UPLC-MS/MS法測定動物源性食品中16種非甾體消炎藥殘留量

方志娟 李曉芹 丁洪流 何新葉 金萍 王偉

摘要 [目的]建立超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）定量檢測動物源性食品中16種非甾體消炎類獸藥殘留量的方法。[方法]樣品用甲酸-水-乙腈混合溶液提取，凈化后經C18色譜柱分離，UPLC-MS/MS法測定。[結果]樣品由基質匹配標準曲線進行定量，所檢測的16種非甾體消炎藥在1～200 ng/g線性關系良好（R2>0.995）。分別添加1倍定量限、2倍定量限和10倍定量限3個水平的混合標準溶液進行回收率試驗，各個濃度水平加標回收率在70%～105%，相對標準偏差（RSD）均在15%以下（n=6）。[結論]該方法簡便、穩定、準確，具有良好的重現性，適用于測定動物源性食品中16種非甾體消炎類獸藥殘留量。

關鍵詞 超高效液相色譜-串聯質譜法;非甾體消炎類藥;動物源性食品;獸藥殘留

中圖分類號 TS 207? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）21-0211-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.054

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Determination of 16 Non-steroidal Anti-inflammatory Veterinary Drugs Residues in Animal-origin Foods by UPLC-MS/MS

FANG Zhi-juan? LI Xiao-qin? DING Hong-liu2 et al

（1.Suzhou Institute for Food Control， Suzhou，Jiangsu 215104;2. Suzhou Institute of Product Quality Supervision and Inspection， Suzhou，Jiangsu 215104）

Abstract [Objective]To establish a method for the quantitative determination of 16 non-steroidal anti-inflammatory drugs （NSAIDs） in animal-origin foods by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. [Method]The samples were extracted with a mixture of formic acid-water-acetonitrile. After purification， the samples were separated by C18 column and quantitatively detected by UPLC-MS/MS. [Result]The samples were quantified by matrix matching standard curves. The 16 NSAIDs had good linear relationships in the range of 10-200 ng/mL （R2 >0.995）. The mixed standard solutions of?? 2 and 10 times of the limits of quantification （LOQ） were added respectively for the recovery experiments，the recovery rates of each concentration level were 70%-105%， and the relative standard deviation （RSD） were all less than 15%（n=6）. [Conclusion]The method is simple， stable， accurate and reproducible. It is suitable for the determination of 16 NSAIDs in animal-origin foods.

Key words Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; Non-steroidal anti-inflammatory drugs （NSAIDs）;Animal-origin foods;Veterinary drug residue

基金項目 蘇州市科技計劃項目（SS2019039，SS202038）。

作者簡介 方志娟（1987—），女，江蘇南通人，工程師，碩士，從事食品檢測與質量管理工作。*通信作者，工程師，碩士，從事食品安全檢測與分析工作。

收稿日期 2021-06-23

近年來，獸藥在養殖和畜牧業中使用的越來越廣泛。動物源性食品中的獸藥殘留一方面會限制養殖和畜牧業的健康發展，另一方面，隨著動物體內獸藥的積累和對外排泄量的增多，會對生態環境造成嚴重影響，進一步還會對人類食品安全以及身體健康造成威脅[1]。非甾體類消炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）具有抗炎、退熱、止痛、抗風濕、抗凝效果[2]，臨床上主要用于風濕性疾病、心血管疾病、腫瘤類疾病和慢性疼痛等。每天全球約有3 000萬人使用，每年的處方量達5億，消耗量僅次于抗生素[3-4]。在獸藥領域主要用于豬、牛、羊等動物感染性疾病引起的發熱及急性炎癥反應，其在動物源性食品中的過量殘留會導致食用者發生高血壓、心肌梗死、心力衰竭和心律失常等疾病[5-6]。

