PCR反應(yīng)的游戲模擬及促進(jìn)深度學(xué)習(xí)的問題設(shè)計(jì)

摘 要 針對(duì)PCR技術(shù)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)模擬的DNA分子及上、下游引物，讓學(xué)生參與模擬PCR反應(yīng)過程的游戲，針對(duì)游戲情境，設(shè)計(jì)常規(guī)性問題及拓展思考的深度問題，引導(dǎo)學(xué)生通過合作探究主動(dòng)參與課堂教學(xué)活動(dòng)，手、腦并用，在批判性思維的基礎(chǔ)上深度理解PCR技術(shù)的原理，提升學(xué)生運(yùn)用多學(xué)科知識(shí)解決問題的意識(shí)。

關(guān)鍵詞 PCR；游戲模擬；問題設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)：G424 " """"""""""""""""""""""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A """ DOI：10.16400/j.cnki.kjdk.2024.24.013

Game Simulation and Questions Design to Promoting Deep Learning

on the Reaction Process of PCR

Abstract Based on the characteristics of PCR technology， the game of simulating the PCR reaction process for students to performing was designed after simulated DNA molecules and simulated primers being designed. Encourage students to participate in a game that simulates the PCR reaction process， design routine questions and expand their thinking depth based on the game context， guide students to actively participate in classroom teaching activities through collaborative exploration， use both hands and brains， deeply understand the principles of PCR technology on the basis of critical thinking， and enhance students' awareness of using interdisciplinary knowledge to solve problems.

Keywords PCR; game simulation; questions design

PCR為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）的英文縮寫簡(jiǎn)稱，是一項(xiàng)在體外模擬生物體內(nèi)DNA的復(fù)制過程，快速有選擇性地復(fù)制特定的DNA片段，獲得大量目的基因（DNA片段）的技術(shù)。該技術(shù)由穆里斯在1983年提出設(shè)想，1985年成功發(fā)明，并在1986年完成實(shí)驗(yàn)應(yīng)用報(bào)告的重大發(fā)明[1]，是通過思維構(gòu)建技術(shù)路線，并付之行動(dòng)而實(shí)現(xiàn)的經(jīng)典案例，榮獲1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR是高中生物課程的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，也是高校相關(guān)專業(yè)課程的核心教學(xué)內(nèi)容。PCR的實(shí)驗(yàn)操作非常簡(jiǎn)便，各種實(shí)驗(yàn)材料均可以從相關(guān)公司直接購(gòu)買，按照試劑盒提供的說明，加入樣品后，設(shè)定合適的循環(huán)程序，由儀器自動(dòng)完成反應(yīng)過程。因PCR的反應(yīng)過程和原理所蘊(yùn)含的信息量很豐富，但反應(yīng)過程不可視，教師即使借用動(dòng)畫講解，還是會(huì)有很多細(xì)節(jié)及原理不容易引起學(xué)生的注意及理解，為促進(jìn)學(xué)生盡快熟悉PCR的反應(yīng)過程并深度掌握PCR的技術(shù)原理，可以讓學(xué)生通過游戲直接模擬反應(yīng)過程，教師針對(duì)場(chǎng)景設(shè)計(jì)問題，培養(yǎng)學(xué)生的問題意識(shí)，促進(jìn)學(xué)生深度學(xué)習(xí)，更好地達(dá)成課程的教學(xué)目標(biāo)。

1" PCR反應(yīng)情境的游戲模擬

1.1" 模擬分子設(shè)計(jì)及材料準(zhǔn)備

設(shè)計(jì)模擬的模板DNA及上、下游引物（圖1，p38）。設(shè)計(jì)時(shí)注意，引物與母鏈的結(jié)合位只有一個(gè)，其中一個(gè)引物結(jié)合位離目的基因一段距離，目的基因外側(cè)相當(dāng)于引物長(zhǎng)度區(qū)域的堿基序列與基因內(nèi)部的一段堿基序列相同，為教學(xué)過程中提出相關(guān)的針對(duì)性問題提供情境。

