蘿卜硫素調節(jié)PI3K/AKT/VEGF信號通路對妊娠高血壓大鼠血管內皮功能的影響

摘要""目的：探討蘿卜硫素（SFN）對妊娠高血壓（PIH）大鼠血管內皮功能的影響及作用機制。方法：選取無特定病原體（SPF）級懷孕SD雌性大鼠30只，隨機分為對照組、PIH組、SFN低劑量組（15 mg/kg）、SFN高劑量組（30 mg/kg）和LY294002組（30 mg/kg SFN＋5 mg/kg LY294002）。構建PIH大鼠模型，測定大鼠收縮壓；二喹啉甲酸（BCA）法測定尿蛋白含量；酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、血管內皮生長因子（VEGF）、血管細胞黏附分子1（VCAM-1）、內皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測胎盤組織磷酸肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、VEGF蛋白表達水平。結果：與對照組相比，PIH組收縮壓、尿蛋白含量、TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、ET-1、VCAM-1水平明顯升高（P＜0.05），血清VEGF、NO、SOD、GSH及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、VEGF蛋白水平明顯下降（P＜0.05）；與PIH組相比，SFN低劑量組、高劑量組收縮壓、尿蛋白含量以及TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、ET-1、VCAM-1水平明顯降低（P＜0.05），血清VEGF、NO、SOD、GSH以及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、VEGF蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；PI3K抑制劑LY294002可減弱SFN對PIH大鼠血管內皮功能的保護作用。結論：SFN對PIH大鼠血管內皮功能有保護作用，可能與激活PI3K/AKT/VEGF信號通路有關。

關鍵詞""妊娠高血壓；蘿卜硫素；血管內皮功能；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.07.006

Effect of Sulforaphane Regulating PI3K/AKT/VEGF Signaling Pathway on Vascular Endothelial Function in Pregnancy-induced Hypertension Rats

LIU Zheng， LI Jing

The Second Affiliated Hospital of Xi′an Medical University， Xi′an 710000， Shaanxi， China

Corresponding Author "LI Jing， E-mail： kxewg16@163.com

Abstract Objective：To explore the effect of sulforaphane（SFN） on vascular endothelial function in pregnancy-induced hypertension（PIH） rats.Methods：Thirty pregnant SD rats free of specific pathogen（SPF） were randomly divided into control group，PIH group，SFN low-dose group（15 mg/kg），SFN high-dose group（30 mg/kg），and LY294002 group（30 mg/kg SFN＋5 mg/kg LY294002）.PIH rat model was established and systolic blood pressure was measured.Bicinchoninic acid（BCA） method was used to determine the urine protein content.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to measure serum tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-1β（IL-1β），interleukin-6（IL-6），malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD），glutathione（GSH），vascular endothelial growth factor（VEGF），vascular cell adhesion molecule 1（VCAM-1），endothelin-1（ET-1），and nitric oxide（NO）.Western Blot was used to detect protein expression levels of phosphoinositide 3-kinase（PI3K），phosphorylated PI3K（p-PI3K），protein kinase B（AKT），phosphorylated AKT（p-AKT），and vascular endothelial growth factor（VEGF） in placenta tissue.Results：Compared with the control group，the systolic pressure，urine protein content，levels of TNF-α，IL-1β，IL-6，MDA，ET-1，and VCAM-1 of the rats in the PIH group increased（P＜0.05），the protein levels of VEGF，NO，SOD，GSH，p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT，and VEGF decreased（P＜0.05）.Compared with the PIH group，the systolic pressure，urine protein content，levels of TNF-α，IL-1β，IL-6，MDA，ET-1，and VCAM-1 of rats in the SFN low and high dose groups decreased（P＜0.05），the protein levels of VEGF，NO，SOD，GSH，p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT，and VEGF increased（P＜0.05）.The PI3K inhibitor LY294002 attenuated the protective effect of SFN on vascular endothelial function in PIH rats.Conclusion：SFN shows a protective effect on vascular endothelial function in PIH rats，which may be related to the activation of PI3K/AKT/VEGF signaling pathway.

