辣椒遺傳轉化研究進展

摘要：辣椒（Capsicum annuum L.）作為一種重要的香料和蔬菜作物，具有巨大的經濟價值。隨著辣椒的需求量逐漸增大，育種目標也逐漸豐富，單純依靠傳統育種已無法滿足人們的需求。分子育種是辣椒高效育種的有效途徑，遺傳轉化技術是分子育種的核心，更是補充傳統育種和加快辣椒改良的有力工具。由于辣椒具有較高的基因型依賴性和遺傳轉化頑拗性，只采用經典遺傳轉化策略獲取陽性植株的概率渺茫。因此，基于經典遺傳轉化策略的拓展或是新策略的開發，對于推進辣椒遺傳轉化研究十分必要。本文重點圍繞近5年來遺傳轉化策略的拓展開發，從辣椒功能解析的常用手段出發，就辣椒遺傳轉化的現有情況、可供參考的高效轉化策略進行綜述，并且針對辣椒遺傳轉化的難點總結相應的策略，包括植物發育調節因子策略、病毒載體遞送策略、原生質體轉化策略及其他物種中可供參考的轉化策略。基于已有的研究，展望了辣椒遺傳轉化策略的進一步開發，為辣椒功能基因研究和分子育種提供理論支撐。

關鍵詞：辣椒；植物再生；遺傳轉化；轉化策略；功能驗證

中圖分類號：S641.303" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）24-0017-06

收稿日期：2023-11-10

基金項目：湖南重點研發計劃（編號：2023NK2006）；湖南農業大學研究生科研創新項目（編號：2023CX102）；國家自然科學基金（編號：32002040）。

作者簡介：張宏冠（1998—），男，山東濟寧人，碩士研究生，研究方向為辣椒分子設計育種。E-mail：871271896@qq.com。

通信作者：胡博文，博士，副教授，主要從事辣椒分子設計育種研究。E-mail：hubowen.cap@aliyun.com。

辣椒（Capsicum annuum L.）作為我國的重要蔬菜，年總產量可達6 400多萬t，農業產值達2 500億元，是我國經濟價值最高的蔬菜，辣椒產業更是助農增收、鄉村振興的支柱產業^［1］。種業是農業產業的 “芯片”，更是作物高產、高質的重要保障^［2］。隨著環境的變化，生物與非生物脅迫嚴重限制了辣椒的產量與質量，因此加強辣椒優良種質研究與創新已迫在眉睫^［3-4］。傳統的辣椒育種提高了辣椒產量與質量，但選育周期長、雜交不稔、遺傳性狀不穩定等因素使得該技術存在較大的局限性，阻礙了辣椒育種的進展，難以滿足人民的需求^［5］。分子育種為辣椒育種開辟了一條新的道路，通過植物遺傳轉化和以此為基礎的基因編輯技術提高育種效率、創制傳統育種方法難以實現的種質，可為優良品種的選育提供保障^［6-7］。

遺傳轉化技術和以此為基礎的基因編輯技術是分子育種的關鍵，通過該項技術可以實現目標基因的增加或改變，從而達到育種目的^［8］。現如今，許多具有已知重要功能的辣椒基因，如果色相關基因、風味相關基因、對生物脅迫與非生物脅迫的抗性基因，被分離和表征，但因遺傳轉化體系限制，包括高度再生頑固、轉化效率低等，辣椒分子育種進程緩慢^［9-13］。遺傳轉化技術或是以此為基礎的基因編輯技術，對已定位或是克隆到的基因進行鑒定和功能解析具有重要意義，因此高效遺傳轉化體系的建立對于功能基因研究和分子育種更是至關重要。本文針對辣椒遺傳轉化的難點如再生困難、轉化效率低等問題與相應的解決策略進行了綜述，并綜述了可供辣椒遺傳轉化參考的高效轉化策略，以期為辣椒高效遺傳轉化體系建立、分子育種效率提高提供理論支撐。

