度增強（ P lt;0.05）、陽性細胞數顯著增加（ P lt;0.01）。結論： 溫陽解郁顆粒可能通過修復受損海馬神經元細胞，調控神經可塑性，抑制海馬神經元細胞凋亡，同時分化生成新的神經元細胞，進而發揮抗抑郁的作用。

［關鍵詞］ 溫陽解郁顆粒；抗抑郁；皮質酮；免疫熒光法；細胞凋亡

［中圖分類號］ R285.5" ［文獻標志碼］ A" ［文章編號］ 1671-7783（2025）01-0046-06

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230255

［引用格式］孟霜， 史敏， 馮振宇， 等. 溫陽解郁顆粒對皮質酮損傷型小鼠海馬神經元HT22細胞的保護作用［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2025， 35（1）： 46-51.

［基金項目］山西省基礎研究計劃青年科學研究項目（20210302124565）；山西中醫藥大學科技創新能力培育計劃“太行本草”專項（2022PY-TH-14）；山西省中醫藥管理局科研課題（2023ZYYA020）

［作者簡介］孟霜（1985—），女，主管藥師，碩士，主要從事中藥藥效物質基礎研究；趙杰（通訊作者），主任醫師，教授，E-mail： zhaojiemyt@163.com

Protective effect of Wenyang Jieyu granule on HT22 cells of the hippocampal neurons in mice damaged by corticosterone

MENG Shuang¹ ， SHI Min² ， FENG Zhenyu¹ ， MA Xiaojuan¹ ， ZHAO Jie¹

（1. Chinese Medicine Preparation Research and Development Laboratory， Shanxi Integrated Chinese and Western Medicine Hospital， Taiyuan Shanxi 030013; 2. Beijing Leadingpharm Medical Technology Company， Beijing 100089， China）

［Abstract］ Objective： To explore the antidepressant effect and underlying mechanism of Wenyang Jieyu granule （WYJY） by constructing a corticosterone （CORT） injury-induced depression model in mouse hippocampal neurons （HT22） "in vitro . Methods： HT22 cells were divided into normal group， model group， WYJY group，and fluoxetine group. Except for the normal group， HT22 cells in the other groups were treated with CORT. WYJY group and fluoxetine group were treated with corresponding drug-containing serum for 24 hours. The HT22 cells in model group added 10% blank serum for 24 hours. CCK-8 method was used to detect cell survival rate. Cell morphology was observed under a microscope. Enzyme linked immunosorbent assay was used to detect LDH release. Hoechst staining was used to observe the survival number of cells. Immunofluorescence assay was used to detect the fluorescence expression of Brdu and Neun and observe the regeneration of HT22 cells. Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of cells. Results： Compared with the normal group， HT22 cells in the model group were severely damaged， the number of cells decreased， and the survival rate was significantly decreased （ P lt;0.01），LDH release was significantly increased （ P lt;0.01），the fluorescence intensity of Brdu/Neun double staining decreased significantly （ P lt;0.01）， and the apoptosis rate increased significantly （ P lt;0.01）. Compared with the model group， the survival rate of HT22 cells was increased after the effect of serum containing WYJY on CORT injury （ P lt;0.05），the LDH release and apoptosis rate were decreased （ P lt;0.05， "P lt;0.01），the fluorescence intensity of Brdu/Neun and the number of positive cells were significantly increased （ P lt;0.05， "P lt;0.01）. Conclusion： WYJY may play an antidepressant role by repairing damaged hippocampal neuron cells， regulating nerve plasticity， inhibiting apoptosis of hippocampal neuron cells and differentiating into new neurons.

［Key words］ Wenyang "Jieyu granule; antidepressant; corticosterone; immunofluorescence; apoptosis

抑郁癥是一種常見的大腦功能紊亂性疾病，臨床多表現為患者自主活動興趣持續性低落，并伴隨有思維緩慢、神情呆滯等癥狀^［1］ 。近年來，抑郁癥發病率逐年攀升，至2020年全球抑郁癥患者已突破3.5億且愈加呈現年輕化趨勢^［2］ 。目前抑郁癥臨床治療藥物多為單胺類化學藥物，不僅不良反應大、服用周期長，而且還有明顯的抗藥性，有效治愈率普遍較低。因此，研發有效的抗抑郁中藥制劑是亟待解決的問題。