由于頻繁大量的使用、人與動物的排泄、污水處理技術的局限性以及廢棄藥物的不合理處置等因素，未被完全吸收和利用的NSAIDs及其代謝物以多種途徑最終進入水環境，在地表水環境中頻頻檢出。環境污染帶來的危害不容小覷，雖然其在水環境中的殘留濃度很低只有微量級別，但是因其有源源不斷的輸入源頭，導致其會給水環境中非靶向水產品帶來潛在環境風險，甚至通過食物鏈和食物網影響人類健康。許多國家和地區規定了非甾體類藥物的最大殘留量。Izadi等[7]提出NSAIDs作為環境中被識別的新興污染物，引發了環境研究人員的關注，需要對其檢測技術方面進行廣泛的研究。Marmon等[8]對NSAIDs混合物在環境中對魚類構成的風險進行藥理學信息預測，認為長期接觸這些化合物可能會對魚類種群造成不可忽視的影響。NSAIDs在我國還未引起重視，現有關于NSAIDs的研究文獻多集中在臨床和環境領域，作為常用獸藥和水體中的污染物，水產品中NSAIDs相關的暴露研究很少。食用農產品的抽檢未見到NSAIDs藥物，相關的限量指標也不全面[9]，缺少相關動物源性食品中NSAIDs問題率的數據，為食品安全監管埋下了隱患，亟待建立有效的動物源性食品中NSAIDs的檢測方法。

液相色譜串聯質譜技術結合了色譜和質譜的優點，將色譜的高分離能力和質譜的高選擇性、高靈敏度完美結合，是近些年來水、土、動物源性食品等基質中多類獸藥殘留快速測定的首選方法[10-17]。該研究建立同時檢測動物源性食品中氟滅酸、茚酮苯丙酸、雙水楊酸酯、卡洛芬、酮基布洛芬、托滅酸、美洛昔康、氟尼辛、甲滅酸、雙氯芬酸、吡羅昔康、萘丁美酮、舒林酸、托麥汀、吲哚美辛、替諾昔康16種NSAIDs的高效液相色譜-串聯質譜方法，對前處理過程中樣品提取溶劑中乙腈和甲酸比例進行優化，并考察凈化后的基質效應，確定基質加標法消除基質效應對定量結果的影響，以期為健全食品檢驗檢測體系、強化食品安全監管、保障人民群眾舌尖上的安全提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（質譜級，德國默克公司）;甲酸（色譜純，美國TEDIA天地公司）;乙腈（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）;試驗中水為實驗室自制一級水。16種非甾體消炎藥混標（天津阿爾塔科技有限公司）。Cleanert LipoNo 15 mL萃取管（博納艾杰爾科技公司）。豬肉和雞蛋等樣品為蘇州農貿市場上隨機購買。

1.2 儀器與設備

Waters UPLC I-Class QTRAP 6500+超高效液相色譜-線性離子阱-三重四級桿質譜儀，配電噴霧離子源（美國AB SCIEX公司）;RiOsTM超純水儀（美國密理博公司）;N-EVAP氮吹儀（美國Organomation公司）;數顯型渦旋混合儀（德國IKA公司）;Allegra X-30R高速冷凍離心機（美國貝克曼公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制。

準確移取100 μg/mL混合標準溶液1 mL，用甲醇定容至10 mL，配制成10 μg/mL混合標準儲備液，存儲于棕色儲液瓶中，在-18 ℃保存。移取適量混合標準儲備液，用甲醇定容，配制成100 ng/mL的混合標準工作溶液，現配現用。

1.3.2 樣品前處理。

準確稱取均質后的試樣2 g（精確至0.01 g），至50 mL帶蓋塑料離心管中，加入10 mL 0.5%甲酸-90%乙腈混合溶液，渦旋混勻1 min，超聲2 min。在8 000 r/min的轉速下離心3 min后，取3 mL上清液加入萃取管振搖1 min，在10 000 r/min的轉速下離心5 min。取上清液2 mL，氮吹至近干，用初始流動相定容至0.5 mL后，供UPLC-MS/MS分析。需同時進行空白試驗。

1.3.3 基質加標標準工作曲線。

稱取與試樣基質相應的陰性樣品（精確至0.01 g），加入適量的混合標準工作溶液，按照“1.3.2”方法，與試樣一起進行提取和凈化。

1.3.4 色譜條件。

色譜柱為Kinetex F5 1.7 μm 100 ，100 mm×2.1 mm;柱溫40 ℃，進樣體積5 μL，流速0.40 mL/min。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫條件見表1。

1.3.5 質譜條件。

電噴霧離子源正模式（ESI+），分段多反應監測（MRM）采集，掃描窗口60 s。霧化電壓5 500 V（正），-4 500 V（負）;氣簾氣206.8 kPa;離子源溫度500 ℃;霧化氣344.7 kPa;輔助加熱氣413.7 kPa。

16種非甾體消炎藥各化合物的信息及保留時間（RT）、離子對（Q1/Q3）、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等質譜參數見表2。

