“分子生物學(xué)”實驗課程教學(xué)改革探索

牛曉磊 馮世鵬 蔣凌雁 王倩男 陳銀華

[摘 要] 分子生物學(xué)相關(guān)知識與實驗技術(shù)是生物類相關(guān)專業(yè)學(xué)生應(yīng)該掌握的基本知識及技術(shù)，在學(xué)生今后的學(xué)習(xí)或工作中占據(jù)極其重要的地位。通過探討分子生物學(xué)實驗課程教學(xué)過程及教學(xué)評價方式，以學(xué)生動手實驗過程中遇到的問題為導(dǎo)向進(jìn)行改革探索，從而提高學(xué)生的實驗動手操作能力及分析和解決實驗中問題能力，并改革實驗課程的評價方式，為今后高等院校分子生物學(xué)實驗教學(xué)提供參考。

[關(guān)鍵詞] 分子生物學(xué)實驗課程;教學(xué)改革;問題導(dǎo)向

[基金項目] 2019年度海南省高等學(xué)校教育教學(xué)改革研究項目“分子生物學(xué)課程教學(xué)內(nèi)容及實驗體系整體優(yōu)化”（Hnjg2019ZD-2）;2019年度海南大學(xué)教育教學(xué)改革研究項目“分子生物學(xué)課程教學(xué)內(nèi)容及實驗體系整體優(yōu)化”（hdjy1926）;2020年度教育部新農(nóng)科研究與改革實踐項目“熱帶新農(nóng)科多樣化人才培養(yǎng)體系研究與實踐”（NDE2020-20）（教高廳函〔2020〕20號）

[作者簡介] 牛曉磊（1979—），男，河南安陽人，博士，海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院副教授，主要從事熱帶作物遺傳育種研究;馮世鵬（1980—），男，湖北孝感人，博士，海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院副教授，主要從事熱帶作物遺傳育種研究;蔣凌雁（1989—），女，湖南長沙人，博士，海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院副教授，主要從事熱帶作物與病原菌互作研究。

[中圖分類號] G642.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-9324（2022）15-0097-04 [收稿日期] 2021-09-27

“分子生物學(xué)”是生物科學(xué)、生物技術(shù)專業(yè)的核心主干課程，在其他生物相關(guān)專業(yè)有類似的課程如“基因克隆”“生物技術(shù)概論”等選修課。因此，分子生物學(xué)相關(guān)理論與技術(shù)是生物類相關(guān)專業(yè)學(xué)生重點學(xué)習(xí)內(nèi)容之一。而分子生物學(xué)實驗既能鍛煉學(xué)生的動手能力，又能加深學(xué)生對理論知識的掌握程度。分子生物學(xué)實驗教學(xué)模式與教學(xué)方法的改革是目前分子生物學(xué)教學(xué)改革的重點[1]。

海南大學(xué)“分子生物學(xué)”課程選擇的教材是朱玉賢主編的《現(xiàn)代分子生物學(xué)》[2]，實驗內(nèi)容是根據(jù)《分子克隆實驗指南》[3]選編的內(nèi)容。分子生物學(xué)及其實驗的教學(xué)改革在不同地區(qū)均有一些嘗試，在教材選擇、教師配制、翻轉(zhuǎn)課堂、雙語教學(xué)、案例教學(xué)等方面均有應(yīng)用，并取得了一定的成效[4]。目前的分子生物學(xué)實驗課程，多數(shù)的流程仍然是教師講解，包括實驗原理、材料方法、實驗步驟、注意事項等;學(xué)生聽完后進(jìn)行實驗操作，主要是根據(jù)老師的講解機(jī)械模仿。然而筆者在長期的教學(xué)實踐過程中發(fā)現(xiàn)，雖然實驗前對實驗內(nèi)容進(jìn)行了詳細(xì)講解，然而大多數(shù)學(xué)生對相關(guān)分子生物學(xué)的實驗原理缺乏了解，實驗操作照葫蘆畫瓢的機(jī)械模仿較多，對老師的實驗設(shè)計不理解，實驗過程中出現(xiàn)的現(xiàn)象無法解釋，既不知道實驗為什么成功，也不知道實驗為什么失敗。這就如同小朋友走路，無論告訴他們多少走路方法、注意事項，他自己走路的時候還是會摔跤;而他自己在走路的過程中，摸爬滾打，無意識中總結(jié)經(jīng)驗教訓(xùn)，終于學(xué)會了走路。有鑒于此，筆者設(shè)計了一套以問題為導(dǎo)向的分子生物學(xué)實驗教學(xué)改革方案，發(fā)現(xiàn)效果很好。

