間充質干細胞移植對降植烷誘導狼瘡小鼠肺泡出血的影響及可能機制

［摘要］ 目的： 探討間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植對降植烷誘導狼瘡小鼠肺泡出血的作用及可能機制。方法： 10周齡雌性C57BL/6（B6）小鼠20只腹腔注射0.5 mL降植烷，3只同周齡雌性B6小鼠腹腔注射PBS作為正常對照組。1周后將20只注射降植烷小鼠隨機分為MSC組和PBS組，分別給予尾靜脈注射1×106人臍帶來源的MSCs和PBS；觀察1周后，計算造模小鼠生存率并稱量小鼠體重，處死所有小鼠，取出肺臟，觀察肺臟大體及肺臟HE染色評估造模小鼠肺出血嚴重程度。酶消化法制備獲取3組小鼠肺臟單細胞懸液，流式細胞術檢測3組小鼠肺部CD4+、CD8+T淋巴細胞，CD19+B淋巴細胞，CD11b+Gr1+中性粒細胞，F4/80+肺間質巨噬細胞的絕對數以及抗炎型CD206+肺間質巨噬細胞的百分率。結果： MSC組小鼠生存率高于PBS組，但差異無統計學意義（P=0.07）；體重明顯高于PBS組小鼠（Plt;0.01）；MSC組小鼠完全彌漫性肺泡出血（diffuse alveolar hemorrhage，DAH）及部分DAH的發生率低于PBS組。與PBS組相比，MSC組肺臟單細胞總數顯著減少（Plt;0.01），肺臟CD4+T細胞數量有下降趨勢，而CD8+T細胞及CD19+B細胞的數量則明顯下降（Plt;0.05），肺臟CD11b+Gr1+中性粒細胞及F4/80+巨噬細胞的絕對數也均顯著降低（Plt;0.01和Plt;0.05）；此外，肺出血小鼠CD206+抗炎型巨噬細胞的百分率顯著降低（Plt;0.01），而MSC移植顯著提高CD206+抗炎型巨噬細胞的百分率（Plt;0.01）。結論： MSC移植可顯著降低狼瘡小鼠肺泡出血的發生率，其機制可能是對肺臟免疫細胞的調控及誘導巨噬細胞CD206抗炎表型的產生。

［關鍵詞］ 間充質干細胞；系統性紅斑狼瘡；肺泡出血；巨噬細胞；CD206

［中圖分類號］ R593.243

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 1671-7783（2024）03-0185-05

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y240008

［引用格式］張卓亞，陳晨，黃賽賽，等. 間充質干細胞移植對降植烷誘導狼瘡小鼠肺泡出血的影響及可能機制［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2024， 34（3）： 185-189，196.

The effect and possible mechanism of mesenchymal stem cell transplantation on pristane induced pulmonary alveolar hemorrhage in lupus-prone mice

ZHANG Zhuoya1， CHEN Chen2， HUANG Saisai1， JIANG Bo1

（1. Department of Rheumatology and Immunology， 2. Department of Nutrition， Nanjing Drum Tower Hospital， Affiliated Hospital of Medical School， Nanjing University， Nanjing Jiangsu 210008， China）

［Abstract］ Objective： To investigate the effect of mesenchymal stem cells （MSC） transplantation on pristane induced pulmonary alveolar hemorrhage in lupus mice and explore the possible mechanism. Methods： Twenty female C57BL/6 （B6） mice at 10 weeks of age were injected with 0.5 mL pristane intraperitoneally and 3 control B6 mice were injected with the same volume of PBS. After one week， mice injected with pristane were randomly divided into two groups and intravenously injected with 1×106human umbilical cord-derived MSCs or PBS， respectively. After another week of observation， the survival rate and body weight of the two groups were recorded and all mice were sacrificed. The appearance of the lungs was observed and hematoxylin and eosin （HE） staining was performed to assess the severity of pulmonary hemorrhage. Lung single-cell suspensions were prepared by enzymatic digestion. CD4+and CD8+T lymphocytes， CD19+B lymphocytes， CD11b+Gr1+neutrophils， F4/80+macrophages and CD206+macrophages in lungs were detected by flow cytometry. Results： The survival rate of mice in the MSC group was higher than that of the PBS group， but the difference was not statistically significant （P=0.07）， and the average body weight in MSC mice was significantly increased （Plt;0.01） than that in PBS group. The incidences of complete diffuse alveolar hemorrhage and partial diffuse alveolar hemorrhage in the MSC group were lower than that in the PBS group. Compared with the PBS mice， the total number of lung cells in the MSC group was significantly reduced （Plt;0.01） than that in the PBS group. The number of lung CD4+T cells in the MSC group showed a decreased tendency， while the numbers of CD8+T cells and CD19+B cells were significantly decreased （Plt;0.05） in the MSC group than that in the PBS group. The absolute numbers of CD11b+Gr1+neutrophils and F4/80+macrophages in lungs of MSC treated mice were also markedly reduced （Plt;0.01 and Plt;0.05）. In addition， the percentage of CD206+anti-inflammatory macrophages in lungs of pulmonary hemorrhage mice was significantly reduced （Plt;0.01）， while the percentage of CD206+anti-inflammatory macrophages was significantly increased by MSC transplantation （Plt;0.01）. Conclusion： MSC transplantation can significantly reduce the incidence of pulmonary hemorrhage in lupus-prone mice， which may attributed to the regulation of lung immune cells and the induction of CD206 anti-inflammatory macrophages by MSCs.

