振蕩電場刺激對大鼠脊髓損傷后內源性神經干細胞增殖及運動功能恢復的影響

[摘要] 目的 探討振蕩電場刺激對大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后內源性神經干細胞（endogenous neural stem cell，ENSC）增殖和運動功能恢復的影響。方法 采用改進的Allen打擊法建立大鼠SCI模型，將其隨機分成實驗組和對照組，每組60只。實驗組采用振蕩電場刺激器植入進行干預，對照組不作任何干預，僅放置振蕩電場刺激器。造模成功后，于第3、7、14天時分別取出大鼠脊髓，行抗神經上皮干細胞蛋白（neuroepithelial stem cell protein，Nestin）/5–溴脫氧尿嘧啶核苷（5–bromodeoxyuridine，BrdU）免疫熒光檢測ENSC增殖情況，并采用免疫組織化學檢測脊髓中Wnt–3a蛋白表達；在第4、6、8周分別取脊髓行鋨酸染色觀察大鼠髓鞘形成情況，并在取材前對各組大鼠行Basso–Beattle– Bresnahan（BBB）運動功能評分。結果 免疫熒光染色結果顯示兩組大鼠SCI后第3天均可見損傷區Nestin/BrdU雙陽性細胞表達，第7天達到高峰，第14天開始逐漸下降，但仍維持在較高水平；實驗組大鼠各時間點的Nestin/BrdU雙陽性細胞數量均多于對照組。免疫組織化學結果顯示實驗組大鼠各時間點的Wnt–3a蛋白表達水平均高于對照組（Plt;0.05）。第6、8周時，實驗組大鼠的髓鞘數量顯著多于對照組（Plt;0.05）；第4、6、8周時，實驗組大鼠的BBB評分均顯著高于對照組（Plt;0.05）。結論 振蕩電場刺激可通過激活Wnt/β–catenin信號通路誘導SCI后ENSC增殖，促進髓鞘再生，改善大鼠運動功能。

[關鍵詞] 振蕩電場刺激；脊髓損傷；內源性神經干細胞；Wnt-3a蛋白；髓鞘

[中圖分類號] R318" """"[文獻標識碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.19.003

Effects of oscillating field stimulation on the proliferation of endogenous neural stem cell and recovery of motor function in rats after spinal cord injury

ZHANG Kunkun， SHAO Chen， QIAO Shaolin， QIU Dapeng， LIU Zhengjie

Department of Orthopaedics， the Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical University， Bengbu 233000， Anhui， China

[Abstract] Objective To investigate the effec of oscillating field stimulation on the proliferation of endogenous neural stem cell （ENSC） and recovery of motor function after spinal cord injury （SCI） in rats. Methods The SCI model was established by using the improved Allen’s strike method and was randomly divided into experimental group and control group， with 60 rats in each group. The experimental group received an oscillating field implant as the intervention， while the control group was equipped with the same device but without activation. After successful modeling， the spinal cord of rats was removed on the 3rd， 7th and 14th day， respectively. The proliferation of ENSC was detected by neuroepithelial stem cell protein （Nestin）/ 5–bromodeoxyuridine （BrdU） immunofluorescence， and the expression of Wnt-3a protein in spinal cord was detected by immunohistochemistry. At the 4th， 6th and 8th week， the spinal cord was stained with osmic acid to observe the formation of myelin sheath in rats， and Basso-Beattle-Bresnahan （BBB） functional score of each group of rats was performed before sampling. Results The immunofluorescence results showed that Nestin/BrdU double positive cells in the injured area could be seen in both groups on the 3rd day after SCI， reaching a peak on the 7th day， and gradually decreased on the 14th day， and still maintained at a high level. At the same time， number of Nestin/BrdU double positive cells in experimental group rats at each time point was more than that in control group. The immunohistochemical results showed that the expression level of Wnt-3a protein in experimental group rats at each time point was higher than that in control group （Plt;0.05）. At the 6th and 8th weeks， the number of myelin sheaths in experimental group rats was significantly higher than that in control group （Plt;0.05）. At the 4 th， 6th and 8th weeks， the BBB scores of rats in experimental group were significantly higher than those in control group （Plt;0.05）. Conclusion The oscillating field stimulation can induce the proliferation of ENSC after SCI by activating Wnt/β-catenin signaling pathway， promote myelin regeneration， and improve motor function of rats.