一、改革內(nèi)容

改革內(nèi)容主要包括兩方面：一是改革實驗教學(xué)過程;二是改革學(xué)生成績評價方法。教學(xué)過程的改革措施主要包括如下幾方面。

（一）教學(xué)時間控制

實驗教學(xué)一般安排在上午或者下午，總時長約3～4節(jié)課，為了充分利用實驗課堂時間，要求學(xué)生必須課前預(yù)習(xí)實驗內(nèi)容，并設(shè)計實驗過程;課堂上進(jìn)行實驗操作及失敗后的重復(fù)實驗操作;實驗中間或?qū)嶒炦^程中遇到問題隨時與教師進(jìn)行探討;實驗課后進(jìn)行總結(jié)報告。

（二）制造問題

有兩方面的問題：一是學(xué)生自己制造的問題，二是老師針對性地提出的問題。先讓學(xué)生根據(jù)本次課程的實驗內(nèi)容自己設(shè)計實驗整個流程，然后直接進(jìn)行實驗操作，但由于學(xué)生缺乏知識及經(jīng)驗，實驗過程中必然出現(xiàn)許多問題。至于老師提出的問題，主要是根據(jù)學(xué)生實驗的進(jìn)展情況與對實驗所用到的知識的理解，針對性地提出一些問題。

（三）分析原因

學(xué)生實驗過程中產(chǎn)生的問題實際上激發(fā)了學(xué)生的自主學(xué)習(xí)欲望，學(xué)生在自己的實驗中碰到問題時，會迫切地想知道為什么會產(chǎn)生這樣的結(jié)果，以及怎樣避免或者解決，怎么進(jìn)行下一步等。學(xué)生在這個過程中會進(jìn)行自我思考，此時老師與學(xué)生一起分析原因，通過此過程實際上教師將實驗原理及實驗注意事項等知識傳授給了學(xué)生，這比實驗前填鴨式的講解效果好很多。

（四）設(shè)計實驗

出現(xiàn)了問題，分析了問題可能的原因，接下來就是跟著學(xué)生一起設(shè)計實驗，對可能的原因進(jìn)行驗證。此時給學(xué)生講授如何設(shè)計實驗，為什么要這樣設(shè)計，學(xué)生更能理解實驗設(shè)計的過程及原理。

（五）解決問題

根據(jù)實驗設(shè)計方案再次進(jìn)行實驗，這個過程一般能全部或者至少部分解決之前的問題;有時候也可能產(chǎn)生新的問題。無論是之前未解決的問題還是新產(chǎn)生的問題，再次回到第二步，依次進(jìn)行分析原因—設(shè)計實驗—再次驗證等步驟。如此往復(fù)，學(xué)生學(xué)到了相關(guān)知識與技術(shù)，同時掌握了分析問題、解決問題的能力。

對于學(xué)生成績的評價方法，之前主要是以期末考試或者實驗報告成績?yōu)橹饕罁?jù)進(jìn)行評價，筆者改為實驗報告和實驗總結(jié)，將學(xué)生的實驗操作能力、分析問題和解決問題的能力在最終成績上體現(xiàn)出來。

二、實例分析

分子生物學(xué)實驗課共設(shè)計了8個子實驗：RNA抽提、核酸電泳、cDNA合成、PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物回收、載體連接轉(zhuǎn)化、陽性克隆鑒定、質(zhì)粒抽提及酶切鑒定。這8個實驗基本涵蓋了基因克隆全過程。掌握了該過程就基本掌握了分子生物學(xué)最基本的實驗操作技術(shù)，對于再學(xué)習(xí)其他分子操作技術(shù)來說會相對容易。將實驗中遇到的典型問題進(jìn)行舉例說明。

（一）RNA抽提

該過程研缽的處理事先由課程教輔教師代為處理好;RNA抽提試劑盒是新購入且未開封，且已經(jīng)過本實驗室研究生使用證明試劑盒可用;研磨過程需要液氮，有一定的危險性，提前告知他們液氮使用注意事項。在此基礎(chǔ)上，學(xué)生根據(jù)提供的RNA抽提試劑盒的說明書，設(shè)計實驗步驟，并完成了第一次抽提實驗。所抽提的RNA電泳結(jié)果（圖 1A）顯示在最上面有一條帶，下面有一條長的拖尾，這個結(jié)果與之前理論課告訴學(xué)生總RNA的電泳帶形完全不同。問題產(chǎn)生了：為什么這樣？這些帶是什么？哪里出問題了？這個RNA能用嗎？下一步怎么辦？……

A：第一次RNA抽提電泳圖;B：第二次RNA抽提電泳圖;C：第一次PCR產(chǎn)物電泳;D：第二次PCR產(chǎn)物電泳;泳道1：DL2000markers;泳道2、3：兩個重復(fù)樣抽提RNA;泳道4、7、10：DL5000markers;泳道5、6：兩個重復(fù)樣抽提RNA;泳道8、9：兩個重復(fù)樣抽提RNA后的RT-PCR擴(kuò)增Actin基因;泳道11：基因A PCR產(chǎn)物;泳道12：基因A陰性對照;泳道13：基因B PCR產(chǎn)物;泳道14：基因B陰性對照;泳道15：Actin基因PCR產(chǎn)物;泳道16：Actin基因陰性對照。