本課題組前期實驗研究發現溫陽解郁顆粒能顯著改善慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mildstress，CUMS）模型大鼠的抑郁樣行為，降低高糖皮質激素水平對大腦海馬組織的損傷，明顯提高大鼠海馬區腦源性神經營養因子、環磷腺苷效應元件結合蛋白mRNA的表達量^［3-4］ ，但溫陽解郁顆粒如何抑制海馬組織形態改變的相關機制還需深入探究。

下丘腦垂體腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）軸是參與認知、學習、記憶等高級生理活動的主要神經內分泌系統，抑郁癥發病與HPA軸功能異常亢進有密切關系，糖皮質激素水平持續升高直接影響HPA軸調節功能。已有研究表明CUMS模型大鼠、小鼠的HPA軸功能亢進，糖皮質激素含量明顯提高，持續高水平的糖皮質激素可在較短時間內抑制神經元存活，誘導其凋亡^［5-8］ 。本實驗以小鼠海馬神經元HT22細胞為研究對象，采用高濃度皮質酮刺激HT22細胞，模擬抑郁患者受到外界環境刺激或自身心理應激時，機體糖皮質激素持續升高導致海馬神經元可塑性調節失衡，通過分析細胞形態、存活率、乳酸脫氫酶（LDH）含量、細胞凋亡率、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）/神經元核抗原（Neun）免疫熒光染色等不同指標，探討溫陽解郁顆粒對皮質酮損傷型HT22細胞的保護作用，為該制劑的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與動物

小鼠海馬神經元HT22細胞（上海康朗生物科技有限公司20190811）；SPF級ICR雄性小鼠30只，18～22 g，購于北京維通利華有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0005。

1.2 實驗藥物與試劑

溫陽解郁顆粒來源于山西省中西醫結合醫院藥劑科。皮質酮粉末（250 mg）、氟西汀（上海畢得醫藥科技有限公司），CCK-8試劑盒（美國Boster公司），DMEM培養基（美國Gibco公司），Brdu粉劑、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、0.25% EDTA胰蛋白酶消化液及Hoechst33258染料（北京索萊寶科技有限公司），LDH試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 主要儀器與設備

Varioskan^TM "LUX多功能酶標儀（美國Thermo公司），FACS CantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司），Galaxy 170S CO2 恒溫細胞培養箱（德國Eppendorf公司），ImageXpress Micro 4共聚焦高內涵成像系統（美國Molecular Devices公司），DFAC 450C倒置顯微鏡（德 國Leica公司），BBS-V800型超凈工作臺（山東博科生物產業有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 含藥血清的制備 將30只小鼠分為空白組、溫陽解郁組（2.374 g/mL）和氟西汀組（0.126 mg/mL），每組10只，適應性喂養1周后，除空白組外，其余兩組分別灌胃給予相應的藥物（15 mL/kg），空白組灌胃等體積蒸餾水，連續給藥1周。末次給藥1 h后，小鼠眼球取血，3 500 r/min離心15 min，取上層血清于無菌EP管中，56 ℃水浴鍋滅活30 min，經75%乙醇消毒后移入超凈工作臺，0.22 μm微孔濾膜分別過濾除菌后分裝，-80 ℃保存，備用。

1.4.2 細胞分組、造模和給藥 將HT22細胞分為正常組、模型組、溫陽解郁組和氟西汀組，每組設置5個 復孔。正常組加入新鮮培養基，常規培養，不給予任何藥物處理；模型組用含459.5 μmol/L皮質酮的培養液培養24 h，加入含10%空白血清培養液作用24 h；皮質酮造模完成后，溫陽解郁組加入含10%溫陽解郁顆粒含藥血清干預24 h，氟西汀組加入含5%氟西汀含藥血清干預24 h。

1.4.3 CCK-8法檢測細胞存活率 給藥干預24 h后，所有孔棄去舊培養基，每孔加10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育30 min，酶標儀450 nm處檢測各組細胞存活率，在倒置顯微鏡下觀察各組HT22細胞形態變化。

1.4.4 酶聯免疫法檢測LDH活性 將HT22細胞以5×10⁴ /mL的密度接種于6孔板中，每孔1.5 mL，以10%胎牛血清培養液培養24 h，待細胞完全貼壁后，各組HT22細胞分別按照不同分組情況進行加藥處理，實驗完成后收集各組細胞上清液，3 500 r/min離 心5 min，進行LDH活性比色檢測。每組設置3個復孔，依序加樣、混勻，室溫放置5 min ，酶標儀450 nm處測定其光密度，計算細胞中LDH的釋放量。

