聚維酮碘溶液對子宮內膜細胞的滅活作用研究

周慧芳 洪 敏 王夢甜 單佳雯 吳建宇 楊立偉 何徐軍

聚維酮碘溶液對子宮內膜細胞的滅活作用研究

周慧芳 洪 敏 王夢甜 單佳雯 吳建宇 楊立偉 何徐軍

目的探尋聚維酮碘溶液快速滅活子宮內膜細胞的最佳有效濃度和作用時間，并對聚維酮碘溶液誘導子宮內膜細胞凋亡作用進行研究。方法不同濃度（0.1％～2.0％）、不同時間（15～90s）的聚維酮碘溶液作用原代培養子宮內膜細胞，采用MTT染色實驗檢測聚維酮碘溶液對子宮內膜細胞的滅活作用，Hoechst33342染色實驗和流式細胞術檢測聚維酮碘溶液對子宮內膜細胞促凋亡作用。結果聚維酮碘溶液對子宮內膜細胞具有明顯的滅活作用，呈濃度依賴和時間依賴，且隨著聚維酮碘溶液濃度的增加，子宮內膜細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。結論聚維酮碘溶液可有效滅活子宮內膜細胞，對預防腹壁子宮內膜異位癥的發生有著重要的臨床應用意義。

聚維酮碘腹壁子宮內膜異位癥子宮內膜細胞凋亡

子宮內膜異位癥是指具有生長活力的子宮內膜組織在子宮腔以外部位異常生長。子宮內膜異位癥常見于育齡婦女,其發病機制尚未闡明，Luciano等[1]提出種植理論,認為子宮內膜異位癥是由經期返流的內膜細胞從輸卵管逃逸后在盆腔周圍組織種植后形成。腹壁子宮內膜異位癥（abdominalwall endometriosis，AWE）是指發生于腹膜表面的異位內膜病灶[2-4]。目前，除了規范剖宮產技術，用常溫0.9％氯化鈉溶液反復沖洗切口是預防AWE最常用的方法，但剖宮產術后AWE的發生還是呈逐年增長趨勢[5-6]。聚乙烯吡咯烷酮和碘絡合形成的聚維酮碘是一種臨床常用的廣譜消毒劑[7-9]。本研究利用聚維酮碘溶液不同濃度和浸泡時間對子宮內膜細胞進行滅活處理，以期能找到聚維酮碘快速滅活子宮內膜細胞的最佳有效濃度和作用時間，并對聚維酮碘溶液誘導子宮內膜細胞凋亡作用進行研究。

1 材料和方法

1.1 材料聚維酮碘溶液購自上海運佳黃浦制藥有限公司；MTT[3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]、Hoechst33342染色液購自江蘇碧云天生物科技有限公司；AnnexinⅤ/PI凋亡試劑盒購自杭州聯科生物科技有限公司。

原代培養的子宮內膜細胞均取自本院產科的擇期剖宮產術產婦。產婦年齡22～35（27±4.5）歲；足月妊娠、恥骨聯合上橫切口。剖宮產術產婦胎盤娩出后刮取子宮內膜，一部分內膜組織投入盛有培養液的無菌瓶中，30min內帶回進行培養。另一部分內膜組織用10％中性甲醛固定后送病理學檢查，經組織學證實為子宮內膜者進行實驗，不符合者舍棄。實驗室取回的標本用D-Hank’s液沖洗3次，剪碎至＜1mm，再置于含0.25％ Trypsin、0.02％膠原酶的消化液中37℃振蕩消化20～30min。加入含20％FBS的RPMI1640培養基終止消化，并用Pasteur吸管反復抽吸、吹打，對細胞群進行機械消化。洗滌后，置入37℃、5％CO2培養箱中培養。標本留取經醫院倫理委員會批準和產婦同意。

1.2 方法

1.2.1 MTT染色檢測細胞增殖收集對數生長期子宮內膜細胞，調整細胞懸液濃度，將細胞以100μl/孔接種于96孔板，使待測細胞密度為1×104/孔。5％CO2、37℃孵育24h后，吸出培養液，分別加入0.1％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％的聚維酮碘溶液100μl，分別作用15、30、45、60和90s，以0.9％氯化鈉溶液作為對照。每孔加入20μl MTT溶液（5mg/ml，即0.5％MTT），繼續培養4h。吸去孔內培養液。每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。用酶聯免疫檢測儀于490nm處測量各孔的吸光值（OD）。細胞存活率=（OD藥物作用孔-OD調零孔）/（OD對照孔-OD調零孔）×100％。

1.2.2 Hoechst33342染色觀察腫瘤細胞的凋亡對數期子宮內膜細胞按3.5×105個/ml接種至6孔板中，貼壁培養24h后，吸出培養液，分別加入0.1％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％的聚維酮碘溶液100μl，分別作用15、30、45、60和90s，以0.9％氯化鈉溶液作為對照。加入10μg/ml的Hoechst33342染料。37℃染色30min后熒光倒置顯微鏡觀察，然后置于共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率對子宮內膜細胞處理與Hoechst33342染色觀察腫瘤細胞的凋亡方法相同，參照AnnexinⅤ/PI細胞凋亡檢測試劑盒操作說明：收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞兩遍，用100μl的1× Binding Buffer重懸細胞，加入5μl的AnnexinⅤ和1μl的PI，冰上避光15min后，加入400μl 1×Binding Buffer，采用流式細胞儀分析。

1.3 統計學處理采用SPSS 11.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 子宮內膜細胞形態圖1為子宮內膜細胞的形態，細胞貼壁狀態良好，呈梭形，證明本研究細胞培養成功。