分析問題：首先，marker是DL2000，共6條帶，最小100bp，最大2000bp，最亮的帶是750bp，這些條帶是清晰完整的（圖1A，泳道1），因此電泳相關(guān)試劑及電泳過程是沒問題的;上樣緩沖液的藍(lán)色染料，肉眼可見，可監(jiān)測電泳進(jìn)度，該染料仍在膠上，證明無條帶跑出膠;EB熒光染料與核酸結(jié)合后在紫外光激發(fā)可發(fā)射熒光從而查看核酸帶形;RNA電泳應(yīng)該看到的帶從大至小應(yīng)該是28S（約1600bp，最亮）、18S（約800bp）、5S（約100bp，暗或無），而學(xué)生的電泳圖最大的帶位置已經(jīng)超過2000bp，很明顯該條帶是基因組，下面的拖尾是總RNA降解后的一系列片段。因此，抽提的核酸包括DNA、RNA，但RNA容易降解。那么哪里出問題了？讓學(xué)生回想一下操作過程，口罩、手套使用合規(guī)嗎？所有接觸樣品的試劑耗材有去RNAase處理嗎？這些問題只能學(xué)生自己找答案，學(xué)生總結(jié)原因：一是操作不熟練，可能有些細(xì)節(jié)沒注意;二是圍觀的人多，且有交談，可能是唾液中的RNase影響。這個RNA能用嗎？如果是進(jìn)行RNA定量檢測是沒有完全必要的;因為本次實驗是進(jìn)行基因克隆，目標(biāo)基因未完全降解就可用。下一步怎么辦？兩手準(zhǔn)備，一是將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行目標(biāo)基因擴(kuò)增;二是根據(jù)自己總結(jié)的問題，重新設(shè)計方案進(jìn)行RNA抽提。

設(shè)計實驗：一是默認(rèn)目標(biāo)基因RNA未完全降解，繼續(xù)設(shè)計cDNA反轉(zhuǎn)錄及PCR實驗;二是根據(jù)自己找的RNA抽提過程的問題，重新進(jìn)行RNA抽提。

實驗驗證：學(xué)生首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR實驗，實驗步驟也是學(xué)生自己設(shè)計的。學(xué)生首先用Actin基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增（理論P(yáng)CR產(chǎn)物276bp），結(jié)果（圖1C）擴(kuò)增出Actin基因，且大小符合預(yù)期，說明RNA確實含部分未完全降解RNA。在RNA的重新抽提方面，學(xué)生根據(jù)總結(jié)的原因，選中兩個操作相對熟練的人進(jìn)行再次RNA抽提，并禁止其他人圍觀交談;同時再次仔細(xì)閱讀試劑盒說明書，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。第二次RNA抽提試驗結(jié)果（圖1B）顯示，其中總RNA的含量明顯好于第一次，說明他們自己總結(jié)的經(jīng)驗教訓(xùn)是有效果的。

（二）PCR擴(kuò)增

學(xué)生用第一次抽提的有部分降解的RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增Actin基因，結(jié)果（圖1C）成功擴(kuò)增出條帶。學(xué)生興奮地問：“這說明第一次抽提的RNA是可用的吧？”筆者迅速指出他們的設(shè)計存在的問題：一是由于Actin作為陽性對照基因表達(dá)量相對比較高，能PCR擴(kuò)增出Actin基因并不能完全說明第一次抽提的RNA可用，應(yīng)該增加其他目標(biāo)基因;二是Actin基因的理論P(yáng)CR產(chǎn)物僅275bp，有時無法與引物二聚體區(qū)分開，因此應(yīng)該同時加上陰性對照，在這里同時將陽性對照、陰性對照的作用進(jìn)行了詳細(xì)的講解，看得出來學(xué)生有豁然明白的感覺。同時提醒學(xué)生，從RNA電泳及Actin擴(kuò)增結(jié)果，學(xué)生提RNA的兩個重復(fù)樣，RNA質(zhì)量一致，后續(xù)的實驗選其中一個樣本進(jìn)行即可，節(jié)約時間與成本。

設(shè)計實驗：學(xué)生根據(jù)他們自己提出的問題及與教師一起分析探討的結(jié)果，再次進(jìn)行了實驗設(shè)計，選擇了基因A（1074bp）、基因B（1181bp）及Actin基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

