高危型HPV陽性宮頸癌組織中ALKBH5和PAK5的表達水平及臨床意義

摘要：目的 分析高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）陽性宮頸癌組織中RNA脫甲基酶ALKB同源物5（ALKBH5）、p21活化激酶5（PAK5）的表達，并探討兩者的臨床意義。方法 選取96例HR-HPV陽性宮頸癌患者為研究對象，采用實時熒光定量PCR、免疫組化染色及Western blot分析癌組織和癌旁組織中ALKBH5、PAK5 mRNA和蛋白表達。比較不同臨床病理特征HR-HPV陽性宮頸癌患者ALKBH5、PAK5蛋白表達差異。多因素Cox回歸分析HR-HPV陽性宮頸癌患者死亡的影響因素。Kaplan-Meier曲線分析ALKBH5、PAK5蛋白表達對患者5年生存率的影響。結果 實時熒光定量PCR、免疫組化染色及Western blot結果顯示HR-HPV陽性宮頸癌患者癌組織ALKBH5、PAK5 mRNA和蛋白表達水平均高于癌旁組織（P＜0.05）。FIGO分期ⅡA期、淋巴結轉移的HR-HPV陽性宮頸癌患者癌組織中ALKBH5、PAK5 陽性表達率升高（P＜0.05）。Cox 回歸分析結果顯示ALKBH5 陽性（HR=1.467，95%CI：1.104～1.949）、PAK5陽性（HR=1.435，95%CI：1.093～1.884）、FIGO分期ⅡA期（HR=1.435，95%CI：1.065～1.933）、淋巴結轉移（HR=1.652，95%CI：1.053～2.593）是影響HR-HPV陽性宮頸癌患者預后的危險因素。ALKBH5陽性組5年累積生存率［72.58%（45/62） vs. 91.18%（31/34）］低于陰性組（Log-rank χ2=4.481，P=0.034）。PAK5陽性組5年累積生存率［71.67%（43/60） vs. 91.67%（33/36）］低于陰性組（Log-rank χ2=4.153，P=0.043）。結論 ALKBH5、PAK5在HR-HPV陽性宮頸癌中表達顯著上調，兩者均與患者不良臨床病理特征有關，有助于評估患者的預后。

關鍵詞：人乳頭瘤病毒；宮頸腫瘤；危險因素；預后；AlkB同源蛋白5，RNA脫甲基酶；p21活化激酶類

中圖分類號：R737.33 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20242343

宮頸癌是嚴重影響女性健康的惡性腫瘤，2020年全世界發病達60.4萬人，死亡達34.2萬人［1］。宮頸癌起源于正常宮頸上皮細胞，高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HR-HPV）16、18及31 等亞型的持續感染是宮頸癌發生的驅動因素［2］。去甲基化酶ALKB 同源蛋白5（a-ketoglutarate-dependent dioxygenase homolog 5，ALKBH5）是一種N6 甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）去甲基化酶，該基因位于染色體17p11.2，以含有m6A的單鏈RNA為底物，使靶向RNA去甲基化，參與精子發生、滋養細胞侵襲及成骨等生物學過程［3］。研究顯示，ALKBH5在非小細胞肺癌、上皮性卵巢癌等多種惡性腫瘤中表達上調，能夠降低NANOG mRNA的甲基化水平，促進癌細胞的侵襲和淋巴轉移［4］。p21活化激酶5（p21-activated kinase 5，PAK5）屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，參與細胞增殖和細胞存活信號的激活、細胞骨架動力學調節等過程［5］。研究表明，肺鱗癌中PAK5高度表達，其能磷酸化激活性別決定區Y框蛋白2，促進癌細胞干細胞樣表型的形成，促進腫瘤增殖和轉移［6］。既往有學者在細胞實驗中發現，HPV E6/7 癌蛋白能夠上調ALKBH5的表達，繼而增加PAK5 mRNA的穩定性，促進宮頸癌細胞的增殖［7］。但目前HR-HPV陽性的宮頸癌患者癌組織中ALKBH5、PAK5的表達及臨床意義尚不明確。本研究旨在通過分析HR-HPV陽性的宮頸癌中ALKBH5、PAK5的表達水平，以期探究其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2017年1月—2019年4月榆林市第一醫院婦產科診治的96例宮頸癌患者資料。納入標準：（1）經宮頸活檢病理學檢查確診為宮頸癌。（2）HR-HPV檢測陽性≥1年。（3）初次住院治療。（4）臨床病理相關資料完整。排除標準：（1）妊娠期或哺乳期。（2）有其他惡性腫瘤病史。（3）術前已行新輔助化療或放療。（4）既往有宮頸上皮內瘤變病史或宮頸感染性疾病。年齡31～79歲，平均（55.72±8.64）歲；宮頸鱗癌60例，宮頸腺癌36例；高中分化44例，低分化52例；國際婦產科聯盟2009年FIGO分期：ⅠA-ⅠB期40例，ⅡA期56例；淺肌層浸潤51例，深肌層浸潤45例；淋巴結轉移37例。本研究取得患者和家屬知情同意，并獲得醫院倫理委員會審核（批號：倫審-科研-第2016052號）。