圖1 子宮內膜細胞形態圖

2.2 不同濃度及時間梯度下聚維酮碘溶液對子宮內膜細胞的抑制作用采用不同濃度的聚維酮碘溶液處理子宮內膜細胞后，MTT實驗表明，聚維酮碘對子宮內膜細胞具有明顯的增殖抑制作用，呈濃度依賴和時間依賴（P＜0.05）。2.0％聚維酮碘溶液的抑制率最高，當作用時間分別為15、30、45、60和90s時，細胞存活率僅為（4.0±1.3）％、（3.2±1.5）％、（1.9±1.8）％、（1.3±2.2）％和（0.2±1.1）％，見圖2。

圖2 MTT實驗檢測子宮內膜細胞存活率

2.3 細胞形態學變化采用不同濃度聚維酮碘溶液處理子宮內膜細胞15s后，子宮內膜細胞生長受到明顯抑制，出現典型的凋亡形態學變化，細胞皺縮、細胞膜出現發泡現象。用Hoechst33342染色子宮內膜細胞，細胞凋亡效應明顯。對照組染色質均勻，無濃縮、邊集現象，熒光顯微鏡下觀察，細胞核染色均一，無明顯亮藍色；而不同濃度聚維酮碘溶液處理組細胞核染色質明顯凝集、固縮，并有核碎裂出現凋亡小體。熒光顯微鏡下觀察，呈現致密濃染或者碎塊狀致密濃染，見圖3（見插頁）。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率采用不同濃度聚維酮碘溶液處理子宮內膜細胞15s后，收集細胞，經AnnexinⅤ/PI雙染后，流式細胞儀檢測細胞凋亡。在AnnexinⅤ高染而PI低染區域的細胞為早期凋亡細胞，在AnnexinⅤ與PI高染區域的細胞為晚期凋亡細胞，結果顯示，隨著聚維酮碘溶液濃度的增加，子宮內膜細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），見圖4-5。

圖4 不同濃度聚維酮碘溶液處理后細胞凋亡率變化（a:對照組；b～f：分別表示經0.1％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％聚維酮碘溶液處理的劑量組）

圖5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率統計圖

3 討論

AWE是一種特殊類型的盆腔外子宮內膜異位癥，雖為一種良性病變，但具有類似惡性腫瘤的生物學特征，如局部侵犯、遠處播散、易復發等[2，10-11]，表現為周期性腹壁切口增大的包塊和經期腹壁切口疼痛，嚴重影響患者的健康和生活質量。趙學英等[12]研究認為醫源性子宮內膜種植是引起AWE的直接原因，剖宮產術中胎兒胎盤的娩出、子宮內膜的大量組織碎片散落并遺留在腹壁切口上，使子宮內膜基質層有更多的醫源性機會黏附在腹壁切口上，導致子宮內膜的種植。因此，剖宮產術中采取有效的措施避免子宮內膜組織散落和遺留在腹壁切口是預防本病的關鍵。目前，剖宮產術后AWE的發生還是呈逐年增長趨勢，因此，尋找一種便捷、有效、安全的沖洗方法以清除遺留在手術切口的子宮內膜組織，控制醫源性子宮內膜種植，對預防AWE的發生有著重要的意義。

聚維酮碘是目前臨床上常用的一種化學消毒劑。有研究報道聚維酮碘對預防腫瘤細胞轉移有一定的效果[8，13]，黃惠等[14]研究發現聚維酮碘對肺癌腫瘤細胞有明顯的抑制效果,李俊等[15]研究了聚維酮碘對人角膜內皮細胞的影響。對于聚維酮碘對細胞的殺傷機制，有研究證明“游離碘”可在短時間內對有機體內細胞蛋白產生不可逆轉的凝固作用[16]。本研究結果表明，2.0％聚維酮碘溶液抑制子宮內膜細胞效率最高，當作用時間分別為15、30、45、60和90s時，細胞存活率僅為（4.0±1.3）％、（3.2±1.5）％、（1.9±1.8）％、（1.3±2.2）％和（0.2±1.1）％，考慮到聚維酮碘溶液沖洗切口的便利性，以2.0％濃度、15s作用時間的聚維酮碘溶液對子宮內膜細胞的抑制最高，為最佳實驗條件。

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ObjectiveTo investigate the effec t of povidone-iodine at different concentration on the grow th of human endometrial cells.MethodsPrimary cultured endometrial cells were treated w ith d ifferent concentrations(0.1％-2.0％)of povidone-iod ine atdifferent time(15-90s),respectively.The viability,morphologicalchanges,and apop tosis ofendometrialcells were assessed by MTT assay,Hoechst33342 staining,and Annexin V/PI flow cytometry,respec tively.ResultsThe results indicated thatpovidone-iod ine remarkab ly inhibited endometrialcells g row th ata dose-dependentand time-dependentmanner (P＜0.05).ConclusionPovidone-iod ine solution can effec tively inactivate endometrial cells,which may potential c linicaluse in p revention ofendometriosis.

Povidone-iod ine Abdom inalwallendometriosis Endometrialcells Apop tosis

2016-08-14）

（本文編輯：陳麗）

浙江省醫藥衛生科技項目(2014KYB033)

310014杭州，浙江省人民醫院手術室（周慧芳、洪敏、王夢甜、單佳雯），病理科（吳建宇），婦產科（楊立偉），臨床醫學研究所（何徐軍）

周慧芳，E-mail：zhouhuifang818@126.com