外周血白細胞端粒長度與早發冠心病的相關性及其影響因素分析

田然，張磊楠，張婷婷，黎婧怡，陳連鳳，劉震宇，沈珠軍，曾勇，謝洪智，張抒揚

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外周血白細胞端粒長度與早發冠心病的相關性及其影響因素分析

田然，張磊楠，張婷婷，黎婧怡，陳連鳳，劉震宇，沈珠軍，曾勇，謝洪智，張抒揚

摘要

目的：探究外周血白細胞端粒長度（LTL）與早發冠心病的相關性及其影響因素。

方法：納入早發冠心病患者128例（早發冠心病組，其中急性冠狀動脈綜合征患者88例，穩定性冠心病患者40例），非冠心病患者128例（非冠心病組），兩組≤30歲、31～40歲、41～50歲、51～60歲年齡段患者均為2、14、65、47例。采用熒光定量方法測定外周血LTL，采用Spearman相關及多元線性回歸，分析LTL與早發冠心病的相關性及其影響因素。

結果：早發冠心病組中急性冠狀動脈綜合征患者的男性比例、Gensini評分較穩定性冠心病患者高，端粒與單拷貝基因比率（T/S比率）、LTL較穩定性冠心病患者低，差異有統計學意義（P均＜0.05）。早發冠心病組外周血T/S比率較非冠心病組顯著降低（0.88±0.86 vs 1.10±0.57，P＜0.05），但兩組10年T/S比率變化值差異無統計學意義（-0.17±0.10 vs -0.25±0.07，P=0.63）。早發冠心病組和非冠心病組T/S比率與年齡均呈負相關（ r=-0.275，P=0.002；r=-0.316，P=0.000）。Spearman相關分析顯示，早發冠心病組患者LTL與高脂血癥（r=-0.415，P=0.049）、糖尿病（r=-0.472，P=0.036）均呈明顯負相關。多元線性回歸分析顯示，早發冠心病組LTL與年齡呈負相關（B=-0.023，P=0.038）；非冠心病組LTL與年齡（B=-0.027，P=0.000）、吸煙史（B=-0.278，P=0.012）、高密度脂蛋白膽固醇（B=-0.297，P=0.046）水平均呈負相關。

結論：在早發冠心病患者中，急性冠狀動脈綜合征患者男性更多見、LTL更短、冠狀動脈病變更加嚴重。與非冠心病組比較，早發冠心病患者的外周血LTL明顯縮短但縮短速率并未增加。早發冠心病患者LTL與高脂血癥、糖尿病明顯負相關，年齡的增長是導致其端粒縮短的最主要因素；而對于非冠心病患者，除了年齡增長外，吸煙、高密度脂蛋白膽固醇水平改變也是引起端粒縮短加速的主要因素。

關鍵詞 冠狀動脈疾病；白細胞；端粒；危險因素

Objective： To explore the changes of peripheral leukocyte's telomere length （LTL） in patients of premature coronary artery disease （PCAD） with influencing factors.

Methods： Our research was conducted in 2 sets of groups， by coronary artery condition： PCAD group， n=128 including 88 patients with ACS， 40 with SCAD and Non-CAD group， n=128 subjects； by age status： the age≤30 years， 31-40 years， 41-50 years， 51-60 years had 2， 14， 65， 47 patients in each group respectively. Peripheral LTL was detected by fluorescent quantitative analysis， the relationship between LTL and PCAD with influencing factors were studied by Spearman correlation analysis.

Results： In PCAD group， compared with SCAD patients， ACS patients had more male gender， higher Gensini score，lower T/S ratio and shorter LTL， all P＜0.05. Compared with Non-CAD group， PCAD group had decreased T/S ratio （0.88 ± 0.86）vs （1.10 ± 0.57）， P＜0.05. T/S ratio was negatively related to age in both PCAD group （r=-0.275， P=0.002） and Non-CAD group （r=-0.316， P=0.000）. Spearman correlation study presented that in PCAD group， LTL was negatively related to hyperlipidemia （r=-0.415， P=0.049） and diabetes （r=-0.472， P=0.036）； multi linear regression analysis indicated that in PCAD group， LTL was negatively related to age （B=-0.023， P=0.038） and in Non-CAD group， LTL was negatively related to age （B=-0.027， P=0.000），smoking （B=-0.278， P=0.012）， HDL-C （B=-0.297， P=0.046）.