[Key words] Oscillating field stimulation; Spinal cord injury; Endogenous neural stem cell; Wnt-3a protein; Myelin

神經干細胞（neural stem cell，NSC）廣泛存在于成年哺乳動物的腦和脊髓中，正常情況下NSC處于相對靜止狀態，在損傷等特定情況下NSC可發生分裂、增殖、分化，參與損傷修復^[1]。振蕩電場刺激（oscillating field stimulation，OFS）是指植入器通過發出弱電場促進軸突向陰極生長，同時在陽極排斥軸突生長之前變換極性，從而促進損傷區軸突雙向生長^[2]。研究發現OFS對脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）大鼠具有明顯的神經保護及誘導軸突再生作用^[3-4]。Wnt信號通路是中樞神經系統發育過程中的關鍵途徑，研究表明電場刺激能夠有效上調Wnt通路蛋白表達^[5]。本研究通過觀察OFS對SCI大鼠損傷區內源性神經干細胞（endogenous neural stem cell，ENSC）增殖和運動功能的改善作用，對上述機制進行初步探討。

1" 材料與方法

1.1" 實驗動物

SPF級健康SD雄性大鼠120只，體質量180～200g，購自蚌埠醫科大學實驗動物公共服務平臺。實驗動物生產許可證號：SCXK（皖）2024-004，實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2022-007。動物實驗經蚌埠醫科大學實驗動物管理和倫理委員會批準（倫理審批號：倫動科批字[2025]第465號）。

1.2" 主要儀器與試劑

振蕩電場刺激器（中國科學院電工研究所）；5–溴脫氧尿嘧啶核苷（5–bromodeoxyuridine，BrdU）購自美國Sigma公司；小鼠抗神經上皮干細胞蛋白（neuroepithelial stem cell protein，Nestin）單克隆抗體、兔抗Wnt–3a多克隆抗體購自美國Abcam公司，大鼠抗BrdU單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，Alex488熒光二抗、Alex594熒光二抗、一步法抗兔即用型免疫組織化學檢測試劑盒購自中杉金橋公司；鋨酸購自美國Sigma公司。

1.3" 動物模型制備

所有大鼠均采用改進后的Allen打擊法構建SCI實驗模型。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（1ml/100g）全身麻醉，固定于NYU撞擊裝置操作臺上。于背部中線切開，移除T₁₀棘突及椎板，暴露脊髓，并對其施加5g/10cm的動能撞擊。撞擊后觀察到脊髓區域局部出血、尾巴出現痙攣性擺動及雙下肢抽搐，表明SCI模型建立成功。手術完成后，使用縫合線將OFS電極固定于T₉和T₁₁棘突兩側，并將刺激器固定于大鼠背部。

1.4" 實驗分組及干預

將120只大鼠隨機分為實驗組和對照組，每組60只。實驗組大鼠在手術完成后立即接受OFS治療，對照組大鼠僅安裝OFS器，不實施任何刺激。OFS的強度設定為400μV/mm，電場極性15min轉換一次，直至實驗結束。

1.5" 觀察指標及檢測方法

1.5.1 "脊髓標本取材及切片制作 "大鼠在預定時間點之前12h腹腔注射BrdU 50mg/kg，每隔4h一次，共3次。末次注射后4h，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，取出包含SCI位點及附近約1cm長的脊髓組織，4%多聚甲醛固定12h。建模成功后第3、7、14d，分別取大鼠脊髓組織制作連續水平石蠟切片，厚度4μm，通過Nestin/BrdU免疫熒光技術檢測ENSC增殖情況；采用免疫組織化學檢測脊髓中Wnt–3a蛋白表達，在第4、6、8周分別取脊髓行鋨酸染色觀察髓鞘形成，并在取材前對各組大鼠行Basso–Beattle–Bresnahan（BBB）運動功能評分。