1.2 研究方法

1.2.1 組織獲取 將術中獲取的約150 mg宮頸癌癌組織和癌旁組織（距離癌組織邊緣2 cm以上，并經病理學檢查明確為正常宮頸組織）標本分為3部分，一部分置于4%多聚甲醛中固定12 h，用于后續免疫組化染色；其余部分置于液氮中保存，分別用于實時熒光定量PCR（qPCR）和Western blot檢測。

1.2.2 qPCR檢測ALKBH5、PAK5 mRNA表達 將宮頸癌組織和癌旁組織標本從液氮罐取出，取100 mg組織研磨器進行研磨，TRIzo1溶液提取RNA。將RNA逆轉錄為cDNA后進行PCR檢測。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。ALKBH5 引物： 上游5′-CGGCGAAGGCTACACTTACG-3′，下游5′-CCACCAGCTTTTGGATCACCA-3′；PAK5 引物：上游5′-AGTTCCAGTTCAAGCCTATTCG-3′，下游5′-TGAGCACAGTCA CGCTTCC-3′；GAPDH 引物：上游5′-ATGCACCCCG GTTGGAAAC-3′，下游5′-GACTTGCGCCAGTAGTTCTCA-3′。總反應體系20 μL：上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，SYBR Master Mix（2×）10 μL，cDNA 1 μL，RNase-free water 8.2 μL。反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40 個循環。2-ΔΔCt法分析組織ALKBH5、PAK5 mRNA的相對表達量。

1.2.3 免疫組化染色檢測ALKBH5、PAK5蛋白表達 取癌和癌旁組織標本，多聚甲醛固定24 h后，依次經脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋后，4 μm層厚切片。按照常規免疫組化染色步驟進行染色，依次經脫蠟、水化、過氧化氫阻斷、檸檬酸溶液中抗原熱修復、5% 羊血清封閉，ALKBH5、PAK5（英國Abcam公司）一抗孵育16 h，稀釋比均為1∶50。DAB顯色，蘇木素染色1 min，依次脫水、透明后封片。采用Image ProPlus6.0對切片的組織進行圖像分析。染色強度無染色0分，淺黃色1分，棕褐色2分。染色面積＜25%為0分，25%～50%為1分，＞50%為2分。染色強度和面積的乘積＜2分為陰性，≥2分為陽性。

1.2.4 Western blot檢測ALKBH5、PAK5蛋白表達 將癌組織及癌旁組織（4對）超聲波室溫勻漿0.5～1 min后，加入RIPA裂解液，4 ℃、13 000×g離心15 min，取上清液作為樣品。制備電泳凝膠，恒壓120 V，30 min，進行SDS-PAGE，電泳結束后轉膜（濕轉法），恒流90 mA轉移1.5 h。加入ALKBH5、PAK5蛋白一抗（稀釋比例1∶1 000），4 ℃放置12 h。加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗，室溫孵育2 h。加入顯色液，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。ECL法顯色，經URP Image store7500凝膠成像分析系統掃描分析條帶灰值度，以GAPDH為內參，計算ALKBH5、PAK5蛋白相對灰度值。