Conclusion： PCAD had more male ACS patients with shorter LTL and severer coronary lesions； LTL was negatively related to hyperlipidemia and diabetes， age was an important influencing factor for LTL shortening.

Key words Coronary artery disease； Leukocytes； Telomere； Risk factors

（Chinese Circulation Journal， 2016，31：541.）

冠心病是嚴重危害人類健康的心血管疾病，近年來，發病率升高，并趨于年輕化。 Framingham研究關于早發冠心病的定義為：冠心病的發病年齡＜55歲（男）或＜65歲（女）。早發冠心病患者發病年齡早，臨床表現及冠狀動脈病變特點突出，具有更加顯著的遺傳背景，受到了越來越多的關注［1， 2］。端粒是位于真核生物染色體末端的帽樣結構，能夠維持染色體穩定性。既往研究表明，冠心病患者的端粒縮短可作為心血管風險增加的一種標志物［3］，端粒縮短可能促進細胞衰老、凋亡，參與動脈粥樣硬化和冠心病的發生。早發冠心病患者冠狀動脈傳統危險因素少，其端粒長度可能更能反映其遺傳特性。本研究旨在探討外周血白細胞端粒長度（LTL）與早發冠心病的相關性及其影響因素。

1 資料與方法

1.1 研究對象

按照年齡、性別匹配原則，共納入2012-07至2014-01期間在我院心內科住院的患者256例。早發冠心病患者128例（早發冠心病組，其中急性冠狀動脈綜合征患者88例，穩定性冠心病患者40例），男性年齡＜55歲，女性年齡＜65歲，并經皮冠狀動脈造影證實冠狀動脈狹窄程度≥50%。非冠心病患者128例（非冠心病組）為經冠狀動脈造影除外冠心病者。兩組≤30歲、31～40歲、41～50歲、51～60歲年齡段患者均為2、14、65、47例。排除標準：心肌炎、心包炎；引起胸痛的其他原因（如：肺栓塞、主動脈瘤、先天性心臟病、肥厚性心肌病等）；非冠狀動脈粥樣硬化病變所致心肌酶升高（如：冠狀動脈畸形、川崎病、多發性大動脈炎及手術治療等）；明確的感染性疾病、發熱（體溫＞37.5℃）；結締組織病；腫瘤；肝、腎功能衰竭患者。

1.2 臨床資料的收集

查閱所有入選病例的基線資料：年齡、性別、高血壓、糖尿病、血脂異常、冠心病家族史、吸煙飲酒情況，根據身高和體重計算體重指數。記錄檢驗檢查指標：總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、血肌酐、血尿素氮、空腹血糖、糖化血紅蛋白。詳細記錄冠狀動脈造影情況：包括病變血管支數、分布及其病變程度，犯罪血管情況，并對每個患者的血管病變程度進行Gensini 評分。

1.3 方法及試劑

全部患者抽取靜脈血4 ml，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，離心后分離血細胞和血漿。部分血細胞用于脫氧核糖核酸（DNA）提取，并于-80℃保存。DNA提取采用天根生化科技公司（北京）Blood DNA Extraction Kit試劑盒進行。LTL測定采用寶生物公司（大連）Takara SYBR Green Ⅱ熒光定量試劑盒測定。實驗方法參考文獻［4］，LTL（kb）=1.585×端粒與單拷貝基因比率（T/S比率）+3.582。根據參考文獻［4］，設計引物，并由英濰捷基貿易有限公司（上海）合成。T反應引物：正向引物：5'- GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT GAGGGT-3'，反向引物： 5'-TCCCGACTATCCCTATC CCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3'；S反應引物：正向引物：5'- CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3'，反向引物：5'-CCCATTCTATCATCA ACGGGTACAA-3'。