Keywords""pregnancy-induced hypertension; sulforaphane; vascular endothelial function; experimental research

妊娠期高血壓（PIH）是孕婦發(fā)病率和死亡率最高的原因之一，其臨床特點主要有高血壓、蛋白尿以及心腎功能衰竭等，如不及時控制病情，將嚴重影響孕婦及胎兒的生命安全和生活質量^［1］。PIH的病因和病理機制尚不明確，認為與遺傳、免疫失調、氧化應激、血管內皮細胞損傷、炎癥、和環(huán)境因素等有關。血管內皮功能障礙是PIH的主要標志之一，與PIH是雙向關系，內皮功能障礙導致并加速高血壓的進展，而高血壓也可導致血管內皮功能障礙^［2］。因此，了解血管內皮功能，確定PIH的潛在分子機制，對治療PIH具有重要意義。蘿卜硫素（SFN）是一種存在于十字花科蔬菜中的天然有機硫，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、免疫調節(jié)等作用，還可以保護內皮功能，對心血管疾病如慢性高血壓等有改善作用^［3］。研究發(fā)現，SFN具有改善內皮細胞功能障礙的作用^［4］，但其對PIH的作用尚不清楚。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路涉及許多病理和生理過程，在細胞能量代謝、細胞運動和細胞周期進程中起關鍵作用，血管內皮生長因子（VEGF）是一種促血管生成因子，可由PI3K/AKT信號通路介導^［5］。研究表明，PI3K/AKT通路在PIH中很常見，但SFN對PIH血管內皮功能的影響與PI3K/AKT/VEGF信號通路是否有關尚不清楚。因此，本研究通過構建PIH大鼠模型探討SFN對PIH大鼠血管內皮功能的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取30只雌性［體質量（240±20）g］無特定病原體（SPF）級SD大鼠，10周齡，購自蘇州斯貝福生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（蘇）2022-0006，適應性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±2）"℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環(huán)，不禁水、禁食。本研究獲得動物倫理委員會批準（倫理編號：DLP20222946）。

1.2 主要試劑與儀器

SFN（純度≥98%）購自北京Solarbio公司；一氧化氮合酶（NOS）抑制劑-亞硝基左旋精氨酸甲酯（L-NAME）購自上海愛必信生物公司；PI3K/AKT通路抑制劑LY294002購自美國Abcam公司；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購自上海碧云天公司；VEGF、血管細胞黏附分子1（VCAM-1）、內皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自上海酶聯生物公司；一抗PI3K、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）、VEGF和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體以及二抗辣根酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）購自美國賽默飛公司。無創(chuàng)血壓測量儀購自上海玉研科學儀器公司，電子顯微鏡購自日本Olympus公司；全自動酶標儀購自奧地利TECAN公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備、分組和給藥

將雌雄（2∶1）大鼠放在同一個籠子交配，次日觀察雌鼠陰道分泌物，有精子即為妊娠第1天。將30只妊娠大鼠隨機分為5組：對照組、PIH組、SFN低劑量組、SFN高劑量組和PI3K/AKT通路抑制劑LY294002組（LY294002組），每組6只。參照文獻［6］，從妊娠第11天至第18天，PIH組、SFN低劑量組、SFN高劑量組和LY294002組每天腹腔注射L-NAME（50 mg/kg），對照組注射相同劑量的生理鹽水，用血壓測量儀檢測大鼠尾動脈壓，若血壓＞110 mmHg即為造模成功。妊娠第11天至第18天，參照先前研究中SFN的劑量^［7］，SFN低劑量組、高劑量組分別給予SFN 15、30 mg/kg腹腔注射；LY294002組給予30 mg/kg SFN及5 mg/kg LY294002腹腔注射；對照組和PIH組腹腔注射相同劑量生理鹽水，每天1次，連續(xù)1周。

1.3.2 血壓測量

在妊娠第9天、第13天、第17天、第19天用血壓檢測儀檢測妊娠大鼠收縮壓（SBP）。

1.3.3 尿蛋白測量

妊娠第9天和第19天收集妊娠大鼠24 h尿液，采用BCA法檢測尿蛋白含量。

1.3.4 炎性因子和氧化應激指標檢測

妊娠第19天大鼠腹主動脈取血，離心取上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及氧化應激指標MDA、SOD、GSH水平變化。

1.3.5 血清血管細胞活性物質檢測

妊娠19天大鼠腹主動脈取血，離心取上清，按照試劑盒說明書檢測大鼠血清ET-1、VCAM-1、VEGF、NO水平。

1.3.6 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測

妊娠第19天，麻醉處死大鼠，剖取出胎盤組織，清洗后剪碎，用RIPA裂解提取總蛋白，BCA法確定蛋白濃度后電泳、轉膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，在4 ℃下加入一抗PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、AKT、p-AKT、VEGF和GADPH（1∶1 000）過夜孵育，清洗后在室溫下加入二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000），孵育2 h。用增強化學發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）發(fā)光顯影，觀察拍照，各條帶灰度值用Image J軟件處理分析。

