基因靶向篩選藥物寡聚酰胺的研究進展

柯 鋒

(浙江工業大學藥學院，浙江 杭州 310014)

隨著人類基因組計劃的完成，相關基因與具體疾病之間的相互關系成為后基因組時代的研究熱點，如遺傳病基因治療、癌癥基因治療及以艾滋病為代表的重要感染性疾病的治療。因此，以DNA為藥物作用靶標的研發也越來越受到世界各大制藥廠商和醫藥專家的極大關注。20世紀80年代末，美國Dervan研究組受到偏端霉素A結構特點的啟發，將研究重點轉向以寡聚酰胺(Polyamide)為模板的DNA識別分子調控基因表達的研究。日本京都大學的Sugiyama研究組同Fukuda研究組合作，深入開展了對這類物質的合成和生物活性測試方面的研究。

寡聚酰胺是繼核酸反義技術和RNA干擾技術之后，小溝結合物(Minor groove binder，MGB)研究的又一熱點，也是迄今為止最具潛力開發成以基因為靶標的治療藥物的合成小分子化合物之一，因此其相關研究具有重要的現實意義。作者在此綜述了該類化合物的化學與生物學研究進展。

1 由偏端霉素A到寡聚酰胺對DNA分子的識別作用

自然界里抗生素偏端霉素A是一類天然的DNA識別小分子物質，具有抗病毒和抗腫瘤活性。偏端霉素A的分子結構特點是由芳香環通過酰胺鍵連接而成的平面共軛體系，其核心結構是寡聚含吡咯的酰胺，這種結構對DNA的 AT富集區有高度選擇性識別作用，尤其與5′-AAATT-3′序列的結合性非常好。偏端霉素A能夠對稱地結合于DNA小溝的中間，分子中的每一個酰胺鍵均與相鄰堿基腺嘌呤的N(3)和另一條鏈上胞嘧啶的O(2)形成橋型的氫鍵，并通過范德華力和靜電相互作用與DNA結合，形成三明治狀結構[1]。 受此啟發，美國Dervan研究組設計合成的吡咯-咪唑寡聚酰胺分子能在DNA雙螺旋小溝處按1∶1比例識別特定堿基(圖1)[2～5]；這類化合物一般由2～3種不同的芳香雜環通過酰胺鍵連接而成的平面共軛體系組成， 普遍用到的是N-甲基吡咯(Py) 和N-甲基咪唑(Im)，分別類似于天然抗生素 Netropsin 和Distamycin。為了讓寡聚酰胺分子能與G·C堿基對有效結合而引入了咪唑基團，合成的ImPyPyDp分子(Dp=N，N-二甲基丙胺)以2∶l的比例反向平行與DNA小溝處的5′-TGTCA-3′序列結合[6]。接著Dervan等[7]將γ-氨基丁酸(γ)引入寡聚酰胺分子中，設計并合成了一種新型的頭尾相連的發夾狀(Hairpin)寡聚酰胺，即通過γ-氨基丁酸將兩條反向平行寡聚酰胺鏈的C端與N端連結起來，在分子內引導形成轉折。人工合成的寡聚酰胺分子中通常還含有β-氨基丙酸(β)和N，N-二甲基丙胺(Dp)。進一步研究發現，γ-氨基丁酸(γ)和β-氨基丙酸(β)不僅充當連接的角色，也是具有一定序列選擇性的重要構件基團；Dp則能使寡聚酰胺分子在人體pH值條件下以陽離子的形式存在，增大分子的水溶性，同時對寡聚酰胺分子識別DNA時的分子取向以及對細胞膜的穿透也有重要意義[8～10]。

Py.N-methylpyrrole Im.N-methylimidazole γ-turn.γ-aminobutyric acid Hp.3-hydroxy-1-methylpyrrole β-tail.β-alanine dimethylamino propylamide

2 寡聚酰胺與DNA堿基的識別配對規則及結合模式

含吡咯-咪唑寡聚酰胺以其配對的芳香族氨基酸與相應DNA的堿基通過最大可能地形成氫鍵識別DNA序列。大量實驗結果表明：寡聚酰胺分子主要通過反向配對的Py和Im實現對DNA特定序列的識別。據此，Dervan提出了寡聚酰胺識別DNA的配對規則：反向平行成對的Py/Im特異識別C·G堿基對，Im/Py特異識別G·C堿基對；反向平行成對的Hp/Py特異識別T·A堿基對，Py/Hp特異識別A·T堿基對，Py/Py特異識別T·A或A·T堿基對[11]。研究還發現，Im/β和β/Im能夠從A·T和T·A中識別G·C和C·G堿基對，而Py/β和β/Py能夠從G·C和C·G中識別A·T和T·A堿基對[12]。這類分子可在DNA的小溝處連續識別4～5個d(AoT)堿基對，由此1分子的寡聚酰胺與1條雙鏈DNA通過結構匹配和氫鍵作用形成特異性識別作用(1∶1模型，圖2a)[4]。多維核磁數據也證明在一定濃度下寡聚酰胺以反向平行肩并肩的結合方式(即2分子結合到DNA雙螺旋小溝處且分別與2條鏈上DNA通過結構匹配和氫鍵形成)識別DNA的堿基序列(2∶1模型，圖2b)，通過γ-氨基丁酸(γ) 連接2分子形成發夾狀寡聚酰胺(1∶1模型，圖2c)[2,13,14]。利用這個識別規律，科學家們可以針對某一特定序列設計出相應的寡聚酰胺識別分子對其進行特異性識別，進而調控相關基因而達到治療相關疾病的目的。