［Key words］ mesenchymal stem cell; systemic lupus erythematosus; alveolar hemorrhage; macrophage; CD206

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種可累及全身多個系統器官的自身免疫性疾病，肺臟也不例外［1］。彌漫性肺泡出血（diffuse alveolar hemorrhage，DAH）是SLE患者肺臟受累的一種表現，雖不常見，但病死率高。DAH的主要臨床表現為咯血、血紅蛋白進行性下降、低氧血癥甚至呼吸衰竭，肺部CT可見彌漫性的肺泡浸潤或實變，短期之內可危及生命。既往研究發現成年SLE患者DAH的發生率為0.5%～5.7%，而死亡率超過30.0%［2-3］。DAH是SLE患者最嚴重的并發癥之一，需要及時診斷及治療。傳統的治療方法包括大劑量糖皮質激素沖擊、環聯酰胺、血漿置換以及生物制劑如利妥昔單抗等［1］。因為缺乏隨機對照研究，這些方法的療效尚不確切，且可能發生致死性感染。因此，亟需尋找治療DAH的新方法。

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一群具有多向分化能力和免疫調節作用的干細胞［4］。基于其強大的組織修復作用及免疫調節功能，自2007年至今，我們中心應用MSCs治療包括SLE在內的自身免疫性疾病患者已達數百例，取得良好療效，且未發現移植相關嚴重不良反應，提示MSCs對自身免疫性疾病具有治療作用及安全性［5-6］。DAH疾病兇險，一旦發生，救治難度大，因此，早期控制病情進展尤為重要。本研究利用經典的降植烷誘導狼瘡鼠肺泡出血模型，在模型小鼠發病前移植MSC，觀察MSC對其發生DAH的影響，并通過對肺臟免疫細胞的檢測探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6（B6）小鼠購自南京大學模式動物研究所，飼養于南京大學醫學院附屬鼓樓醫院實驗動物中心無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級動物房，使用獨立送風隔離籠，伴12 h調節光照模擬晝夜交替。實驗動物的飼養和所有動物實驗操作均獲得南京大學醫學院附屬鼓樓醫院動物實驗倫理委員會的審核批準。

1.2 主要試劑及儀器

降植烷、Ⅰ型膠原酶、DNA酶Ⅰ（美國Sigma公司）；PBS、蘇木素、伊紅（武漢博士德生物工程有限公司）；抗小鼠CD4-FITC、CD8-PE、CD19-APC、CD11b-PerCP-Cyanine5.5、Gr1-FITC、F4/80-FITC、CD206-APC等流式抗體（美國eBioscience公司）。Countstar細胞計數儀，BD Calibur流式細胞儀。

1.3 狼瘡DAH模型鼠的建立及MSC移植

20只B6雌性小鼠于8～10周齡腹腔注射0.5 mL降植烷，3只同周齡雌性B6小鼠腹腔注射PBS作為正常對照組。1周后20只注射降植烷的造模小鼠隨機分為MSC組與PBS組，MSC組小鼠通過尾靜脈注射1×106MSC，PBS組通過尾靜脈注射等體積的PBS。移植后觀察1周，統計兩組小鼠生存率及體重，并在造模后第14天處死所有小鼠。

1.4 HE染色觀察模型小鼠肺組織病理

留取小鼠肺臟，觀察評估肺泡出血的程度并拍照。PBS組和MSC組各留取3只小鼠肺臟4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，然后進行HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 肺臟單細胞懸液制備

取3組小鼠分離肺組織，剪碎后加入含Ⅰ型膠原酶及DNA酶Ⅰ的組織消化液，置于37 ℃二氧化碳培養箱1 h，消化結束后將組織懸液轉移至過濾網，用注射器的內芯研磨組織塊至濾網不再剩余紅色組織，收集細胞并裂解紅細胞后加入適量PBS重懸備用。

