川芎嗪干預心力衰竭犬心房纖維化及MMP-2與TIMP-2的mRNA表達研究

林亞洲，陳林，連亮華，吳梅瓊，陳建泉，楊志平

1.福建省立醫(yī)院心內(nèi)二科，福建福州 350001；2.福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院，福建福州 350001

心房纖維化是心力衰竭（HF）時心房顫動（AF）發(fā)生與維持的重要病理基礎(chǔ)。HF 時腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）激活，可導致包括膠原蛋白在內(nèi)的細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白合成增加[1]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族與其內(nèi)源性組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）的基因表達及活性在心肌的纖維化進程中起重要作用[2-3]，其中MMPs 能特異性降解ECM 成分。中藥制劑川芎嗪具有多重生物學及藥效學效應，其化學結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪（TMP），臨床既可以應用于HF 又可以用于治療器官組織纖維化[4-5]，但目前用于防治AF 與心房組織纖維化及其相關(guān)機制尚無文獻報道。該研究從2013年9—12月將21 只實驗犬分為對照組、HF 組及TMP 干預組。通過心室快速起搏建立HF 模型并予以川芎嗪治療，觀察AF 誘發(fā)情況、檢測心房纖維化程度、運用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應技術(shù)（RT-PCR）測定左右心房組織的MMP-2、與TIMP-2 的mRNA 表達，探討HF 時心房纖維化與MMP-2/TIMP-2 的關(guān)系以及川芎嗪干預的療效和作用途徑，為中醫(yī)藥防治HF 與AF 提供客觀依據(jù)與可能的途徑，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

健康雜種犬21 條（2013年9—12月由福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供并飼養(yǎng)），體重（16±4）kg，犬齡（3.2±1.0）歲，雌雄不拘，實驗犬隨機分為3 組：對照組（Control）7 只，HF 組7 只和TMP 治療組7只。

1.2 HF 組模型建立、AF 的誘發(fā)及藥物處理

快速心室起搏致HF 模型建立以及AF 的誘發(fā)參照既往研究[6]，誘發(fā)的AF 持續(xù)超過15 min 則定義為持續(xù)性AF。TMP 組模型建立開始即給予TMP （國藥準字H32023383，無錫市第七制藥有限公司）治療，劑量為10 mg/（kg·d）肌肉注射。

1.3 標該研究采集與心房組織學檢測

所有實驗犬在誘發(fā)AF 后，取左右心房游離壁，漂洗干凈后10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片。Mallory 氏三色法染色，肌組織呈鮮橘黃色，膠原纖維呈深藍色，SigmaScan4.0 圖像分析系統(tǒng)檢測纖維化百分比。另取左右心房組織約100 mg 轉(zhuǎn)入深低溫冰箱-70 ℃保存待測mRNA 的表達。

1.4 RT-PCR 方法

從Genbank 查獲目標基因MMP-2、TIMP-2 和內(nèi)參照基因β-actin 的mRNA 序列；運用Primer Express 設計目標基因MMP-2（346bp，上游5’-GCC CCA AAG AGA GAT GCA ACC TAT-3’，下游5’-CGG CCA AAG TTG ATC ATG ATG TC-3’）、TIMP-2（529bp，上游5'-GAT CCA GTA TGA GAT CAA GC-3'，下游5'-ATG TCA GAG CTG GAC CAG TC-3'）和β-actin（111bp，上游5'-CTC CAT CAT GAA GTG TGA CGT T-3'，下游5'-ATC TCC TTC TGC ATC CTG TCA G-3'）的上下游引物，所有引物由TaKaRa 公司合成。取心房組織100 mg，參照Gibco 公司的Trizol RNA 提取說明書流程提取組織總RNA，并鑒定RNA 純度與完整性。按逆轉(zhuǎn)錄常規(guī)操作，進行RT-PCR 擴增，94 ℃預變性5 mim 后進入PCR 循環(huán)，各目標基因退火溫度均為58 ℃。各目標基因共擴增產(chǎn)物和β-actin 在同一反應體系中電泳，在ImageMaster VDS-CL 凝膠成像系統(tǒng)上掃描，測各目標基因和β-actin 條帶的OD 值,以兩者比值代表各目標基因的相對表達含量。