1.5.2 "組織學檢查 "取上述切片常規脫蠟和水化，抗原修復，封閉，免疫熒光檢測加入一抗小鼠抗Nestin單克隆抗體（1∶1000）和一抗大鼠抗BrdU單克隆抗體（1∶50），4℃下避光孵育過夜，加入Alex488熒光二抗和Alex594熒光二抗（1∶100），37℃下孵育1h，在DAPI環境下細胞核染色10min，隨后添加適量抗光猝滅劑封固切片，熒光顯微鏡進行圖像捕捉和細胞觀察。免疫組織化學檢測加入一抗兔抗Wnt–3a多克隆抗體（1∶1000）4℃孵育過夜，加入中山金橋免疫組織化學二抗37℃下孵育20min，DAB顯色，蘇木精再次染色，中性樹脂封片并攝影，采用Image ProPlus 6.0軟件測量圖像，計算累積光密度值。

1.5.3 "髓鞘鋨酸染色 "脊髓組織4%多聚甲醛固定12h，加入1%鋨酸避光固定過夜，流水沖洗12h，依次浸入50%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，然后石蠟包埋切片，常規烤片脫蠟，封片、拍照、髓鞘計數。

1.5.4" 后肢運動功能評分 "術后第2、4、6、8周時由熟悉BBB評分的兩名研究者獨立進行評估，觀察大鼠后肢運動功能，最后取平均值。

1.6" 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件分析數據。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（"）表示，組間比較采用t檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1" 兩組大鼠各時間點免疫熒光染色結果

兩組大鼠SCI后第3天均可見損傷區Nestin/BrdU雙陽性細胞表達，第7天表達數量達到高峰，第14天表達數量逐步減少，但依舊保持在較高水平。實驗組大鼠各時間點的Nestin/BrdU雙陽性細胞表達數量均多于對照組，見圖1。

2.2" 兩組大鼠各時間點Wnt-3a蛋白免疫組織化學染色結果

兩組大鼠第3天時脊髓灰質內的Wnt–3a蛋白均高表達，第7天Wnt–3a蛋白表達水平開始降低，但仍保持較高水平，第14天時表達水平降至最低。實驗組大鼠各時間點的Wnt–3a蛋白表達水平均高于對照組（Plt;0.05），見圖2、表1。

2.3" 兩組大鼠各時間點髓鞘染色結果

光鏡下可見髓鞘鋨酸染色呈黑色類圓形，部分呈不規則形。第4周時兩組大鼠髓鞘數量比較差異無統計學意義（Pgt;0.05），第6、8周時實驗組大鼠髓鞘數量多于對照組（Plt;0.05），見圖3、表2。

2.4" 兩組大鼠不同時間點的BBB評分比較

兩組大鼠的BBB評分隨時間推移均逐漸升高。術后第2周時，兩組大鼠的BBB評分比較差異無統計學意義（Pgt;0.05），第4、6、8周時，實驗組大鼠的BBB評分均顯著高于對照組（Plt;0.05），見表3。

3" 討論

1992年，Reynolds等^[6]首次從大鼠體內分離并培養出一種能夠自我復制、具有多向分化潛能的細胞，并提出NSC的概念，打破成年哺乳動物中樞神經系統損傷后無法再生的傳統觀念。近年來研究證實SCI后ENSC被激活，但增殖數量有限，導致其修復SCI的能力有限^[7]。外源性干細胞移植多分化為星形膠質細胞，同時移植過程可能存在二次損傷、致瘤性、倫理等問題^[8]。因此，如何進一步激活ENSC是治療SCI的關鍵。