圖2 吡咯-咪唑寡聚酰胺與DNA雙螺旋作用的1∶1模型(a)、 吡咯-咪唑寡聚酰胺與DNA雙螺旋作用的2∶1模型(b)、發夾狀寡聚酰胺與DNA雙螺旋作用的1∶1模型(c)

3 寡聚酰胺的透膜能力

根據特定DNA序列設計的寡聚酰胺要發揮對特定基因的調控作用，能否穿過細胞膜進入細胞核是關鍵的一步。Janssen等[15]和Sun等[16]最先開展了這方面的研究，他們分別先用聚甲醛固定果蠅Kc細胞和人類結腸癌細胞系DLD-1，再加入用熒光素標記的寡聚酰胺進行共培養，熒光素標記定位顯示寡聚酰胺都能順利進入這兩種細胞的細胞核。Belitsky等[17]、Best等[18]和Dudouet等[19]利用激光共聚焦顯微鏡觀察了多種活細胞中寡聚酰胺的透膜能力。結果表明寡聚酰胺能否進入細胞核主要取決于細胞的類型，例如在SKBR-3(人類乳腺癌細胞)、NB4(人類白血病細胞)、293(成纖維細胞)、Sf9(昆蟲細胞)和Kc(果蠅細胞)中，寡聚酰胺都能進入胞質，但未能透過核膜進入細胞核；而在T細胞系CEM、MT-2、PM1及髓系細胞KYO1中則可以順利進入細胞核。此外，寡聚酰胺的結構(如分子中是否含有β-氨基丙酸和咪唑基團及其位置和數量)明顯影響到寡聚酰胺進入細胞核的能力[20]。

4 體外細胞水平寡聚酰胺調控基因表達

為考察寡聚酰胺類識別分子順利進入細胞核后，是否與特定DNA序列特異性識別并調控其轉錄，研究者對體外細胞培養體系進行了研究。

Dickinson等[21]根據HIV-1病毒核酸序列增強子/啟動子中多種轉錄因子如TBP、ETs-1和LEF-1等的識別序列，合成了分別與HIV-1基因TATA盒、LEF-1元件和ETs-1元件側翼序列相匹配和錯配的寡聚酰胺分子，結果發現匹配的寡聚酰胺能夠抑制轉錄因子與靶序列結合從而抑制RNA聚合酶Ⅱ的轉錄。而錯配的寡聚酰胺沒有這樣的效果。Lai等[22]合成了與轉化生長因子-β1(TGF-β1)啟動子FSE2元件側翼堿基序列(-545～-539 bp)匹配及錯配的寡聚酰胺，將匹配的寡聚酰胺與人平滑肌細胞培養體系共同孵育48 h，TGF-β1啟動子的活性顯著降低，TGF-β1的mRNA和蛋白轉錄表達受到明顯抑制。研究表明，聯合應用多個匹配的寡聚酰胺以阻斷病毒的轉錄和復制是治療疑難疾病的新策略。

5 體內動物模型中寡聚酰胺調控基因表達

寡聚酰胺分子在動物體內調控基因表達的機制，是通過特異性和某段基因序列相結合，從而對與該段基因序列結合的某些關鍵性的酶產生競爭性抑制作用來實現的(圖3)[13]。相關研究的最初實驗對象是以果蠅為主，其后研究寡聚酰胺對胚胎發育的影響、在小鼠模型上針對特定基因的轉錄抑制實驗都取得了不錯的結果。

圖3 含吡咯-咪唑寡聚酰胺分子抑制基因表達作用模式

Dickinson等[23]設計的一種寡聚酰胺-瘤可寧結合物可作用于組蛋白H4C基因編碼區，抑制多種腫瘤細胞系的增殖，且該結合物在荷瘤小鼠體內同樣具有生物活性。Matsuda等[24]以Dahl-S小鼠為模型，設計了一種針對TGF-β1基因啟動子AP-1元件的寡聚酰胺，能明顯抑制小鼠腎小球系膜細胞中該基因啟動子的活性。熒光素標記的寡聚酰胺靜脈注射小鼠后可分布到腎臟，顯著抑制腎臟皮質中TGF-β1的mRNA和蛋白的表達，并且不依賴血壓變化就能減少尿蛋白。這種寡聚酰胺分子有可能治療TGF-β1高表達相關的疾病。最近，Washio等[25]、Matsuda等[26]建立了小鼠增生性疤痕的動物模型，設計了針對其TGF-β1啟動子區的配對的寡聚酰胺分子作為篩選藥物并以錯配的寡聚酰胺分子作為參照，分別從外觀和微觀切片的角度進行觀察并在mRNA和蛋白質水平進行檢測，結果顯示配對的寡聚酰胺分子較好地抑制了TGF-β1的高表達，而錯配的寡聚酰胺的抑制效果不明顯，這些成果將這類化合物走向臨床靶向治療推進了一大步。

6 展望

DNA是遺傳信息的載體，也是藥物作用的重要靶點。隨著人們對遺傳信息越來越深入的認識，利用已知的遺傳信息開發出治療相關重大疾病的藥物是科學家一直努力的方向。寡聚酰胺是一種新型的調控基因表達的DNA識別分子，與反義寡聚核苷酸和肽核酸相比更穩定、細胞通透性能更好，而且具有高度的序列選擇性與結合力，能有效地抑制或激活相關基因的轉錄和表達。此外，寡聚酰胺識別分子不僅可以應用于抗腫瘤和抗病毒研究，還在醫學診斷、生物標記、抗細菌、抗真菌等方面有著廣泛的應用潛能，是一種很有前途的基因靶向篩選藥物。

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