1.5 統(tǒng)計方法

所有統(tǒng)計處理由SPSS15.0 統(tǒng)計軟件包完成，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，并采用t 檢驗，計數(shù)資料采用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心房顫動誘發(fā)結(jié)果與纖維化程度比較

與對照組相比，HF 組與TMP 組的AF 易于誘發(fā)，其AF 與持續(xù)性AF（SAF）誘發(fā)率均明顯增加，AF 持續(xù)時間（DAF）明顯延長，左右心房纖維化程度均有顯著增高，HF 組的AF 持續(xù)時間與左心房纖維化程度呈高度正相關(guān)關(guān)系（r=0.841，P=0.018）。TMP 組與HF 組相比，持續(xù)性AF 的誘發(fā)率明顯降低，左右心房的纖維化程度分別降低51.5%和32.5%，見表1、表2，圖1～3 所示。

圖1 對照組心房組織（Mallory 氏三色法×20）：組織內(nèi)未見纖維化

圖2 HF 組心房組織（Mallory 氏三色法×20）：組織纖維化明顯，由增生的成纖維細胞、大量的膠原成分以及脂肪細胞等組成細胞間連接組織明顯增加

圖3 TMP 組心房組織（Mallory 氏三色法×20）：心房肌間質(zhì)纖維組織增生明顯減少

表1 各組心房顫動誘發(fā)率比較

表2 各組心房顫動持續(xù)時間及纖維化程度比較（±s）

表2 各組心房顫動持續(xù)時間及纖維化程度比較（±s）

注：與Control 比較*P＜0.001，與HF 比較#P＜0.05，##P＜0.001。

指標Control(n=7)HF(n=7) TMP(n=7)DAF（S）fibrosis of RA（%）Fibrosis of LA（%）3.24±3.56 2.88±0.45 3.05±0.46(462.1±181.4)*(8.36±1.46)*(11.25±1.76)*(340.6±162.6)*(5.64±0.99)*#(5.46±1.14)*##

2.2 各組目標基因mRNA 表達的變化

在右心房中，HF 組與對照組比較，MMP-2 的mRNA 表達顯著性升高，增加65.7%，TIMP-2 雖無明顯變化，但MMP-2/TIMP-2 仍增高106.1%。在左心房中，HF組與對照組比較，MMP-2 的mRNA 表達量顯著升高，增加達到100.0%。TIMP-2 則降低46.3%，MMP-2/TIMP-2 增高285.3%。TMP 組與HF 組比較，TIMP-2 的mRNA 表達明顯增高，M MP-2 的mRNA 表達和MMP-2/TIMP-2 比值顯著降低，見表3，圖4～5所示。

表3 各組目標基因mRNA 表達的比較（±s）

表3 各組目標基因mRNA 表達的比較（±s）

注：與Control 比較：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與HF 比較，#P＜0.05，##P＜0.01,###P＜0.001。

指標Control(n=7)HF(n=7) TMP(n=7)RA LA MMP-2/β1-actin TIMP-2/β2-actin MMP-2/TIMP-2 MMP-2/β1-actin TIMP-2/β2-actin MMP-2/TIMP-2 0.70±0.22 2.20±0.56 0.33±0.10 1.54±0.45 4.47±0.87 0.34±0.09(1.16±0.40)*1.85±0.52(0.71±0.46)*(3.08±0.76)***(2.40±0.61)***(1.44±0.73)***0.85±0.32 2.30±0.55 0.43±0.26(1.77±0.50)##(3.94±0.79)##(0.49±0.23)##

圖4 MMP-2 的mRNA 表達：1=右房對照組，2=右房HF 組，3=右房TMP組，4=左房對照組，5=左房HF 組，6=左房TMP 組，M=50bpDNA 梯

圖5 TIMP-2 的mRNA 表達：1=右房對照組，2=右房HF 組，3=右房TMP 組，4=左房對照組，5=左房HF 組，6=左房TMP 組，M=50bpDNA梯