研究表明直流電場作用下的陰極軸突生長得到增強，而持續面向陽極的軸突顯示出退化現象^[9]。為克服直流電對軸突再生的不利影響OFS技術應運而生。早在1993年和1999年，Borgens等^[10-11]將振蕩電場應用于動物實驗，結果顯示OFS治療組狗脊髓中上下行軸突映射到橫切平面，運動功能恢復明顯優于對照組，而在對照組中則發現軸突有一定萎縮。隨后Shapiro等^[12]將OFS用于臨床證實其能促進SCI患者的運動、感知能力修復。白金柱等^[13]研究表明在SCI模型中，OFS可改善大鼠的運動能力，作用機制可能是通過促進軸突再生、誘導其定向生長而改善大鼠脊髓運動傳導功能。Fang等^[14]研究發現OFS通過調控miR-124/Tal1軸促進移植NSC神經發生，修復大鼠SCI。但OFS在SCI后ENSC增殖和神經功能修復中的作用尚不清楚。

為探索OFS對SCI后損傷區ENSC增殖影響，筆者采用BrdU和Nestin免疫熒光雙標染色技術。BrdU是一種胸腺嘧啶類似物，在細胞周期的S階段嵌入至細胞核內的DNA分子中，故BrdU陽性的細胞表明其正處于增殖狀態^[15]。Nestin是一種特定的中間絲狀蛋白，構成細胞骨架的一部分，主要在神經上皮的早期祖細胞及成年哺乳動物的pluripotent干細胞中發現^[16]。當細胞開始分化時，Nestin表達隨之終止，因而成為NSC的一個典型標志物。本研究結果表明，對照組大鼠SCI區可見BrdU和Nestin雙陽性細胞，證實SCI后處于靜息狀態的ENSC被激活。應用OFS治療后實驗組大鼠各時間點的BrdU和Nestin雙陽性細胞數均多于對照組，表明OFS可促進SCI后損傷區ENSC增殖。筆者還發現OFS治療可激活Wnt信號通路，增強Wnt–3a在SCI部位的表達。Wnt信號通路是調控細胞生長增殖分化的關鍵途徑，在中樞神經系統發育過程中發揮重要調控作用^[17]。Bang等^[18]研究發現SCI后早期Wnt–3a蛋白表達增加可促進ENSC增殖，隨著Wnt–3a蛋白表達下降，增殖的ENSC開始進入分化階段。本研究發現OFS治療后實驗組大鼠Wnt–3a表達水平明顯高于對照組，且ENSC數量也多于對照組，推測OFS正是通過激活Wnt/β–catenin信號通路促進SCI后ENSC增殖，改善SCI大鼠的預后。

髓鞘在神經系統中的作用至關重要，可為軸突生長提供營養，加快神經沖動傳導。研究表明電刺激可促進少突膠質前體細胞活化，從而誘導SCI大鼠髓鞘再形成^[3，19]。Mojaverrostami等^[20]將間充質干細胞移植到SCI小鼠后并施加電刺激治療，發現電刺激可促進間充質干細胞歸巢、少突膠質細胞增殖分化并減少細胞凋亡，提高髓鞘化程度。在OFS應用4周后，實驗組大鼠的髓鞘數量與對照組比較無顯著差異，但OFS應用6周以上時，實驗組大鼠的髓鞘數量明顯多于對照組。同時實驗組大鼠雙后肢BBB評分自OFS應用后4周開始明顯高于對照組，提示OFS可促進SCI后髓鞘再生，改善受損脊髓傳導功能，促進大鼠后肢運動功能恢復，但運動功能的恢復需要OFS持續應用4周以上。

綜上，OFS能夠激活Wnt信號通路，提高Wnt–3a蛋白表達，從而促進ENSC增殖。同時OFS可促進SCI后髓鞘再生，改善受損脊髓的傳導功能。因此，筆者認為OFS可通過多種生物學效應促進SCI大鼠運動功能恢復。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

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[6]"" REYNOLDS B A， WEISS S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system[J]. Science， 1992， 255（5052）： 1707–1710.