1.4 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，符合正態分布者采用t檢驗，計數資料用百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。LTL與單項臨床指標的關系采用雙變量相關分析檢驗相關程度，用Spearman相關系數反映相關方向，對年齡、性別因素的調整采用偏相關分析。LTL與多項臨床指標的關系采用多元線性回歸分析，非正態分布的資料取自然對數轉化為正態資料后進行分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者臨床資料和生化指標比較（表1）

早發冠心病組糖尿病、冠心病家族史、吸煙的比例，以及體重指數、谷丙轉氨酶、血尿素氮、空腹血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯、高敏C反應蛋白水平明顯高于非冠心病組（P均＜0.05），而高密度脂蛋白膽固醇水平、總膽固醇、T/S比率、LTL明顯低于非冠心病組（P均＜0.05）。早發冠心病組中急性冠狀動脈綜合征患者的男性比例、Gensini評分均較穩定性冠心病患者高，T/S比率、LTL較穩定性冠心病患者低，差異有統計學意義（P均＜0.05）。

表1 兩組患者臨床資料和生化指標對比（±s）

表1 兩組患者臨床資料和生化指標對比（±s）

注：LTL：白細胞端粒長度；T/S比率：端粒與單拷貝基因比率。與非冠心病組比*P＜0.05；與組內穩定性冠心病患者比△P＜0.05。-：無

項目 非冠心病組（n=128）早發冠心病組全部患者（n=128）急性冠狀動脈綜合征患者 （n=88）年齡 （歲） 48.5±7.3 48.6±7.3 50.0±7.6 47.9±7.1男性 ［例 （%）］ 74 （57.8） 74 （57.8） 12 （30.0） 62 （70.5）△高血壓［例 （%）］ 45 （35.2） 82 （64.1） 24 （60.0） 58 （65.9）糖尿病［例 （%）］ 30 （23.4） 43 （33.6）*12 （30.0） 31 （35.2）冠心病家族史［例 （%）］ 29 （22.7） 48 （37.5）*9 （22.5） 39 （44.3）吸煙［例 （%）］ 37 （28.9） 64 （50.0）*14 （35.0） 50 （56.8）體重指數 （kg/m2） 24.0±3.0 26.2±3.2*26.4±3.2 26.1±3.3谷丙轉氨酶 （U/L） 19.7±9.4 40.7±61.5*28.3±23.5 46.2±71.7血肌酐 （μmol/L） 73.5±11.9 72.2±21.6 65.7±16.6 72.0±22.2血尿素氮 （mmol/L） 4.77±0.98 5.61±2.18*5.61±2.11 5.79±2.22空腹血糖 （mg/dl） 5.15±0.45 6.47±2.26*6.10±2.89 6.26±1.87血紅蛋白 （g/L） 146.38±12.83 139.22±19.28 132.60±13.42 140.55±20.05糖化血紅蛋白 （%） 5.43±0.29 6.86±1.94*6.09±2.55 6.72±2.08總膽固醇 （mmol/L） 4.57±0.56 4.38±1.05*4.63±0.87 4.72±1.09甘油三酯 （mmol/L） 1.10±0.31 1.98±1.29*1.73±1.11 2.03±1.32高密度脂蛋白膽固醇 （mmol/L） 1.40±0.33 1.00±0.21*1.01±0.21 1.00±0.21低密度脂蛋白膽固醇 （mmol/L） 2.87±0.49 2.73±0.77 2.65±0.69 2.75±0.78高敏C反應蛋白 （ng/ml） 0.86±0.66 9.30±22.5*4.38±8.93 10.2±24.2 Gensini評分 （分） - 38.3±29.7 27.6±20.5 43.2±31.9△T/S比率 1.10±0.57 0.88±0.86*0.90±1.18 0.87±0.69△LTL （kb） 5.32±0.91 4.97±1.37*5.00±1.86 4.97±1.09△穩定性冠心病患者（n=40）