設(shè)計(jì)完成后，把三種模擬分子分別打印到等長(zhǎng)等寬的白紙條上，DNA分子標(biāo)明5'和3'端，并標(biāo)注出需要擴(kuò)增的區(qū)域，引物條上標(biāo)出5'方向，上游引物打印在紙條的左側(cè)，堿基的順序從左到右排列，下游引物打印在紙條的右側(cè)，堿基的順序從右到左排列，引物條上預(yù)留粘貼單鏈DNA（母鏈）的空間（圖2），剪刀，鋼筆，膠水，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表。

1.2" 游戲過程

分組游戲，每組6人，其中1位同學(xué)擔(dān)任高溫角色，2位同學(xué)擔(dān)任引物角色，2位同學(xué)擔(dān)任DNA聚合酶角色，1位同學(xué)統(tǒng)計(jì)記錄每一輪循環(huán)后的DNA分子類型、數(shù)量以及高溫變性后單鏈DNA的種類和數(shù)量。游戲過程中，教師擔(dān)任主導(dǎo)人，主持整個(gè)游戲過程。教師首先宣布參與反應(yīng)過程的成員到場(chǎng)，類似加樣，并強(qiáng)調(diào)說明真實(shí)反應(yīng)環(huán)境中的所有成分，交代底物的替代處理，然后按序分期布置游戲： ①高溫變性。手拿剪刀的同學(xué)，剪開DNA的兩條鏈；②低溫復(fù)性。手持引物紙條的同學(xué)，按5'→3'方向，尋找與相應(yīng)的DNA單鏈（3'→5'方向）配對(duì)之處，粘貼結(jié)合； ③復(fù)制延伸。擔(dān)任DNA聚合酶角色的同學(xué)，以堿基配對(duì)原則，用鋼筆直接寫出配對(duì)的堿基來模擬底物及延伸過程，延伸結(jié)束后，在鏈末標(biāo)上3'。重復(fù)“變性——復(fù)性——延伸”過程，一共完成三個(gè)循環(huán)，第三次循環(huán)結(jié)束后再變性一次，記錄變性后的單鏈DNA的類型和數(shù)量，復(fù)制后的DNA分子類型和數(shù)量，填入表1。

2" 問題設(shè)計(jì)

針對(duì)具體的場(chǎng)景，設(shè)計(jì)常規(guī)性和拓展性問題。在解決常規(guī)問題的基礎(chǔ)上，提出針對(duì)性的拓展問題，拓展性問題不求當(dāng)堂解決，可在課后繼續(xù)討論、探究完成。通過問題強(qiáng)化記憶和理解，引導(dǎo)學(xué)生形成問題意識(shí)，對(duì)所學(xué)內(nèi)容進(jìn)行主動(dòng)的思考認(rèn)證，提升學(xué)生運(yùn)用多學(xué)科知識(shí)解釋生命現(xiàn)象的能力，并進(jìn)一步提升其擴(kuò)展性和創(chuàng)造性思維活動(dòng)能力，形成科學(xué)與技術(shù)是相輔相成的印記，并引導(dǎo)他們形成讓科學(xué)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化成技術(shù)運(yùn)用、讓技術(shù)運(yùn)用來促進(jìn)科學(xué)發(fā)展的創(chuàng)新意識(shí)。

2.1" 高溫變性階段

常規(guī)問題：①高溫變性的作用是什么？②解鏈的目的是什么？③生物體內(nèi)DNA是如何解鏈的？④高溫會(huì)破壞反應(yīng)體系中的DNA聚合酶活性嗎？

拓展問題：①PCR反應(yīng)過程中，可用解旋（鏈）酶替代高溫變性嗎？如果也發(fā)現(xiàn)了耐高溫的解旋酶，能不能用于PCR實(shí)驗(yàn)？設(shè)計(jì)理念及解析：引導(dǎo)學(xué)生深度理解PCR技術(shù)的循環(huán)原理，PCR中90℃以上的高溫設(shè)計(jì)目的是解開雙鏈模板，解鏈只發(fā)生在每個(gè)循環(huán)的開始階段，解鏈之后，就復(fù)性和延伸，如果使用的解旋酶一直有活性，解鏈功能就會(huì)一直存在，隨后的引物配對(duì)和復(fù)制延伸就無法進(jìn)行。