1.4.5 免疫熒光法檢測Brdu、Neun熒光表達 各組細胞完成給藥處理后，吸棄舊培養基，每組避光加入10 μmol/L Brdu培養液，置于培養箱內孵育40 min ，棄掉舊培養液，PBS沖洗3次。4%多聚甲醛溶液固定30 min后滴加破膜液處理10 min，PBS沖洗3次。繼續滴加4%多聚甲醛處理10 min，1 mol/L "HCL 37 ℃避光處理30 min，PBS沖洗，加3%牛血清白蛋白封閉液處理1 h后，滴加Brdu抗體稀釋液，4 ℃避光孵育過夜。第2天加PBS沖洗3次 ，分別滴加熒光二抗混合液，室溫避光孵育1 h，棄掉二抗，加Hoechst染液染核5 min，PBS沖洗3次 ，即刻顯微鏡下觀察。利用ImageXpress Micro高內涵成像系統隨機采集各組圖像，記錄各組Hoechst染核、Brdu陽性細胞數以及與Neun共染細胞數，根據核內熒光強度與胞漿熒光強度的比值計算Brdu占Neun陽性細胞數的比例，評價各含藥血清對海馬神經元細胞分裂、分化的影響。

1.4.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞完成給藥處理后，預冷PBS沖洗2～3次，用不含EDTA的胰酶消化，收集各組細胞并計數（每組細胞數應≥ 1×10⁶ /mL），12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1 mL 1×結合緩沖液，離心并重懸細胞。室溫下分別避光加入Annexin V-FITC、PI染色液，避光孵育10 min，加PBS至500 μL，輕輕混勻，1 h內上機檢測。實驗設空白管、Annexin V-FITC管、PI單染管，重復3次，計算比較各組HT22細胞給藥后細胞凋亡情況，并利用軟件WinMDI 3.1處理分析數據與圖像。

1.5 統計學分析

應用SPSS 22.0軟件進行統計分析，結合GraphPad Prism 8.0軟件進行圖表繪制，所有符合正態分布計量資料以均數±標準差（ x±s ）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD- t 檢驗， P lt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 溫陽解郁顆粒對皮質酮損傷型HT22細胞活力的影響

與正常組比較，模型組細胞觸角大多數消失變圓，細胞數量顯著減少，存活率顯著降低（ t =10.10， P lt;0.01）；與模型組比較，溫陽解郁組、氟西汀組細胞數目明顯增多，細胞存活率均明顯升高（ t =4.74， t = 5.22， P 均lt;0.05）。見圖1、圖2。

2.2 溫陽解郁顆粒對皮質酮損傷型HT22細胞LDH含量的影響

與正常組比較，模型組LDH含量顯著升高（ t =52.14， P lt;0.01）；與模型組比較，溫陽解郁組、氟西汀組LDH含量明顯降低（ t =39.69， t =33.45， P 均lt;0.05），見圖3。

2.3 溫陽解郁顆粒對皮質酮損傷型HT22細胞存活數量的影響

HT22細胞Hoechst染核結果顯示，正常組細胞核被Hoechst均勻藍染，形狀規則且完整；與正常組比較，模型組活細胞數量顯著減少，細胞核呈碎塊狀或半月形凝聚，大部分細胞甚至脫落消失；與模型組比較，溫陽解郁組和氟西汀組細胞核形態近乎完整，活細胞數量均有一定程度增加。見圖4。

2.4 溫陽解郁顆粒對皮質酮損傷型HT22細胞Brdu、Neun表達的影響

熒光染色結果顯示，正常組Brdu單染時陽性細胞單個散落或簇網狀分布，呈圓形或梭形且熒光表達弱，Neun單染熒光表達強且細胞呈網狀觸角型，幾乎80%的細胞為成熟神經元，分化完全。與正常組比較，模型組Brdu陽性細胞數明顯下降（ t =8.00， P lt;0.01），Neun單染結果顯示細胞形態觸角回縮、觸角數量明顯減少，Brdu/Neun雙染熒光強度顯著降低（ t =6.54， P lt;0.01）；與模型組比較，溫陽解郁組和氟西汀組的Brdu陽性細胞數均顯著增加（ t = 31.02， t =26.94， P 均lt;0.01），Brdu/Neun雙染熒光強度均增強（ t =3.03， t =3.60， P 均lt;0.05）。見圖5～ 圖7。