1 辣椒功能基因解析現狀

辣椒基因組的公布與泛基因組的建立為優良基因的篩選提供了便利，隨著測序技術的進步與成本的降低，辣椒基因被不斷預測，如抗性基因、育性基因與辣椒素合成相關基因等。然而，辣椒基因功能驗證的方法匱乏，主要原因在于高效遺傳轉化體系在辣椒中尚未建立，雖然有成功將外源基因導入的報道，但是轉化效率低、重復性差等問題限制了其廣泛的應用^［14］。

目前，辣椒基因功能驗證的方法主要集中在病毒誘導的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）和在其他有成熟轉化體系的物種中進行異源超表達（表1）。這些方法有自身的局限性，如煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）在辣椒中已被用作VIGS載體，可在辣椒中誘導系統性壞死，進而使得與防御和凋亡相關的應答基因難以被表征，相應的表型也難以分辨，同時，基因的異源超表達受到可轉化物種的限制，導致表型與預期有偏差。辣椒的遺傳轉化壁壘是研究其基因組學的嚴重限制，使其基因組學研究落后于其他茄科植物^［9，29］ 。

2 辣椒遺傳轉化現狀

2.1 植物發育調節因子促進辣椒再生

植物的離體再生能力制約了高效遺傳轉化體系的建立，常規的植物轉化需要優化外部因素，如選擇特定的植物基因型、調整植物生長調節劑比例 （主要是調整合適的生長素和細胞分裂素比例，用于改變植物生長）。植物發育調節因子，如Baby boom（BBM）、Wuschel（WUS）、PLETHORA（PLT）、GROWTH-REGULATING FACTOR4-GRF INTERACTING FACTOR1（GRF4-GIF1）、Wuschel-related homeobox（WOX），參與了生長素和細胞分裂素的合成途徑，調控植物的再生過程，現已被證明能促進植物高效遺傳轉化并擴大可轉化物種和基因型的范圍^［30-33］。2016年玉米BBM與WUS2的異位共表達促進了玉米、高粱、水稻、甘蔗體細胞胚的發生，并提高了農桿菌介導的遺傳轉化效率^［34］；2017年BBM與WUS2的異位共表達解決了頑拗性玉米B73的遺傳轉化問題^［35］；2020年GRF4-GIF1融合蛋白的表達擴大了小麥可轉化基因型的范圍，并提高了雙子葉植物柑橘的再生效率^［36］；2021年GRF4-GIF1融合蛋白通過突變mi396位點，在西瓜中實現了高效遺傳轉化^［37］；2022年TaWOX5的過表達克服了小麥遺傳轉化的基因型依賴，并實現了高效遺傳轉化^［38］。

辣椒具有基因型依賴和再生頑拗性，只采用經典遺傳轉化策略獲得陽性植株的概率渺茫，植物發育調節因子的使用是促進辣椒高效遺傳轉化的有效途徑。2011年，Heidmann等開發了一種經典遺傳轉化策略結合植物發育調節因子的轉化再生系統，使用帶有BBM基因的根癌農桿菌侵染甜椒子葉外植體，被轉化甜椒在含有10 μmol/L 地塞米松（DEX）、1 mg/L 噻苯隆（TDZ）或10 μmol/L DEX+1 mg/L TDZ的MS培養基上能誘導出豐富的體細胞胚，最終生根并獲得完整植株^［39］。2022年，Lian等使用同樣的策略，利用PLT5基因的表達提高了辣椒遺傳轉化效率，從0提升至3.8%^［40］。

2.2 病毒遞送系統提高遞送效率

經典遺傳轉化在大多數植物中的轉化效率低，其主要原因在于普通質粒載體遞送效率低，因此如何將外源DNA高效遞送至植物體內成為新的難題^［41］。病毒載體介導的遞送系統是一條有效途徑，病毒載體的遞送效率高，且具有靶向性和廣適性，是基于各種宿主植物研究基因功能的有利工具。病毒誘導的基因編輯（virus induced genome editing，VIGE）和病毒誘導的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）已經發展成為許多轉化困難物種中基因功能驗證的重要方法，其中最值得關注的就是VIGE^［42-43］。2015年，甘藍曲葉病毒（cabbage leaf curl virus，CaLCuV）通過VIGE技術系統感染了煙草，并編輯掉了八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS），新生葉產生了漂白表型^［44］。2017年，小麥矮病毒（wheat dwarf virus，WDV）VIGE遞送系統被開發，對水稻進行了高效基因編輯^［45］ 。值得注意的是，一些陽性RNA病毒，如煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）可以將sgRNA傳遞到生殖細胞或是分生組織中^［46］。2020年，TRV-VIGE遞送系統被開發，在煙草中實現了高效基因編輯和穩定遺傳，在被病毒感染的植物后代中有30%在三靶中檢測到突變^［47］。同年，苦苣菜黃網病毒（sonchus yellow net virus，SYNV）VIGE遞送系統被開發，在煙草中實現高效基因編輯并且實現了穩定遺傳，在被感染病毒的植物后代中有57%存在突變，并且可繞過組織培養，進行穩定的機械傳播^［48］。