2.2 外周血LTL與年齡的相關性（表2、圖1）

早發冠心病組和非冠心病組10年T/S比率變化值差異無統計學意義（-0.17±0.10 vs -0.25±0.07，P=0.63）。除31～40歲年齡段外（P=0.098），早發冠心病組其余年齡段的T/S比率均明顯小于非冠心病組（P均＜0.05）。非冠心病組的T/S比率隨年齡下降呈明顯下降趨勢，而早發冠心病組≤30歲患者的T/S比率介于41～50歲和51～60歲患者之間，同時小于非冠心病組51～60歲患者（P＜0.05）。早發冠心病組及和非冠心病組T/S比率與年齡均呈負相關（r=-0.275，P=0.002；r=-0.316，P=0.000）。

2.3 LTL與臨床指標及冠心病危險因素的Spearman相關性分析（表3）

調整年齡和性別因素后，早發冠心病組LTL與高脂血癥、糖尿病均呈明顯負相關（P＜0.05）。而非冠心病組LTL與高血壓、吸煙均呈明顯負相關（P＜0.05）。

2.4 LTL與臨床指標及冠心病危險因素的多元線性回歸分析（表4）

以T/S比率為因變量多元線性回歸分析，早發冠心病組LTL與年齡呈負相關（P=0.038），與糖尿病呈負相關性不顯著（P=0.090）。非冠心病組LTL與年齡（P=0.000）、吸煙史（P=0.012）、高密度脂蛋白膽固醇（P=0.046）水平呈負相關。

表2 兩組不同年齡段患者T/S比率比較（±s）

表2 兩組不同年齡段患者T/S比率比較（±s）

注：T/S比率：端粒與單拷貝基因比率。與非冠心病組同年齡段比*P＜0.05；與非冠心病組51～60歲比△P＜0.05

年齡 非冠心病組（n=128） 早發冠心病組（n=128）例數 T/S比率 例數 T/S比率≤30歲 2 1.68±0.14 2 0.87±0.08*△31～40歲 14 1.42±0.77 14 1.11±0.96 41～50歲 65 1.14±0.55 65 0.97±0.81*51～60歲 47 0.90±0.48 47 0.69±0.91*

圖1 早發冠心病組和非冠心病組T/S比率與年齡的關系

表3 調整年齡和性別因素后LTL與臨床指標及危險因素的Spearman相關性分析

表4 兩組患者LTL與相關指標及危險因素的多元線性回歸分析

3 討論

近年來，國內外的多項研究表明，外周血LTL縮短與動脈粥樣硬化和冠心病的發病風險相關。端粒作為染色體末端的一種保護結構，與細胞凋亡和衰老相關疾病的發生有密切關系。本研究提示早發冠心病和非冠心病兩組患者特征明顯不同，早發冠心病組糖尿病、冠心病家族史、吸煙比例明顯高于非冠心病組，且與非冠心病組相比，早發冠心病組體重指數、谷丙轉氨酶、血尿素氮、空腹血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯、高敏C反應蛋白水平明顯升高，而高密度脂蛋白膽固醇水平明顯降低。兩組間總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇沒有明顯差異，這可能與一部分早發冠心病組患者就診前已經接受了相應降脂藥物治療有關。

本研究結果顯示早發冠心病組LTL比非冠心病組明顯縮短，這與既往文獻報道結果基本一致［5， 6］。LTL主要取決于兩方面，一是遺傳因素，不同種族、不同個體，以及同一個體的不同組織中LTL都可能存在差別［7， 8］。二是端粒縮短的程度。正常情況下體細胞每傳代1次，端粒縮短30～150 bp［9］。當端粒縮短達到一定閾值時，細胞就會發生衰老和死亡。對早發冠心病和非冠心病組LTL和年齡相關性的分析顯示，兩組患者LTL均隨年齡增長而縮短，這與既往結果一致［6］。本研究顯示兩組患者的LTL與年齡均呈負相關，這可能提示早發冠心病組LTL縮短主要與遺傳因素相關。另外由于部分早發冠心病患者合并高血壓、高脂血癥、糖尿病等基礎疾病，相關的藥物治療可能抑制端粒縮短的加速，因此端粒縮短速度與非冠心病組未產生明顯差異。目前已有實驗證明，在人外周血單個核細胞中，他汀可以通過調節端粒酶活性，從而調節端粒長度［10］。

