ｐＴＡＴ－ＨＡ質粒載體在受體菌ＤＨ５α中的轉化及鑒定

蔣常文　夏春波　徐雅娟　周　思　劉源劼　劉　靜

【摘要】 目的 探索pTAT-HA質粒在受體菌DH5α中轉化的方法。方法 配制LB培養基，將pTAT-HA質粒轉化至DH5α，培養篩選成功轉化子，電泳鑒定。結果 pTAT-HA質粒轉化菌可在Amp+LB培養基中生長，電泳結果顯示質粒大小準確無誤（約3000 bp）。結論 pTAT-HA質粒轉化成功，轉化菌可冷凍保存質粒，提取的質粒可用于下游分子生物學實驗。

【關鍵詞】 pTAT-HA質粒；DH5α；轉化

【Abstract】 Objective To explore the method thatDH5α was transformed with pTAT-HA vector.Methods LB medium was prepared,pTAT-XIAP vector was transformed into E.coli.DH5α.competent cells.Results Transformants were cultured on LB medium and selected.The plasmids were extracted,purified andidentified by agarose gel electrophoresis.Transformed DH5α Could grow on LB medium containing ampicillin,gel electrophoresis analysis showed that the molecular weight of pTAT-XIAP vector was about 3000 bp consistent withthe vector.Conclusion The pTAT-XIAP vector was succesfully transformed into the DH5α and the transformants were stored by cryopreservation,the purified plasmid could be used for molecular biologic experiments in the future.

【Key words】 pTAT-XIAP plasmid;DH5α;Bactria

轉化是在基因工程中向受體細胞導入外源基因的主要手段，在分子生物學研究中具有重要的作用，探索高效、快速轉化受體菌的方法是目的基因保存、擴增和進行后續研究的基礎。本實驗將pTAT-HA質粒載體轉化至DH5α受體菌，取得了成功，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 pTAT-HA質粒（美國Steven F Dowdy惠贈），DH5α感受態細胞（購自TIANGEN公司），Biospin質粒DNA小量提取試劑盒（BIOER公司，Cat＃ BSC01M1），無水乙醇，胰蛋白胨，酵母提取物，氯化鈉，瓊脂粉，氨芐青霉素。

1.2 方法

1.2.1 LB培養基的配制 胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，溶解并定容至1000 ml，調pH至7.4，固體培養基加2%瓊脂粉，高壓滅菌。選擇培養基加氨芐青霉素至終濃度50 μg/ml。

1.2.2 pTAT-HA質粒轉化與篩選 取100 ml DH5α感受態細胞于冰水浴，向感受態細胞中加入10 μl pTAT-HA質粒DNA，冰浴靜置30 min，將離心管置于42℃水浴90 s，冰浴冷卻2~3 min，向離心管中加入900 μl LB液體培養基（不含抗生素），37℃搖床震蕩培養45 min。取100 μl轉化菌液加到LB固體培養基（含氨芐青霉素），37℃培養12~16 h，照相。

1.2.3 pTAT-HA質粒擴增及鑒定 取單個轉化菌落接種至LB液體培養基培養過夜，將1~1.5 ml菌液加入1.5 ml無菌EP管中，10 000轉/min離心30 s，棄上清，加250 μl Resuspension Buffer重懸菌體，加250 μl Lysis Buffer，輕柔顛倒4~6次，加350 μl Neutralization Buffer，立即輕柔顛倒4~6次，12 000轉/min離心15 min。將上清液轉移到Spin column內，6 000轉/min離心1 min，棄接液管液體，加650 μl Wash Buffer，12 000轉/min離心30~60 s，棄接液管液體，再次于12 000轉/min離心1 min，將Spin column轉移至1.5 ml無菌EP管中。向Spin column內加TE溶液50 μl，靜置1 min，于12 000轉/min離心1 min。取5 μl離心管內液體于150 V電壓，1%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外透射儀觀察，凝膠成像系統照相。

2 結果

2.1 DH5α在LB固體培養基中的生長情況 培養結果顯示，轉化菌液在含氨芐青霉素的LB固體培養基上呈分散菌落生長，在無氨芐青霉素的LB固體培養基上成片生長，DH5α感受態細胞（無pTAT-HA質粒）在含氨芐青霉素的LB固體培養基上未見菌落生長，圖1。

2.2 pTAT-HA質粒電泳結果 電泳結果顯示，pTAT-HA質粒條帶大小與試劑說明書中的一致，無基因組條帶；未轉化的DH5α感受態細胞中無質粒DNA條帶，圖2。

3 討論

大腸桿菌DH5α菌株經特殊工藝處理后得到DH5α感受態細胞，菌細胞在低溫和低滲溶液中，菌細胞壁通透性增加，菌體膨脹成球形，此時轉化液中的DNA形成抗Dnase的羥基-鈣磷酸復合物，粘附于細胞表面，經短暫的熱休克后容易進入菌體細胞中［1］。熱休克溫度是決定轉化成敗及轉化效率高低的關鍵因素，溫度過低轉化效果不理想，過高使大腸桿菌細胞壁的通透性過強，易導致質粒的丟失，所以應選擇42℃作為最佳熱休克溫度［2］。有報道［3］，轉化時間對轉化率的影響顯著，在15~60 min之間，隨著轉化時間的延長，轉化率提高，而超過 60 min，轉化率則無進一步的提高。本實驗采用冰浴30 min，42℃熱休克作用90 s，冰浴冷卻2~3 min，37℃溫孵45 min可獲得較高的轉化效果。pTAT-HA質粒中有抗氨芐青霉素基因，故含pTAT-HA質粒的DH5α（轉化子）能在Amp+LB培養基中生長，其余不能存活。而未經轉化的DH5α在Amp+LB培養基中不能生長，說明在Amp+LB培養基中生長的DH5α是由外源基因（即pTAT-HA質粒）轉化成功發揮了作用。

在提取pTAT-HA質粒進行鑒定時，需注意提取的菌細胞不宜過多，否則會影響質粒的質量。加入菌體裂解液后不宜劇烈振動、作用時間不宜過長（5 min），以防止基因組DNA被剪切，出現非特異性條帶，影響鑒定。本實驗成功將pTAT-HA質粒轉化至DH5α感受態細胞，電泳鑒定明確的pTAT-HA質粒可用于下游分子生物學實驗或-20℃保存。

參 考 文 獻

［1］ 張果，昌曉紅，石菁菁，等.卵巢癌抗獨特型單鏈抗體6B11 scFv與鼠HSP70融合蛋白的構建、表達及鑒定.中國醫藥生物技術，2008，3（5）：336-342.

［2］ 金文輝，郭焱，崔健麗，等.人卵GST-ZP3融合蛋白在大腸桿菌中的表達、純化及其免疫原性的檢測.中國婦幼保健，2008，23（23）：3311-3314.

［3］ 郭英，曲章義.流感病毒RNA聚合酶PA亞基重組質粒pQE32-PA-2轉化效率的實驗研究.齊齊哈爾醫學院學報，2003，24（2）：221.