1.4 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；重復測量數據采用重復測量方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組收縮壓比較

經重復測量方差分析，各組不同時間收縮壓水平比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，PIH組第13天、第17天、第19天收縮壓明顯上升（P＜0.05）；與PIH組相比，SFN低劑量組、高劑量組第17天、第19天收縮壓明顯下降（P＜0.05）；與SFN高劑量組相比，LY294002組第17天、第19天收縮壓明顯上升（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 各組尿蛋白含量比較

妊娠第19天，PIH組尿蛋白含量較對照組明顯上升（P＜0.05），SFN低劑量組、高劑量組尿蛋白含量較PIH組明顯下降（P＜0.05），LY294002組尿蛋白含量較SFN高劑量組明顯上升（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 各組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

與對照組相比，PIH組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯上升（P＜0.05）；與PIH組相比，SFN低劑量組、高劑量組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平下降（P＜0.05）；與SFN高劑量組相比，LY294002組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平上升（P＜0.05）。詳見表3。

2.4 各組血清MDA、SOD、GSH水平比較

與對照組相比，PIH組血清MDA水平明顯上升（P＜0.05），SOD、GSH水平明顯下降（P＜0.05）；與PIH組相比，SFN低劑量組、高劑量組血清MDA水平明顯下降（P＜0.05），SOD、GSH水平明顯上升（P＜0.05）；與SFN高劑量組相比，LY294002組血清MDA水平明顯上升（P＜0.05），SOD、GSH水平明顯下降（P＜0.05）。詳見表4。

2.5 各組血管細胞活性物質比較

與對照組相比，PIH組血清ET-1、VCAM-1水平明顯升高（P＜0.05），NO、VEGF水平明顯降低（P＜0.05）；與PIH組相比，SFN低劑量組、高劑量組血清ET-1、VCAM-1水平下降（P＜0.05），NO、VEGF水平升高（P＜0.05）；與SFN高劑量組相比，LY294002組血清ET-1、VCAM-1水平升高（P＜0.05），NO、VEGF水平降低（P＜0.05）。詳見表5。

2.6 各組胎盤組織中PI3K/AKT/VEGF通路蛋白比較

與對照組相比，PIH組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、VEGF蛋白水平明顯降低（P＜0.05）；與PIH組相比，SFN低劑量組、高劑量組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、VEGF蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；與SFN高劑量組相比，LY294002組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、VEGF蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。詳見表6及圖1。

3 討論

高血壓是妊娠期最常見的內科疾病，也是孕產婦和圍產期發(fā)病率和死亡率的主要原因，高平均動脈壓（MAP）和蛋白尿是其主要臨床表現^［1］。尿蛋白水平可反映腎小球的損傷程度，其水平升高也是加重腎臟損害的主要因素^［8］。目前可用于治療PIH的藥物存在一定的局限性或副作用，因此，尋找有效、安全的治療PIH的藥物具有重要意義。L-NAME作為NO合成抑制劑，抑制NO合成致使血壓升高，本研究使用L-NAME建立PIH大鼠模型與PIH的發(fā)病機制是內皮血管障礙的理論相符^［9］。本研究通過構建PIH大鼠模型，發(fā)現大鼠血壓升高、尿蛋白含量增加，表明模型構建成功。SFN在心血管疾病、癌癥、呼吸系統疾病、神經系統疾病、炎癥和氧化應激相關疾病中均發(fā)揮一定的作用，且Langston-Cox等^［10］研究發(fā)現，SFN可改善PIH婦女的內皮功能和血壓，但其具體作用機制不清楚。本研究結果顯示，SFN治療后PIH大鼠血壓降低、尿蛋白含量減少，驗證了SFN對PIH的治療作用。