1.2.5 隨訪 由隨訪專員通過門診及電話對術后患者進行5年的定期隨訪，術后2年內每3～6個月隨訪1次，3～5年每年隨訪1次。隨訪內容為體格檢查、B超及CT等影像學檢查。記錄患者的死亡時間及原因，腫瘤復發及轉移情況等。隨訪終點為患者因宮頸癌腫瘤進展導致的死亡或者隨訪時間結束（2024年4月1日）。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0進行數據分析。計量數據以x±s表示，組間比較采用t 檢驗。計數資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier曲線比較不同預后患者5年生存率。兩變量間相關性分析采用Pearson相關，多因素Cox回歸分析患者預后的影響因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌組織和癌旁組織中ALKBH5、PAK5 mRNA表達 HR-HPV 陽性宮頸癌患者癌組織ALKBH5mRNA（3.01±0.42）和PAK5 mRNA（3.12±0.43）表達均高于癌旁組織（ALKBH5：0.91±0.25，PAK5：0.98±0.31；t 分別為42.097、39.555，P＜0.05）。癌組織中ALKBH5 mRNA 與PAK5 mRNA 表達呈正相關（r=0.765，P＜0.01）。

2.2 HR-HPV陽性宮頸癌及癌旁組織中ALKBH5、PAK5蛋白表達 免疫組化染色結果顯示，ALKBH5和PAK5蛋白定位于細胞核和細胞漿，見圖1。癌組織中ALKBH5、PAK5表達陽性率為64.58%（62/96）和62.50%（60/96），高于癌旁組織的5.21%（5/96）和6.25%（6/96），差異有統計學意義（χ2分別為74.485、67.325，均P＜0.05）。Western blot 結果顯示，ALKBH5、PAK5 蛋白相對表達量高于癌旁組織（ALKBH5：1.67±0.34 vs. 0.68±0.21，PAK5：1.83±0.42 vs. 0.53±0.12），差異有統計學意義（n=4，t 分別為4.955、5.952，均P＜0.05），見圖2。

2.3 不同臨床病理特征的宮頸癌癌組織中的ALKBH5、PAK5蛋白表達比較 FIGO分期ⅡA期、有淋巴結轉移患者癌組織中ALKBH5、PAK5陽性率較高（均P＜0.05），見表1。

2.4 HR-HPV陽性宮頸癌患者預后的影響因素分析 以患者預后為因變量（存活=0，死亡=1），以FIGO分期（ⅡA期=1，ⅠA-ⅠB期=0）、淋巴結轉移（有=1，無=0）、ALKBH5（陽性=1，陰性=0）、PAK5（陽性=1，陰性=0）為自變量，自變量經共線性檢測，方差膨脹因子（VIF）均在2～4之間，可納入分析。結果顯示，ALKBH5 陽性、PAK5 陽性、FIGO 分期ⅡA期、有淋巴結轉移是HR-HPV陽性宮頸癌患者死亡的危險因素，見表2。

2.5 ALKBH5、PAK5 蛋白表達與HR-HPV 陽性宮頸癌患者預后的關系 患者隨訪中，死亡20例，5年累積生存率為79.17%（76/96）。ALKBH5陽性組5年累積生存率［72.58%（45/62）］低于ALKBH5陰性組［（91.18%（31/34）， Log-rank χ2=4.481，P=0.034）］。PAK5陽性組5年累積生存率［71.67%（43/60）］低于PAK5陰性組［（91.67%（33/36），Log-rank χ2=4.153，P=0.043）］。見圖3。

3 討論

HR-HPV 的持續感染可導致宮頸癌的發生，HR-HPV的致癌基因包括E5、E6和E7，HR-HPV的持續感染能夠促進腫瘤細胞轉化，是宮頸上皮內瘤變發展為宮頸癌的主要驅動因素［8］。目前用于評估HR-HPV宮頸癌預后的方法有限，影像學檢査、血腫瘤標志物檢測等存在敏感性低、特異性差等問題，故臨床應用存在不足［9］。