3 討論

心房纖維化可以導致心房內(nèi)不應期及傳導時間延長、微折返形成，是HF 時AF 發(fā)生與維持的主要基質(zhì)因素。川芎屬于活血化瘀兼有行氣作用的中藥，川芎嗪是化學結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪（TMP）的一種有效活性生物堿，臨床上廣泛用于拮抗肝、肺、腎等組織器官的纖維化治療[5]。

該研究也顯示，HF 組的心房纖維化程度明顯高于對照組，且AF 持續(xù)時間與左心房纖維化程度呈密切正相關(guān)，證實心房纖維化可以參與AF 的發(fā)生與維持。相對于HF 組，TMP 組的左右心房的纖維化程度分別降低51.5%和32.5%，而且持續(xù)性AF 誘發(fā)率明顯降低達50%，AF 持續(xù)時間有所縮短，提示川芎嗪可以通過改善心房纖維化進而減輕AF 的發(fā)生與維持。

心臟由以心肌細胞為主的各種細胞和以膠原為主的ECM 組成，ECM 的變化、動態(tài)平衡的破壞是心臟重構(gòu)的重要原因[7]。MMPs 是降解ECM 成分的最主要蛋白水解系統(tǒng)，屬于內(nèi)源性鋅離子依賴性酶家族，TIMPs 是MMPs 的內(nèi)源性特異性抑制劑。二者的相互作用與相互影響決定了心肌ECM 重構(gòu)過程的進展[8]，多數(shù)研究顯示MMPs 表達的異常增高伴隨著組織纖維化的增加，其主要原因是MMPs 通常降解具有正常結(jié)構(gòu)和功能的膠原蛋白，隨后被其他缺乏連接結(jié)構(gòu)的異常纖維性間質(zhì)取代[9-11]。

我們的研究結(jié)果顯示，MMP-2 的mRNA 表達在左右心房中均明顯升高、而TIMP-2 降低，提示MMP-2/TIMP-2 在mRNA 水平的調(diào)節(jié)失衡可能導致異常的膠原增生，應該是HF 時心房纖維化與AF 的發(fā)生維持的分子基礎(chǔ)之一。提示若要改善HF 時心房纖維化、預防和減少AF 發(fā)生與維持，則通過調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs 的平衡及其相關(guān)調(diào)控因子活性和表達，可能是的新的有效途徑，但目前這方面的臨床與實驗研究均未見相關(guān)文獻報道。

有研究提示，川芎嗪可以通過減少MMP-1 表達來減輕博來霉素誘導的大鼠肺纖維化程度[12]，亦可通過下調(diào)MMP-9、TIMP-1 表達,進而減緩腎纖維化的病程進展[13]。

該研究在基因轉(zhuǎn)錄水平檢測川芎嗪對MMPs/TIMPs調(diào)節(jié)的結(jié)果顯示：與HF 組相比，右心房中，川芎嗪組MMP-2 的mRNA 表達下降26.7%，MMP-2/TIMP-2 比值下降39.4%，左心房中則分別下降42.5%和65.9%，而TIMP-2 則上調(diào)64.2%；各參數(shù)與對照組無顯著性差異。而且隨著MMP-2 與TIMP-2 基因mRNA 表達的趨向正常化，心房纖維化得到明顯的改善。提示川芎嗪通過上調(diào)TIMPs 的基因表達，從而加強對MMPs 的抑制，促使MMPs/TIMPs 的平衡恢復到相應水平，進而改善HF 時心房纖維化的程度與進程的發(fā)展。

綜上所述，川芎嗪通過有效地調(diào)節(jié)MMP-2 與TIMP-2 的mRNA 表達改變，從而并促進MMP-2/TIMP-2 平衡恢復，減少異常結(jié)構(gòu)的纖維組織在心房中的堆積，可能是其改善心房纖維化的分子機制，但其通過哪些相關(guān)基因表達與信號通路及其相應機制有待于深入研究；AF 的發(fā)生與維持機制仍有許多領(lǐng)域存在空白，我們同時也發(fā)現(xiàn)川芎嗪并不能完全阻斷和逆轉(zhuǎn)心房纖維化的進程與減少AF 的發(fā)作，這其中存在的其他途徑、機制以及藥物的劑量和治療時間等因素有待深入研究。

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