早發冠心病組≤30歲患者LTL的平均值明顯低于本組31～40歲和41～50歲兩個年齡段LTL的平均值，這可能是由于樣本量小造成的。同時由于這兩年齡段患者LTL值的影響，使得早發冠心病組LTL隨年齡變化的整體趨勢趨于平緩。本研究發現調整年齡和性別因素對LTL的影響后，早發冠心病患者LTL的縮短受到高脂血癥和糖尿病的影響，非冠心病組LTL的縮短主要與高血壓、吸煙相關。多元線性回歸分析則提示早發冠心病患者LTL與年齡呈顯著負相關，與糖尿病具有關聯但并不顯著。非冠心病患者LTL則與年齡、吸煙史、高密度脂蛋白膽固醇水平呈顯著負相關，這與不少前期研究中的結論一致。多項研究發現，2型糖尿病患者的LTL和健康對照相比縮短，且合并2型糖尿病的冠心病患者更短［11， 12］。一項針對中國人群的研究發現，在379例正常對照患者中，端粒更長者比端粒較短者高密度脂蛋白膽固醇水平更低［13］。另一研究發現，高血壓患者較血壓正常者端粒更短，同時發生冠心病風險升高。Flemish研究觀察到吸煙者比不吸煙者端粒更短。與不吸煙人群相比，吸煙1年每天吸1包煙人群相當于端粒DNA額外減少5對堿基［14］。最近發表的一項大規模橫斷面研究結果也說明吸煙與端粒縮短相關［15］。

本研究結果提示，早發冠心病患者的外周血LTL縮短可能作為患病及疾病嚴重程度的預測指標，可以通過進一步擴大樣本量的研究來明確對于端粒長度和早發冠心病的相關性。同時端粒縮短是否誘發細胞凋亡而影響血管內皮細胞、平滑肌細胞等的功能，從而參與早發動脈粥樣硬化的進程值得進一步探索。由于端粒DNA、端粒相關蛋白、端粒酶作為一個整體對于染色體末端起到重要保護作用，端粒相關蛋白的表達水平改變、端粒酶表達水平及活性改變相關的研究可能會揭示早發冠心病的部分發病機制。

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（編輯：王寶茹）

Corresponding Author：ZHANG Shu-yang， Email： shuyangzhang103@163.com

收稿日期：（ 2015-11-23）

基金項目：教育部博導類基金（20131106110007）

作者單位：100730 北京市，中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 心內科 協和轉化醫學中心（田然、張磊楠、黎婧怡、陳連鳳、劉震宇、沈珠軍、曾勇、謝洪智、張抒揚、）；阜外醫院（張婷婷）

作者簡介：田然 主治醫師 博士 主要從事冠心病發病機制的相關研究 Email：ron_tian@163.com 通訊作者：張抒揚 Email：shuyangzhang103@163.com

中圖分類號：R54

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）06-0541-05

doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.06.005

Changes of Peripheral Leukocyte's Telomere Length in Patients of Premature Coronary Artery Disease With Influencing Factors

TIAN Ran， ZHANG Lei-nan， ZHANG Ting-ting， LI Jing-yi， CHEN Lian-feng， LIU Zhen-yu， SHEN Zhu-jun， ZENG Yong，XIE Hong-zhi， ZHANG Shu-yang.
Department of Cardiology， Peking Union Medical College Hospital， CAMS and PUMC， Beijing （100730）， China

Abstract