篩選GPAT基因的酵母遺傳互補體系的優化

陳丹丹 劉宏波

摘要：3-磷酸甘油酰基轉移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）是甘油脂生物合成途徑中催化第1步酰化反應的關鍵酶，參與生物體的不同代謝途徑，發揮著不同的生理功能。本研究對已構建的GPAT基因酵母遺傳互補篩選體系進行優化，通過替換酵母表達載體pYES2-Kan-yADH1 v1中ADH1啟動子，增強目的基因的表達;同時，在酵母遺傳轉化后對菌株進行復蘇培養，提高遺傳轉化效率，增加陽性菌落數目。該體系的優化將進一步提高GPAT酶的篩選效率。

關鍵詞：3-磷酸甘油酰基轉移酶;啟動子;酵母;遺傳互補

中圖分類號： Q344+.13;S188 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0064-03

三酰甘油（triacylglyceride，TAG）是植物油脂的主要儲存形式，其從頭合成途徑受3-磷酸甘油酰基轉移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）的催化，即將酰基輔酶A或酰基-ACP的酰基部分轉移到3-磷酸甘油的sn-1位生成溶血磷脂酸[1]，這是甘油脂從頭合成途徑中的第1步限速反應。因此，GPAT酶在細胞的基礎代謝、植物的生長發育及油料作物的產量和品質改良等方面具有重要作用[1-3]。然而，迄今為止，植物中究竟有多少不同的基因編碼線粒體和細胞質中的GPAT酶還不清楚，主要原因是缺乏有效分離和鑒定GPAT基因的手段。目前研究者常用的GPAT酶分析手段有2種，一種是利用放射性同位素標記的3-磷酸甘油來體外測定酶活性[4]，但這種方法操作不便，且不適用于GPAT基因的大規模研究;另一種是利用甘油營養缺陷型Escherichia coli plsB突變體的遺傳互補來研究原核生物的GPAT酶[5-6]，然而該方法并不適用于真核生物的GPAT酶的篩選。雷潔等根據高等和低等真核生物中甘油脂合成中第1步酰化反應的高度保守性建立了一套可快速有效地大規模篩選真核生物GPAT基因的酵母遺傳互補體系，該體系是基于在組成型ADH1啟動子下外源候選GPAT基因的表達可以恢復gat1/gat2雙敲除酵母菌株在葡萄糖培養基中的生長缺陷所建立的[7]。

乙醇脫氫酶Ⅰ的酵母ADH1啟動子全長約1 500 bp，該片段中的上游啟動子元件激活后，酵母的乙醇脫氫酶ADH1基因會轉錄成一段較長的mRNA，同時由于存在多個起始和終止密碼子，導致ADH1酶無法正常翻譯，這被認為是一個下調機制[8]。研究發現，不同長度的ADH1啟動子的活性有所不同，截斷的ADH1啟動子具有組成型活性[9]，如Ruohonen等發現在解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶代謝中，酵母的乙醇脫氫酶ADH1p將乙醛還原成乙醇[10]，當ADH1啟動子序列上游的1 100 bp（-414～-1 500 bp）去除之后，短的啟動子只在乙醇產生后期有活性[11]，將上游的300 bp（-414～-700 bp）保留后，在整個乙醇產生階段都有ADH1啟動子的活性[12]。Santangelo等發現，ADH1啟動子的活性與啟動子上-664～-652 bp的UAS保守序列有關[13]，該順式作用元件與上游轉錄因子結合來激活轉錄。

為了提高GPAT基因的篩選效率，本研究對該酵母遺傳互補體系進行優化。本試驗在Lei等用的397 bp（-670～-1 066 bp）ADH1啟動子的基礎上[7]，繼續延長上游307 bp（-363～-669 bp）的序列，得到長度為 704 bp 的ADH1啟動子序列，以At5g06090基因作為參考基因比較2種啟動子對基因表達的影響;同時，在酵母遺傳轉化時對酵母雙突變體轉化菌株進行復蘇培養，以期提高外源GPAT基因的表達和篩選效率。

1 材料與方法

1.1 704 bp ADH1啟動子的PCR擴增

采用玻璃珠法提取野生型酵母菌株BY4742的基因組DNA，根據GenBank報道的ADH1啟動子序列，以表1所示引物FP1和RP1進行第1次擴增，以表1所示含酶切位點的引物FP2和RP2進行第2次擴增。

1.2 重組酵母表達載體的構建

以Lei等構建的yADH1-Kan-pYES2 v1質粒為骨架[7]，用限制性內切酶SpeⅠ分別對載體和回收純化后的第2次PCR產物酶切2 h，膠回收酶切產物及載體去磷酸化后，將ADH1啟動子片段和yADH1-Kan-pYES2 v1質粒載體在 16 ℃ 下連接過夜。

取2 μL連接產物轉化50 μL大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂于具有氨芐抗性的LB固體培養基上培養過夜。在含有轉化子的平板上隨機挑取6個單菌落，在含有氨芐抗性的LB液體培養基擴繁培養后經菌液PCR驗證并測序，引物FP1和RP3見表1。將含有704 bp ADH1啟動子的重組質粒命名為yADH1-Kan-pYES2 v2。