實驗驗證：再次PCR實驗結(jié)果（圖1D）顯示，基因A、基因B、Actin均擴(kuò)增出條帶，且三個基因的陰性對照無條帶或者含引物二聚體條帶，說明第一次抽提的RNA可以用來進(jìn)行靶標(biāo)基因克隆模板用。學(xué)生已經(jīng)初步具備了分析問題、解決問題的能力。同時不可避免的，新的問題也產(chǎn)生了，為什么基因A有四條帶（圖1D，泳道11），除了最下面的二聚體帶，其他帶是什么？基因B有三條帶（圖1D，泳道13），除了二聚體帶，其他帶是什么？如何去掉多余的帶？

再次分析問題：對于基因A（圖1D，泳道11）來說，目標(biāo)條帶是1074bp，最上面的帶與DL5000 marker的最亮的1000bp帶基本持平，因此這條帶就是基因克隆的目標(biāo)條帶;最下面的帶在100bp左右，應(yīng)該是二聚體帶，基因A的陰性對照也有此帶（圖1D，泳道12），進(jìn)一步說明該帶為二聚體帶;其他兩條帶是非特異擴(kuò)增的雜帶。基因B與基因A情況類似（圖1D，泳道13），只是少一條雜帶而已。雜帶產(chǎn)生的原因是基因克隆要求引物能擴(kuò)增CDS全長，因此引物可供選擇余地小，容易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增的雜帶。至于如何去掉雜帶，有幾種辦法：一是重新設(shè)計引物，但是對引物的限制條件仍在，該方法常常不易成功;二是提高PCR步驟中的退火溫度，該方法可部分緩解雜帶問題，常常無法根除;三是進(jìn)行切膠回收，將目標(biāo)條帶單獨切出來，再進(jìn)行膠回收，該方法同時可以去除PCR過程加入的酶及其他雜質(zhì)，是目前解決此類問題的常用辦法。通過這樣的方法，讓學(xué)生自己設(shè)計實驗—分析實驗結(jié)果—找出問題—再次設(shè)計實驗—驗證解決問題，如此循環(huán)往復(fù)，完成整個分子生物學(xué)所設(shè)置的幾個實驗。學(xué)生通過自己的摸爬滾打，一邊摸索實驗，一邊解決實驗問題，對實驗操作過程印象深刻，對所學(xué)的知識也終生難忘，同時學(xué)會了分析問題、解決問題的能力。更難能可貴的是學(xué)生對生命科研探索充滿了熱情，達(dá)到了實驗課程設(shè)計的初衷。

三、課程考核方法改革

無論是以期末考試為主，還是以實驗報告為主的考核方法，會讓記憶能力強(qiáng)、字跡較為工整的學(xué)生占有一定優(yōu)勢，但是這些學(xué)生在動手能力方面并不突出。反而是那些平時理論課成績并不是很好的學(xué)生，表現(xiàn)出較強(qiáng)的實驗操作能力及分析問題解決問題的能力。

實驗操作能力可通過平時課堂觀察，那些操作較多的學(xué)生、實驗觀察較仔細(xì)的學(xué)生在進(jìn)行實驗課程總結(jié)的時候，會寫出生動、真實、身臨其境的感受。在總成績的組成部分中，平時出勤占10%，課堂表現(xiàn)占20%，課程總結(jié)占30%，實驗報告占40%。提高實驗操作能力及分析問題、解決問題的能力所占的比重，讓真正熱愛本專業(yè)、肯鉆研、動手能力強(qiáng)的學(xué)生得高分，鼓勵大家仿效，提高實驗課程訓(xùn)練效果。從教學(xué)改革的成果來看，大部分學(xué)生較扎實地掌握了課程實驗相關(guān)的理論與技術(shù)，并具備了一定程度的分析問題、解決問題的能力，增強(qiáng)了他們學(xué)習(xí)與工作的自信心，一部分學(xué)生甚至因此愛上了科研，并投入考研準(zhǔn)備中。

參考文獻(xiàn)

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Exploration on the Teaching Reform of Molecular Biology Experimental Course： Question-oriented Improvement of Students’ Ability to Analyze and Solve Problems

NIU Xiao-leia， b， FENG Shi-penga， b， JIANG Ling-yana， b， WANG Qian-nana， b， CHEN Yin-huac

（a.College of Tropical Crops; b. Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource; c. School of Life Science， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China）

Abstract： Molecular biology-related knowledge and experimental techniques are the basic knowledge and techniques that biology-relevant undergraduates need to learn well. These theories and techniques will occupy an extremely important position in the students’ future study and wok. Based on several years of teaching experience in Molecular Biology Experimental Course， this paper discusses the reform and exploration of the teaching process and evaluation methods of this course. The reform is based on the problems encountered by students in their process of hands-on experiments in order to promote students’ ability to analyze and solve problems in experiments. Besides， the evaluation methods of this course are also reformed. Our reform can provide references for teaching method and evaluation methods of Molecular Biology Experimental Course for other colleges and universities in the future.

Key words： Molecular Biology Experimental Course; teaching reform; question-oriented