2.2" 復(fù)性（引物配對(duì)）階段

常規(guī)問題：①引物是單鏈DNA還是單鏈RNA？②請(qǐng)持上、下游引物的同學(xué)看看，兩種引物能不能相互配對(duì)？如果能配對(duì)會(huì)出現(xiàn)什么后果？③有沒有找到配對(duì)區(qū)？如果找到了，引物配對(duì)區(qū)在目的基因的什么位置？是不是緊挨著目的基因？④找找看，有沒有發(fā)現(xiàn)其他區(qū)域也有引物的配對(duì)區(qū)？

拓展問題：①DNA復(fù)制時(shí)，為什么需要引物？如果DNA復(fù)制不需要引物，PCR技術(shù)還能選擇性地對(duì)某個(gè)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增嗎？體內(nèi)細(xì)胞復(fù)制DNA分子也是用DNA片段做引物嗎？設(shè)計(jì)理念及解析：促進(jìn)學(xué)生深入理解引物的作用和使用意義，DNA復(fù)制由DNA聚合酶催化完成，其催化合成反應(yīng)的機(jī)制是讓正在生長(zhǎng)的DNA鏈（或引物鏈）核糖上的3’-OH，對(duì)一個(gè)新來的脫氧核苷三磷酸 位的磷酸進(jìn)行親核進(jìn)攻，形成磷脂鍵，并釋放出一個(gè)焦磷酸，從而在兩個(gè)核糖之間形成磷酸二酯鍵（圖3）[2]，DNA聚合酶不能以單個(gè)脫氧核苷酸為起點(diǎn)，將游離的脫氧核苷酸從頭聚合形成多核苷酸鏈，故必須有引物才能開始復(fù)制，如果DNA復(fù)制不需要引物，復(fù)制的產(chǎn)物就無特異性，即不能針對(duì)目的基因進(jìn)行選擇性的復(fù)制；大多數(shù)生物體內(nèi)DNA復(fù)制的引物是RNA片段，延伸后被修剪，體外是DNA片段，無須剪切加工，可直接保留在復(fù)制的子鏈中。

②復(fù)性時(shí)，為什么只提引物與DNA配對(duì)結(jié)合，原本就配對(duì)結(jié)合的母鏈不再相互配對(duì)結(jié)合了嗎？設(shè)計(jì)理念及解析：促進(jìn)學(xué)生形成發(fā)散思維，全面分析和考慮問題的意識(shí)，以中立的眼光看待教材所傳授的知識(shí)和理論，主動(dòng)對(duì)其進(jìn)行分析和評(píng)判；母鏈應(yīng)該可以配對(duì)結(jié)合，但在配對(duì)結(jié)合前，首先需要相遇碰撞，而引物的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過模板的數(shù)量，因此，母鏈之間相遇配對(duì)的機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于引物與母鏈相遇配對(duì)的機(jī)會(huì)，故作為模板的DNA鏈更容易與引物相遇配對(duì)，在循環(huán)的后期，反應(yīng)體系中有大量的DNA分子，相互配對(duì)結(jié)合的機(jī)會(huì)增加，但其配對(duì)結(jié)合后，就不能延伸復(fù)制，這可能是PCR反應(yīng)中，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加并不完全符合指數(shù)形式（2n），隨著循環(huán)次數(shù)的增加，產(chǎn)物量的變化曲線逐漸由指數(shù)形式轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性形式的原因之一。

③能否直接根據(jù)目的基因兩側(cè)的堿基序列來設(shè)計(jì)引物，如把上游引物設(shè)計(jì)成能與“GTACGAG”配對(duì)的5'" CATGCTC" 3'？引物的長(zhǎng)度選擇對(duì)提高其特異性有何意義？設(shè)計(jì)理念及解析：引導(dǎo)學(xué)生基于觀察和數(shù)據(jù)分析理解PCR引物的設(shè)計(jì)原理；根據(jù)引物的特異性要求，引物配對(duì)區(qū)通常位于DNA的序列保守區(qū)，DNA母鏈上如果有兩個(gè)以上的引物配對(duì)區(qū)，降低了擴(kuò)增的特異性，會(huì)出現(xiàn)多種類型的產(chǎn)物，理論上可以選擇與目的基因兩側(cè)的堿基序列配對(duì)的短鏈做引物，但如果這個(gè)區(qū)域沒有特異性，就不能使用，故模擬游戲中的上游引物不能設(shè)計(jì)成5'" CATGCTC" 3'，因?yàn)槟康幕騼?nèi)部也存在該序列的配對(duì)區(qū)；增加引物的長(zhǎng)度，可提高引物的特異性，根據(jù)排列組合的原理，n個(gè)堿基排列組合后，出現(xiàn)相同鏈的概率是（1/4）n，n數(shù)越大，相同的概率就越小，因此，適當(dāng)增加引物分子的長(zhǎng)度，可以更好地保證引物與DNA分子的結(jié)合位只有一個(gè)，" PCR中實(shí)際運(yùn)用的引物長(zhǎng)度一般是15―30個(gè)堿基序列。