1.6 流式細胞術檢測肺臟免疫細胞

細胞計數儀測定對照組、PBS組和MSC組小鼠肺臟單細胞的數量；肺臟單細胞懸液分別用相應熒光抗體標記后，上機流式細胞儀檢測并計算CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD19+B淋巴細胞、CD11b+Gr1+中性粒細胞、F4/80+肺間質巨噬細胞的絕對數以及抗炎型CD206+肺間質巨噬細胞的百分率。

1.7 統計學分析

應用GraphPad Prism 9.5.0軟件進行統計分析和繪圖。兩組生存曲線比較采用Log-Rank法；定量數據以x±s表示，兩組均數比較采用獨立樣本t檢驗，三組間的比較采用單因素方差分析，組間比較采用Tukey檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PBS組和MSC組小鼠生存率分析

PBS組小鼠在降植烷注射后第12天和第13天分別出現1只和2只小鼠死亡；而MSC組小鼠直至第14天觀察終點未出現小鼠死亡（圖1）。兩組生存曲線比較，MSC組小鼠生存率高于PBS組，但差異無統計學意義（χ2=3.34，P=0.07）。

2.2 PBS組和MSC組小鼠體重比較

PBS組小鼠在降植烷注射1周后開始出現體重下降，在第14天時體重顯著低于造模前（t=4.93，Plt;0.01）及造模后第7天（t=4.96，Plt;0.01）；MSC組小鼠體重無明顯下降。在觀察終點，MSC組小鼠體重顯著高于PBS組（t=3.72，Plt;0.01）。

2.3 DAH模型小鼠肺出血大體病理及HE染色結果

對DAH模型小鼠肺臟大體及顯微鏡下觀察可見（圖3A），無DAH發生的小鼠肺臟為粉白色，HE染色肺泡結構完整，血管和支氣管周圍無明顯炎癥細胞浸潤，肺泡腔無紅細胞填充；發生部分DAH的小鼠肺臟為暗紅粉白相間，部分充血，顯微鏡下肺泡結構不完整，血管和支氣管周圍可見炎癥細胞浸潤，肺泡腔被紅細胞部分填充；而完全DAH整肺為暗紅色，充血明顯，HE染色鏡下觀察可見肺泡結構模糊不清，大量炎癥細胞浸潤在血管及支氣管周圍，紅細胞幾乎填滿支氣管及肺泡腔。

PBS組小鼠有60%發生完全DAH，20%發生部分DAH，20%無DAH；而MSC組小鼠僅20%發生完全DAH，10%發生部分DAH，70%無DAH（圖3B）。

2.4 3組小鼠肺臟單細胞總數比較

與正常對照小鼠相比，PBS組小鼠肺臟單細胞總數顯著增加（q=8.28，Plt;0.01）；而MSC組小鼠肺臟單細胞總數較PBS組顯著下降（q=8.28，Plt;0.01），見圖4。

2.5 3組小鼠肺臟T、B淋巴細胞數量比較

如圖5所示，肺臟CD4+T淋巴細胞計數PBS組小鼠較正常對照組小鼠升高，MSC組小鼠較PBS組降低，但差異無統計學意義。肺臟CD8+T淋巴細胞數PBS組小鼠較正常對照組小鼠顯著升高（q=5.23，Plt;0.01），MSC組小鼠較PBS組顯著降低（q=3.82，Plt;0.05）。此外，MSC組小鼠肺臟CD19+B細胞的數量較PBS組顯著減少（q=5.08，Plt;0.05）。

2.6 3組小鼠肺臟中性粒細胞與巨噬細胞數量比較

如圖6所示，PBS組小鼠肺臟CD11b+Gr1+中性粒細胞及F4/80+巨噬細胞較正常對照組小鼠明顯增多（q=8.34，Plt;0.01和q=4.55，Plt;0.05），而MSC組小鼠肺臟CD11b+Gr1+中性粒細胞及F4/80+巨噬細胞與PBS組相比則顯著降低（q=8.81，Plt;0.01和q=4.93，Plt;0.05）。與正常對照組小鼠相比，PBS組小鼠F4/80+巨噬細胞中CD206+的百分率顯著降低（q=6.71，Plt;0.01），MSC組F4/80+巨噬細胞中CD206+的百分率較PBS組則顯著升高（q=5.39，Plt;0.01）。