辣椒尚未建立高效遺傳轉化體系，導入或編輯基因的手段仍然局限于經典遺傳轉化，高效轉化對于研究辣椒功能基因意義重大，基于病毒高效遞送系統，繞過經典遺傳轉化的復雜操作從而提升轉化效率，對加速辣椒分子設計育種及創制優良品種至關重要。2023年，番茄斑點枯萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）VIGE高效遞送系統被開發，該系統具有宿主范圍廣、攜帶容量大且能夠進行系統性感染等特點，對于一些難以轉化的植物來說，TSWV克服了基因遞送效率與基因型依賴的瓶頸，TSWV系統性地感染了辣椒的多種基因型，并且實現了40%的編輯效率^［49］。TSWV在辣椒中克服了基因遞送瓶頸問題，但仍然存在一定的局限性，如無法感染到生殖細胞、難以繞過離體再生，目前，VIGS仍是辣椒研究功能基因組學的常用技術。TRV介導的VIGS技術常用于辣椒中，但是沉默效率不穩定，仍需要被進一步優化。2021年，帶有C2b基因的TRV載體被開發，TRV感染后 5個辣椒品種果實表型明顯，隨后的定量數據證明了基因沉默的高效性，TRV-C2b為VIGS技術提供了高效的載體，并有助于辣椒整個生命周期的基因功能研究^［50］。接種TRV病毒后表現出的癥狀，如壞死、變黃、發育遲緩，可能會影響辣椒基因功能的系統分析^［51］，因此，蠶豆萎蔫病毒2號（broad bean wilt virus 2，BBWV2）被開發，BBWV2病毒載體介導的VIGS不會引起辣椒明顯的病毒癥狀，且BBWV2與異源病毒抑制子共表達，增強了重組蛋白表達的穩定性^［15］。

2.3 辣椒原生質體遞送系統被開發

許多植物因遺傳轉化技術壁壘阻礙了其分子機理的研究，因此，一種分析分子過程的材料需要被開發。使用原生質體被認為是一種簡便有效的辦法，因其沒有細胞壁且易吸收外源物質被廣泛用于遺傳轉化和以此為基礎的基因編輯^［52-53］，同時具有試驗周期短、轉化效率高、脫靶率低的優勢^［54-55］。在植物進行基因編輯之前，使用原生質體通過核糖核蛋白復合物（RNP）遞送系統來確定目標基因的編輯效率，對于建立了再生系統的植物可以進一步產生基因編輯植物。2020年，使用RNP遞送系統對橡膠樹原生質體完成了基因編輯，編輯效率為70%^［56］。2021年，使用RNP遞送系統對輻射松原生質體完成了基因編輯，隨后使用被編輯后的原生質體產生了再生苗^［57］。2023年，使用RNP遞送系統對葡萄原生質體進行了基因編輯，隨后通過體細胞胚的發生途徑獲得了被編輯后的完整植株^［58］。

辣椒遺傳轉化困難，以此為基礎的基因編輯技術在之前未曾被報道，近幾年有了突破。2020年，使用RNP遞送系統對辣椒原生質體進行了基因編輯，并獲得了19.3%的編輯效率，為辣椒創制了首個基因編輯系統^［59］。然而，辣椒原生質體的再生系統尚未被報道，如何獲得再生植株仍需進一步的探索。