2.3" 復(fù)制延伸階段

常規(guī)問題：①生物體內(nèi)的酶發(fā)揮作用的適宜溫度一般是多少？②通常的酶，當(dāng)溫度超過90℃時(shí)，還有活性嗎？本實(shí)驗(yàn)中用的酶有什么特點(diǎn)？

拓展問題：①如果沒有發(fā)現(xiàn)耐高溫的DNA聚合酶，PCR技術(shù)能發(fā)明嗎？設(shè)計(jì)理念及解析：引導(dǎo)學(xué)生形成科學(xué)發(fā)現(xiàn)與技術(shù)進(jìn)步相輔相成的印記，PCR技術(shù)的發(fā)明，是科學(xué)家基于耐高溫的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)，是對(duì)新現(xiàn)象的深度思考并拓展運(yùn)用的創(chuàng)新性成果。1976年，我國(guó)臺(tái)灣科學(xué)家錢嘉韻，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的耐高溫TaqDNA聚合酶，如果沒有耐高溫DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)，PCR技術(shù)中的“變性―復(fù)性―延伸”就不能自動(dòng)循環(huán)進(jìn)行，變性過程中的高溫會(huì)破壞酶的活性，每次循環(huán)復(fù)性后，均需要重新加入DNA聚合酶，復(fù)制才能繼續(xù)進(jìn)行。②如果沒有耐高溫的DNA聚合酶，你有在原有技術(shù)基礎(chǔ)上的改進(jìn)設(shè)想嗎？設(shè)計(jì)理念及解析：培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和思維，對(duì)于這個(gè)主觀分析題，可以有多種思路，以合理性為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)榧夹g(shù)可以發(fā)展，如設(shè)想反應(yīng)器改進(jìn)成自動(dòng)循環(huán)加樣式，在每次復(fù)性后，加入新的DNA聚合酶，等等。

2.4" 總結(jié)階段

常規(guī)問題：三次循環(huán)后，DNA分子有幾種類型？變性后的單鏈?zhǔn)遣皇峭耆粯樱坑袔追N類型？各有多少個(gè)？

拓展問題：①反應(yīng)結(jié)束后，怎樣才能獲得擴(kuò)增的DNA分子？設(shè)計(jì)理念及解析：承上啟下，引導(dǎo)學(xué)生關(guān)注PCR產(chǎn)物的后續(xù)處理技術(shù)并運(yùn)用多學(xué)科的知識(shí)理解技術(shù)原理，通過凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行電泳，在電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)下，DNA分子在凝膠中發(fā)生移動(dòng)，分子量大的跑得慢，分子量小的跑得快，在凝膠上分層排列，染色后可顯示DNA條帶（圖4，p40）。