3 討論

DAH是SLE患者危及生命的并發癥，死亡率高。我國的一項大型SLE-DAH隊列研究發現DAH更傾向于發生在SLE的早期病程中，有五分之一的患者以DAH為SLE的最初發病表現；DAH更是導致SLE患者生存率降低的獨立因素［7］。研究發現MSC移植能夠顯著提高狼瘡小鼠模型的生存率［8-9］，而接受MSC的難治性SLE患者5年生存率達84%［5］。早在2010年及2012年本中心就報道了MSC成功治療4例對傳統治療（大劑量激素、丙種球蛋白、環磷酰胺等）無效的SLE-DAH患者，發現MSC移植顯著減輕患者咳嗽、呼吸困難、貧血等臨床癥狀，改善患者氧合及肺部影像學表現［10-11］。本研究也表明MSC能改善SLE-DAH小鼠的生存率，降低DAH的發生率及嚴重程度，提示MSC移植為治療SLE-DAH的潛在新方法。但MSC移植治療對SLE-DAH患者生存率的影響及確切的療效則需要將來大樣本臨床研究進一步確定。

DAH的發病機制目前尚不完全清楚，主要的病理機制可能是B細胞產生的自身抗體與自身抗原結合形成免疫復合物，導致肺泡上皮細胞及血管內皮細胞的損傷和凋亡，招募中性粒細胞形成中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）及單核巨噬細胞浸潤，導致毛細血管和肺泡基底膜的破壞，最終大量的紅細胞進入肺泡腔。除了免疫細胞，補體系統的激活及炎癥因子也參與了SLE-DAH的發病［2］。對SLE-DAH發病機制的研究主要基于動物實驗。B6小鼠在降植烷注射10 d后即可發生肺泡出血，注射后14 d達發病高峰，在注射3～6個月后可出現球蛋白升高、自身抗體、關節炎以及腎小球腎炎等狼瘡樣癥狀，與SLE的臨床表現極為相似，因此，降植烷誘導的肺泡出血模型是公認的研究SLE-DAH的模型［12-13］。Barker等［14］發現，Ｂ細胞Igμ-/-小鼠在注射降植烷后，肺出血發生率顯著降低；Zhuang等［15］研究發現，B細胞缺陷的小鼠注射降植烷后不發生肺泡出血，表明B細胞在SLE-DAH發病中的重要作用。有研究發現清除NETs可減輕SLE-DAH肺臟損傷并提高生存率，提示中性粒細胞也參與其發病［16］。而利用脂質體清除小鼠巨噬細胞后，其發生肺泡出血的百分率也顯著下降［15］；有趣的是，并不是所有的巨噬細胞都參與致病作用，Shi等［17］發現給小鼠腹腔注射CD206+巨噬細胞可顯著降低DAH發生率并改善病情。與既往研究相似，本研究中降植烷誘導SLE-DAH模型小鼠肺臟CD8+T細胞、CD19+B細胞、CD11b+Gr1+中性粒細胞及F4/80+巨噬細胞的數量與正常對照鼠相比均顯著增多，而CD206+巨噬細胞的相對數量則顯著下降，這表明SLE-DAH發病機制復雜，多種免疫細胞均參與其發病過程。

MSC對多種免疫細胞均有調節作用，這是其治療SLE的機制之一［18］。研究發現MSC可抑制SLE患者效應性T細胞的增殖，促進調節性T細胞的產生；MSC能通過分泌趨化因子配體2（CCL2）抑制B細胞分化為漿細胞；MSC還可上調狼瘡患者及狼瘡鼠腎臟巨噬細胞CD206的表達，并增強其吞噬功能［19］。本研究結果顯示MSC治療后DAH小鼠CD8+T細胞、CD19+B細胞、CD11b+Gr1+中性粒細胞及F4/80+巨噬細胞的絕對數量均顯著降低，且MSC移植顯著提高肺臟巨噬細胞CD206的表達。肺臟是MSC靜脈輸注至受體后最先到達的內臟器官，而SLE-DAH小鼠肺臟有大量免疫細胞浸潤，因此，我們推測MSC通過調控肺臟免疫細胞改善DAH病情。但MSC如何調控DAH小鼠肺臟免疫細胞尚不清楚。Chen等［20］發現來源于MSC的外泌體能夠改善DAH小鼠肺臟損傷并上調抗炎型M2巨噬細胞的水平。這提示MSC移植入受體后或許能通過分泌外泌體調控免疫細胞從而發揮治療作用。

綜上所述，MSC移植可顯著降低狼瘡小鼠肺泡出血的發生率及嚴重程度，提高其生存率，其機制可能是對肺臟免疫細胞的調控及上調巨噬細胞CD206的表達。本研究為應用MSC治療SLE-DAH患者提供了理論基礎，但MSC對SLE-DAH患者的確切療效及具體機制則需要更多的臨床及基礎研究。

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［收稿日期］ 2024-01-16" ［編輯］ 何承志

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（81901644）；南京市衛生科技發展專項資金項目（YKK19051）

［作者簡介］張卓亞（1989—），男，主治醫師；姜波（通訊作者），主任醫師，E-mail： Bogermany@163.com