2 結果與分析

2.1 儀器參數優化

質譜條件中的碰撞能量對離子豐度具有較大影響，對方法靈敏度有決定性作用。碰撞能量過高時，由母離子生成的碎片過多，子離子響應過低;碰撞能量過低時，不能生成所需的子離子[18]。該試驗通過針泵將標液注入離子源進行分析，得到母離子，同時優化去簇電壓。對母離子進行二級質譜掃描，得到碎片離子信息，選取2～3個響應較高且穩定的特征性子離子，同時優化碰撞能量。優化離子源溫度、霧化電壓、霧化氣、氣簾氣、輔助加熱氣等條件，選取合適的質譜條件。

采用0.1%甲酸水-乙腈體系，以0.4 mL/min的流速梯度洗脫。優化流動相梯度，使16種化合物的保留時間盡量分散。16種非甾體消炎藥MRM模式下總離子流如圖1所示。

2.2 樣品提取方法優化

乙腈是獸藥殘留檢測中最常用的提取溶劑，能夠提取出大多數的藥物，同時引入更少的雜質[19]。該試驗研究了前處理中不同乙腈∶水的比例（體積比）和不同甲酸含量對豬肉和雞蛋樣品中非甾體消炎藥回收率的影響。試驗分為2組，第1組提取溶劑中甲酸含量固定為0.1%，乙腈含量分別設定為70%、80%、90%，相應的回收率情況見圖2;第2組提取溶劑中乙腈∶水溶液體積比固定不變為8∶ 甲酸含量分別設定為0.1%、0.2%、0.5%，相應的回收率情況見圖3。

從圖2、3可以看出，無論是豬肉還是雞蛋樣品中絕大多數非甾體消炎藥在提取溶劑中乙腈∶水的比例（體積比）為9∶1時，回收率相對較高。可能是因為水相占比過高時，提取液容易混入更多的雜質，不利于凈化。另外，豬肉樣品中絕大多數非甾體消炎藥選用0.1%甲酸前處理回收率相對更高;雞蛋樣品中絕大多數非甾體消炎藥選用0.5%甲酸前處理回收率相對更高。因此建議豬肉樣品選用0.1%甲酸-90%乙腈溶液進行提取，雞蛋樣品選用0.5%甲酸-90%乙腈溶液進行提取。

2.3 基質效應

基質效應普遍存在于質譜檢測中。消除基質效應的方法比較多，如充分凈化樣品、用基質匹配標準曲線[20-21]、用同位素做內標校正[22]、加入分析保護劑[23]等。該試驗通過對豬肉和雞蛋的空白基質匹配標準曲線與純溶劑曲線進行比較分析，發現經過該試驗方法前處理后，依然存在基質效應，尤其對氟尼辛、甲滅酸、萘丁美酮的影響較大。因此，該試驗最終采用基質匹配標準曲線進行定量，即分別在豬肉和雞蛋的空白基質中，添加一定濃度的標準溶液，經過前處理后進行測定，以此來消除基質效應對結果的影響。

2.4 方法學驗證

以各目標物的定量離子的響應值為縱坐標（Y）、質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，得到線性回歸方程如表3所示。結果表明，16種非甾體消炎藥在1～200 ng/mL線性關系良好（R2>0.995）。

在豬肉和雞蛋中分別添加1倍定量限（2.0 μg/kg）、2倍定量限（4.0 μg/kg）和10倍定量限（20.0 μg/kg）3個水平的混合標準溶液進行回收率試驗，每個添加水平進行6次平行測定，具體見表3。結果表明，加標回收率在70%～105%，相對標準偏差（RSD）均在15%以下。

2.5 實際樣品的測定

該試驗從蘇州農貿市場上購買了15批豬肉和15批雞蛋樣品，并用所建立的方法進行了檢測，結果顯示16種非甾體消炎藥獸藥殘留全為未檢出。接下來將擴大樣本量，尤其是對水產類樣品進行進一步篩查。除豬肉、雞蛋樣品中，該試驗同時在魚肉、蝦肉和牛奶樣品中進行加標，獲得了較穩定的回收率。

3 結論與討論

該研究通過對質譜條件、提取溶劑濃度等因素進行優化，采用基質匹配標準曲線減弱基質效應，建立了UPLC-MS/MS定量檢測動物源性食品中16種非甾體消炎藥殘留量的方法。該方法前處理簡單，具有較好的重現性、穩定性和準確度，為動物源性食品中16種非甾體消炎類獸藥殘留的檢測提供了可靠的技術支持。

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