以At5g06090-YEplac181質粒為模板，擴增At5g06090基因，引物見表1，之后進行BglⅡ和XhoⅠ雙酶切，yADH1-Kan-pYES2 v2重組質粒進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產物回收后在16 ℃下連接過夜，轉化DH5α感受態細胞，涂于具有氨芐抗性的LB固體培養基上培養過夜;提取陽性單克隆的質粒，經BamHⅠ和SpeⅠ進行雙酶切驗證。

1.3 2種ADH1啟動子對目的基因表達的效果比較

通過LiAc法把2種重組質粒導入Lei等構建的酵母菌株ZAFU1中[7]，以空載體為陰性對照。在涂板前，對含有2種重組質粒的酵母雙突變體均作復蘇和不復蘇培養，復蘇即將涂板前的菌體在含2%葡萄糖和全氨基酸的液體培養基中培養4 h，最后都在含2%葡萄糖和2%半乳糖的酵母氨基酸缺陷型合成固體培養基[SC/-ura（尿嘧啶）-his（組氨酸）-leu（亮氨酸）]固體培養基中培養3 d，觀察菌落的生長狀況，對菌落進行計數。

隨后，利用濃度梯度稀釋試驗（初始D600 nm為1），即用液體培養基培養半乳糖和葡萄糖培養基上生長的菌落，再依次稀釋5倍，分別點在含半乳糖或葡萄糖的SC/-ura-his-leu固體培養基中進行培養，比較不同長度啟動子以及轉化后培養條件對外源基因表達的影響和互補效果。

1.4 驗證ZAFU1中的At5g06090基因

分別提取轉化后復蘇與未復蘇培養的葡萄糖培養基上的酵母雙突變體的基因組DNA和酵母表達質粒的混合物，進行PCR驗證，引物FP3和RP3見表1。

2 結果與分析

2.1 704 bp ADH1啟動子的獲得

以提取的野生型酵母基因組DNA為模板，將擴增得到的704 bp的ADH1啟動子序列替換yADH1-Kan-pYES2 v1上的397 bp的序列，經菌落PCR擴增出1條大小為848 bp的條帶，結果見圖1。

2.2 At5g06090-yADH1-Kan-pYES2 v2載體的雙酶切鑒定

由圖2可見，經限制性內切酶BamHⅠ和SpeⅠ雙酶切后，經瓊脂糖凝膠電泳顯示，重組質粒在6.8 kb（載體片段位置）出現1條相應的條帶，在200、1 500 bp左右（目的片段位置）各出現1條條帶，說明At5g06090基因已經插入到yADH1-

Kan-pYES2 v2質粒中。

2.3 2種ADH1啟動子對目的基因表達的效果比較

將2種重組質粒及對照質粒轉化ZAFU1，統計培養3 d后不同培養基上生長的菌落數，結果見表2。將半乳糖和葡萄糖上的單個菌落按1 ∶ 5稀釋，涂布在含半乳糖或葡萄糖的SC/-ura-his-leu固體培養基中，菌落生長情況見圖3。替換后的啟動子及復蘇培養可以增加菌落數，初步說明At5g06090基因在704 bp啟動子的作用下能夠增強目的基因的表達。

2.4 驗證ZAFU1中的At5g06090基因

提取在葡萄糖培養基中生長的酵母表達質粒和基因組DNA的混合物，經PCR可擴增出1條包含At5g06090基因的1 726 bp的條帶，說明重組質粒存在于酵母雙突變體中，結果見圖4。

3 討論與結論

利用酵母異源互補的方法研究目的基因的功能，已成為研究人員常用的生物學研究手段，如利用酵母異源互補研究鐵、鋅等離子轉運蛋白的功能[14]。本研究的酵母遺傳互補體系是利用gat1/gat2缺陷型酵母菌株在葡萄糖上的生長依賴于外源GPAT基因的表達所建立的，而外源基因的表達受ADH1啟動子的控制，有文獻報道ADH1啟動子的5′末端區域有類似于轉錄起始位點和調節蛋白ADR1結合位點的序列[15]，這些序列元件決定啟動子的作用。本研究將啟動子的長度延長至704 bp，利用At5g06090基因驗證發現替換后的啟動子確實能夠增強目的基因的表達，復蘇后也可以增加葡萄糖培養基上的菌落數，可能在復蘇時，全營養培養基能夠為活性不太高的菌株提供營養，使其恢復到正常生長狀態。但基因的表達水平不僅取決于啟動子[16-19]，還與基因的拷貝數相關[20]，在轉化中，雖然總質粒數是相同的，但每個酵母單細胞所含有的質粒數是不可控制的，從表型上看，替換后的啟動子可以增強目的基因的表達，這與文獻報道一致，但仍需要進行基因的表達量分析來進一步驗證候選GPAT基因的遺傳互補功能。

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