血管內皮功能障礙是PIH的主要標志之一，當出現異常時，脈管系統易發(fā)生血管收縮、白細胞黏附、氧化應激和炎癥反應^［11］。炎癥反應是PIH的重要發(fā)病機制之一，當PIH大鼠血管發(fā)生炎癥反應時會產生大量炎癥細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6，導致血管內皮細胞損傷進而引起血管內皮功能障礙，因此，在PIH大鼠中檢測炎性因子的水平可反映血管內皮功能的變化情況^［12］。氧化應激也是PIH過程的重要病理因素，氧化應激標志物升高引起內皮功能障礙以及先兆子癇等妊娠并發(fā)癥，在高血壓病人體內產生大量自由基，引起脂質過氧化，導致抗氧化水平降低，引發(fā)血管內皮損傷和血管內皮功能障礙，且機體過度的氧化應激還會刺激炎性因子的表達，其中MDA是活性氧引起生物膜脂質過氧化產生的，其含量高低可反映脂質過氧化程度；SOD和GSH都屬于抗氧化酶，能夠催化活性氧和自由基，減少氧化應激損傷，是檢測機體抗氧化能力的指標^［13］。因此，抑制炎癥反應和氧化應激可緩解PIH大鼠模型的高血壓癥狀。在本研究中，PIH組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平較對照組明顯升高，SOD、GSH水平較對照組明顯下降，表明PIH大鼠存在較高氧化應激和炎癥水平。SFN治療后PIH大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平下降，SOD、GSH水平上升，這與程麗等^［3］研究發(fā)現SFN能改善體外L-NAME誘導下的PIH微環(huán)境中細胞的氧化應激、炎癥反應結果相似。

血管內皮通過產生和分泌血管活性物質、參與炎癥反應和氧化應激。VEGF是血管生成的重要細胞因子，與血管內皮細胞的增殖、分裂、凋亡相關，PIH會導致其水平下降，從而影響血管內皮細胞的生長發(fā)育；VCAM-1作為血清中黏附分子，在PIH中使血管內皮細胞與白細胞黏附作用加強，是血管內皮損傷標志物；NO是一種血管擴張劑，其濃度降低或缺乏是引發(fā)PIH的原因之一，導致血管內皮細胞損傷和血管功能障礙；ET-1屬于強力收縮血管物質，其水平升高會導致血管收縮，血壓升高，血管功能破壞^［14-15］。在本研究中，PIH組大鼠ET-1、VCAM-1水平較對照組明顯升高，VEGF、NO水平較對照組明顯下降，表明PIH大鼠血清中血管活性物質失衡，表現出血管內皮功能障礙。SFN能防止血管收縮增強，降低對內皮依賴性血管舒張的敏感性，充當急性血管擴張劑，并在缺氧條件下影響內皮細胞的活力^［16］。Langston-Cox等^［4］研究發(fā)現，SFN可改善先兆子癇樣損傷引起的血管功能障礙。研究表明，SFN能改善內皮功能，減少胎盤氧化應激，起到內皮保護的作用^［17］。在本研究中，SFN治療后大鼠ET-1、VCAM-1水平下降，VEGF、NO水平升高，表明SFN可減少PIH大鼠血管內皮功能障礙。

PI3K是細胞內磷脂酰肌醇激酶，能磷酸化激活下游分子AKT，共同參與細胞功能調節(jié)、免疫調控、癌癥和血管生成等^［5］。VEGF是發(fā)育過程中血管和淋巴功能的關鍵調節(jié)因子，參與細胞分化、增殖、遷移、細胞存活、增加的血管通透性、血管舒張和血管生成。VEGF是PI3K/AKT通路的下游靶標，VEGF介導的血管生成作用依賴于PI3K/AKT信號通路的調控^［18］。已有研究表明，通過激活PI3K/AKT/VEGF信號通路能刺激糖尿病視網膜病變大鼠的視網膜血管內皮細胞活力和血管生成^［19］。PI3K/AKT通路在高血壓血管內皮中發(fā)揮重要作用，江華等^［20］研究表明，當歸揮發(fā)油可能通過PI3K/AKT/eNOS通路來發(fā)揮降壓作用，且PI3K/AKT通路與PIH關系密切。Li等^［21］研究表明，新型多肽COL-4A1通過調控PI3K/AKT通路在肺動脈栓塞（PE）中發(fā)揮作用。LY294002是一種PI3K抑制劑，通過競爭性抑制PI3K亞基中的三磷酸腺苷（ATP）結合位點^［18］。本研究結果顯示，PIH組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、VEGF蛋白水平較對照組明顯降低，表明PI3K/AKT/VEGF信號通路與PIH有關。SFN已被證明能通過調控PI3K/AKT通路參與一些列生理病理反應，SFN治療后PIH大鼠p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、VEGF蛋白水平明顯升高，而LY294002干預可減弱SFN對PIH大鼠的保護作用，表明SFN可能通過激活PI3K/AKT/VEGF信號通路調節(jié)血管內皮功能。

綜上所述，SFN能減輕PIH大鼠血管內皮功能障礙，減少氧化應激，其作用機制可能與PI3K/AKT/VEGF蛋白通路的激活有關。

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（收稿日期：2023-02-20）

（本文編輯"郭懷?。?/p>