3 高效轉化策略為提升辣椒遺傳轉化效率提供參考

3.1 可移動RNA的應用

載體遞送效率低與轉化后再生困難是辣椒遺傳轉化的重要限制因素^［9］。病毒遞送系統的使用、植物發育調節因子共表達有效地解決了這些困難，但是這些方法仍不夠完善，如病毒遞送系統無法侵染到生殖器官，陽性苗的獲得繞不開組織培養；植物發育調節因子WUS、BBM過表達產生的轉基因植物表型出了異常的表型，如根尖卷曲、葉片扭曲或是下胚軸膨脹等^［60］。因此，辣椒遺傳轉化策略開發工作依舊充滿挑戰。

盡管有新策略被開發，辣椒遺傳轉化仍然受限于組織培養，近幾年其他物種的轉化策略為辣椒遺傳轉化提供了參考（圖1）。2023年，一種基于tRNA-like sequence（TLS）的基因編輯傳遞方法被開發，該方法使用砧木嫁接法將可移動的TLS從轉基因供體轉移到兼容的野生型受體植物中，從而在當代獲得純合編輯的植株^［61］。這種繞過組織培養、省略雜交和自交步驟獲得純合編輯植株的方案，對加速優良品種培育意義重大。2022年，番茄與辣椒嫁接關鍵調控因子WOX4被鑒定且番茄有穩定的轉化體系，該研究為辣椒嫁接攜帶TLS基因編輯的番茄供體提供了可能^［62］。

3.2 葉綠體轉化體系的應用

葉綠體轉化與主流的核轉化相比具有外源基因表達量高、無位置效應、無花粉漂移、有多基因共表達元件等優勢^［63］。2019年，一種具有廣適性的葉綠體轉化方法被開發，該方法使用納米顆粒系統轉化植物，研究人員在葉片表面下方使用注射法將顆粒通過氣孔注入葉片，進入葉片內部后，納米顆粒會穿過細胞壁、細胞膜，最終穿過葉綠體的雙層膜，進入葉綠體后，葉綠體的弱酸性環境會促使 DNA從納米顆粒中釋放出來。隨后，研究人員在菠菜、煙草、芝麻和擬南芥中進行了測試，利用黃色熒光蛋白進行驗證，結果表明，47%的植物細胞可表達黃色熒光蛋白^［64］。在高等植物中，茄科植物是進行葉綠體轉化成功最多的，且該方案不需要組織培養，該研究為辣椒遺傳轉化新策略開發提供了參考^［65］。

4 展望

目前辣椒基因功能驗證的手段多為VIGS或是異源超表達，通過遺傳轉化手段的報道較少，近幾年新開發的轉化策略對辣椒基因組學研究、優良品種培育有巨大的價值，綜合已有的研究，未來的研究可以在以下4個方面進一步延伸：（1）植物發育調節因子組合使用可能會有累加的作用進而促進外植體再生，如GRF-GIF促進單子葉與雙子葉植物的再生、BBM-WUS促進單子葉植物體細胞胚發生^{［36，40］} 。因此，可以利用多組學聯合分析技術進一步挖掘與植物再生相關的基因，并單獨或組合測試其在辣椒中的轉化效率。（2）病毒遞送系統提高了辣椒的轉化，然而大多數病毒無法感染到生殖細胞或是分生組織無法穩定遺傳至下一代，因此無法繞過組織培養，離體再生這一瓶頸依然存在^［49］。植物發育調節因子共接種增加了被編輯外植體再生的可能，而使用病毒遞送系統結合植物發育調節因子共接種，在提升遞送效率的同時增加了再生的可能性^［66］。（3）Flowering Locus T（FT） 融合sgRNA在TRV載體中被證明可移動到頂端分生組織和花組織^［67］。這意味著通過病毒遞送系統，可以獲得無需組織培養的轉基因苗。然而病毒的容載量（通常小于1 kb）限制了基因編輯組件的遞送，如Cas9蛋白（大小為4 kb），TSWV的大容載量解決了這一問題，因此TSWV融合可移動RNA元件如FT，可能有助于基因編輯植物的獲得^［68］。（4）參考繞過組織培養的遺傳轉化策略，開發出新的方案如TLS、葉綠體轉化等。

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