②在真實(shí)的PCR反應(yīng)中，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加并不完全符合指數(shù)形式（2n），隨著循環(huán)次數(shù)的增加，產(chǎn)物量的變化曲線逐漸由指數(shù)形式轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性形式；30次循環(huán)后，實(shí)際擴(kuò)增的數(shù)量為230的千分之一左右[3]，有人認(rèn)為這是由于“引物和底物的消耗，酶活力下降等因素引起的”，你認(rèn)同這種解釋嗎？請(qǐng)用數(shù)據(jù)說明，并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。設(shè)計(jì)理念及解析：引導(dǎo)學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的理論和觀點(diǎn)進(jìn)行針對(duì)性的驗(yàn)證，讓學(xué)生根據(jù)相關(guān)教材提供的反應(yīng)體系配方進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，計(jì)算引物、底物的加樣數(shù)目（數(shù)目=摩爾濃度€滋寤齹裝⒎さ侶蕹Ｊ⒏葑詈笠淮窩泛蟛鍤康睦礪壑擔(dān)？n）測(cè)算共消耗了多少引物和底物，求得剩余的引物和底物數(shù)目，來評(píng)判“引物和底物的消耗”是不是復(fù)制產(chǎn)物下降的原因，如以人教版高中生物教材選擇性必修三提供的配方為例，反應(yīng)體系中，上、下游引物加樣的濃度均為20 mol/L，量均為2.5 L，計(jì)算求得上、下游引物數(shù)量為3.01€？013個(gè)，30次循環(huán)后，產(chǎn)物的理論值為230" =1.07€？09，消耗的引物數(shù)目等于產(chǎn)物數(shù)目，通過比較這兩個(gè)數(shù)值，做出評(píng)價(jià)；關(guān)于“酶活力的下降”問題可結(jié)合定量熒光PCR技術(shù)，作為探究性課題設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探究，或讓酶在加樣前先單獨(dú)循環(huán)一定次數(shù)或增加酶的加樣量或在反應(yīng)后期重新加入酶等不同處理方式進(jìn)行探究。

③如果擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳帶上出現(xiàn)幾條粗帶，可能的原因是什么？設(shè)計(jì)理念及解析：引導(dǎo)學(xué)生分析和計(jì)算多次循環(huán)復(fù)制后產(chǎn)物的類型和數(shù)量，知悉PCR擴(kuò)增可能會(huì)出現(xiàn)的異常結(jié)果；最后一次循環(huán)后的DNA分子片段有5種類型（圖5）：母鏈與子一代鏈組合型2種，子一代鏈與子二代鏈組合型2種，等長(zhǎng)鏈組合型1種。其中兩鏈等長(zhǎng)的DNA片段數(shù)量最多，在電泳帶上以粗帶（或亮帶）顯示，其他類型因數(shù)量極少在電泳帶上不顯示，或因堿基對(duì)的數(shù)目接近而混在一起，如果出現(xiàn)多條粗帶，原因可能是引物的專一性不高，其他基因也被擴(kuò)增了，也可能是需要擴(kuò)增的基因被污染了，有其他物種的相似基因混入。

3" 結(jié)語(yǔ)

通過游戲及問題，引導(dǎo)學(xué)生模擬無直接觀感的PCR反應(yīng)過程，積極主動(dòng)地參與教學(xué)活動(dòng)，在游戲合作中學(xué)習(xí)，在問題中思考探究，實(shí)現(xiàn)手、腦并用，抽象思維與形象思維協(xié)同活動(dòng)，可促進(jìn)學(xué)生對(duì)知識(shí)的記憶、理解及遷移運(yùn)用，對(duì)PCR反應(yīng)的過程加以深度思考，不僅知道具體的反應(yīng)步驟，還要知道為什么這樣做，并引導(dǎo)學(xué)生運(yùn)用多學(xué)科知識(shí)分析原因和結(jié)果，以中立的眼光看待科學(xué)理論，促進(jìn)其科學(xué)素養(yǎng)的提升，讓學(xué)習(xí)效果實(shí)現(xiàn)質(zhì)的飛躍。另外，因完成完整的PCR實(shí)驗(yàn)存在較多困難，有些學(xué)校可能缺少相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，即使具備實(shí)驗(yàn)設(shè)備，很多教師也會(huì)因?qū)嶒?yàn)過程耗時(shí)長(zhǎng)、成本高等原因而放棄開設(shè)該實(shí)驗(yàn)[4]。因此，通過游戲模擬PCR反應(yīng)過程，對(duì)一些設(shè)備或經(jīng)費(fèi)欠缺的學(xué)校，也是一種較好的補(bǔ)充方式。

參考文獻(xiàn)

[1] 袁婺洲.基因工程（2版）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2019：95-96.

[2] 鄭集，陳鈞輝.普通生物化學(xué)（4版）[M].北京：高等教育出版社，2007：535.

[3] 趙亞華.基礎(chǔ)分子生物學(xué)教程（2版）[M].北京：科學(xué)出版社，2006：483-484.

[4] 薛琪.基于生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)的PCR創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[J].生物學(xué)通報(bào)，2022，57（11）：51-53.