2.5 溫陽解郁顆粒對皮質酮損傷型HT22細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC、PI染色結果見圖8A，其中Q3象限為正常細胞，早期凋亡的細胞分布在Q4象限，壞死細胞和晚期凋亡的細胞集中在Q1、Q2象限。與正常組比較，模型組的細胞凋亡率顯著升高（ t =39.56， P lt;0.01）；與模型組相比，溫陽解郁組和氟西汀組細胞凋亡率均顯著下降（ t =10.64， t =15.17， P 均lt;0.01），見圖8B。

3 討論

HPA軸是神經內分泌系統的重要部分，參與調控維持機體內環境平衡。HPA軸的調節主要依賴糖皮質激素。當外界環境有持續性應激刺激時，HPA軸功能發生亢進性反饋調節，過度激活糖皮質激素受體表達，引起機體系統調節紊亂，從而誘發抑郁癥^［9］ 。海馬是HPA軸最關鍵的上游腦區，也是糖皮質激素受體高表達區，更易受到糖皮質激素的影響。嚙齒類動物體內主要的糖皮質激素是皮質酮^［2］ 。高水平糖皮質激素越過大腦屏障，過度結合腦海馬區的皮質酮受體，造成神經系統可塑性失調，具體表現為神經元衰竭、神經膠質細胞損傷、海馬神經元體積萎縮、神經突觸減少等，因此海馬神經元可塑性失衡可能是抑郁癥發病的關鍵機制之一^［10］ 。HT22細胞是一種小鼠海馬的永生化神經元細胞系，在神經系統疾病（如抑郁癥、阿爾茨海默病等）相關研究中常被應用為體外細胞模型^［9，11］ 。本研究利用高濃度皮質酮溶液刺激HT22細胞模擬構建體外抑郁模型，評價溫陽解郁顆粒對HT22皮質酮損傷型神經元細胞的保護作用。

細胞存活率是評價細胞模型、細胞狀態最直觀的指標，本研究結果表明，模型組中HT22細胞數量顯著減少，而經溫陽解郁顆粒干預后，可以明顯抑制皮質酮對神經元細胞的損傷，增加神經元細胞的數量。細胞凋亡是評價細胞模型構建成功的關鍵因素，它可以影響細胞存活率，間接評價溫陽解郁顆粒的藥物效應。LDH廣泛存在于神經元細胞中，反映細胞凋亡和壞死引起的細胞損傷情況。LDH的釋放與細胞膜完整性密切相關，且釋放量與細胞受損程度呈正相關^［12］ ，是細胞代謝的指標性成分^［13］ 。神經元細胞損傷會引起神經細胞膜功能異常，導致LDH溢出，釋放到細胞培養基中。本研究表明皮質酮能一定程度抑制HT22細胞的生長，降低其存活率，經溫陽解郁顆粒干預后，可以明顯增加神經元細胞數量，促進受損HT22細胞神經網狀觸角分化增多，明顯減少HT22細胞凋亡的發生，降低LDH釋放量，保護受損海馬神經元細胞，提高其存活率。

另外，Brdu、BrdU/NeuN是目前公認的與神經再生關系密切的實驗觀察指標。在細胞的復制期，Brdu滲入細胞DNA，隨細胞分化進入到下一代細胞，可反映細胞增殖及經歷DNA修復細胞的情況。Brdu/Neun可作為新生的成熟神經元的標志^［14-15］ 。本研究結果表明，溫陽解郁顆粒可明顯增加Brdu陽性細胞數，Brdu/Neun雙染熒光強度增強，說明溫陽解郁顆粒可一定程度上修復受損的海馬神經元細胞，增強神經元細胞的增殖和分化能力，并促進生成大量的神經元細胞。

綜上，溫陽解郁顆粒可調控修復受損的海馬神經元細胞，抑制神經元細胞凋亡，增強海馬神經元突觸可塑性，提高神經元細胞的存活率，保護神經元細胞，進而發揮抗抑郁作用。本研究為進一步明確溫陽解郁顆粒抗抑郁的作用機制提供研究方向，同時為溫陽法治療抑郁癥提供一定的參考。

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［收稿日期］ 2023-12-06" ［編輯］ 郭 欣