ALKBH5是AlkB家族的9個成員之一，其作為一種依賴亞鐵和2-氧戊二酸的核酸加氧酶，通過氧化去甲基化介導N-烷基化核苷酸堿基，影響mRNA的加工、輸出和穩定性，調控細胞周期、細胞凋亡及RNA代謝等生物學過程［10］。有研究表明，ALKBH5在膠質瘤中表達上調，其能誘導M2型巨噬細胞的募集，促進膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲［11］。本研究中，HR-HPV陽性宮頸癌組織中ALKBH5表達上調，提示ALKBH5可能參與HR-HPV 陽性宮頸癌的發病過程。分析其機制，HPV E6/7可通過上調轉錄因子E2F1的表達來促進ALKBH5的表達，進一步加速宮頸癌細胞的侵襲和轉移［7］。本研究中，FIGO分期ⅡA期、有淋巴結轉移的癌組織中ALKBH5陽性表達率較高，表明ALKBH5參與促進HR-HPV陽性宮頸癌的腫瘤進展。這可能與ALKBH5促進宮頸癌細胞中CircCCDC134的m6A修飾，進一步促進癌細胞的增殖和轉移有關［12］。此外，有研究者證實HPV陽性的宮頸癌細胞中長鏈非編碼RNA MALAT1高表達，其作為分子支架結合miR-141-3p，上調ALKBH5 mRNA的表達，導致基質金屬蛋白酶2/9表達增加，促進癌細胞遷移和侵襲［13］。本研究中，ALKBH5 陽性宮頸癌患者的總生存率較陰性患者差，一方面是ALKBH5的表達能夠促進宮頸癌細胞表面程序性死亡因子配體1（PD-L1）及漿細胞和調節性T細胞（Tregs）的免疫浸潤，導致腫瘤免疫逃逸，引起患者不良預后［14］。另一方面，卵巢癌中ALKBH5能夠結合同源盒基因家族A10（HOXA10），介導Jacus蛋白酪氨酸激酶2（JAK2） mRNA m6A的去甲基化，激活JAK2/信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）信號通路，增強卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性，增加患者術后腫瘤復發和轉移的風險［15］。

PAK5是p21激活激酶家族成員之一，具有高度保守的氨基端相互作用結合域和羧基端激酶域，能夠激活生長因子受體的下游通路，調控包括神經元生長、細胞骨架形成等細胞生理過程。研究發現，PAK5在胃癌［16］中表達異常升高，其能直接磷酸化下游信號因子，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究中，HR-HPV陽性宮頸癌患者癌組織中PAK5表達上調，提示PAK5參與HR-HPV陽性宮頸癌的發生。分析其原因，HR-HPV 陽性宮頸癌中ALKBH5的表達上調介導PAK5 mRNA的m6A去甲基化，增強PAK5 mRNA的穩定性和蛋白表達，促進癌細胞的轉移［7］。本研究中，FIGO分期ⅡA期、有淋巴結轉移的癌組織中PAK5陽性表達率較高，表明PAK5的高表達提示HR-HPV陽性宮頸癌患者疾病進展。分析其機制，PAK5的表達上調能夠促進宮頸癌細胞中特異性核基質結合區合蛋白1（SATB1）蛋白Ser47 位點的磷酸化激活，促進上皮間質轉化（EMT）的發生［17］。另有研究發現，乳腺癌中PAK5的高表達能夠磷酸化凋亡誘導因子（AIF）的Thr281位點，抑制AIF/輸入蛋白（importin）α3復合物的形成，降低線粒體膜通透性和增加膜電位，抑制癌細胞線粒體釋放AIF，導致腫瘤細胞的過度增殖［18］。本研究中，PAK5陽性的HR-HPV陽性宮頸癌患者預后較差，分析其原因，癌細胞中PAK5的表達升高能夠增強癌細胞中β-連環蛋白（β-catenin）的磷酸化和核轉位，增加多藥耐藥蛋白ABCB1的轉錄活性，增強癌細胞對化療及靶向治療的耐藥性［19］。本研究癌組織中ALKBH5 mRNA與PAK5 mRNA表達呈正相關，可能是由于ALKBH5的表達引起PAK5 mRNA去甲基化，使PAK5 mRNA 的穩定性增加，導致PAK5蛋白表達的上調［7］。

綜上所述，ALKBH5、PAK5在HR-HPV陽性宮頸癌中表達顯著上調，與患者不良臨床病理特征有關，二者有助于評估HR-HPV陽性宮頸癌患者的預后。本研究樣本量較小，未能研究不同高危HPV亞型患者癌組織中ALKBH5、PAK5的表達差異；此外ALKBH5、PAK5能否成為HR-HPV陽性宮頸癌患者預后分層的標志物，亟待設計前瞻性、多中心的臨床試驗深入研究。

參考文獻

［1］ SUNG H，FERLAY J，SIEGEL R L，et al. Global cancer statistics

2020：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide

for 36 cancers in 185 countries［J］. CA Cancer J Clin，2021，71（3）：

209-249. doi：10.3322/caac.21660.

［2］ YU L，MAJERCIAK V，ZHENG Z M. HPV16 and HPV18 genome

structure，expression，and post-transcriptional regulation［J］. Int J

Mol Sci，2022，23（9）：4943-4956. doi：10.3390/ijms23147903.

［3］ CHEN J，XU C，YANG K，et al. Inhibition of ALKBH5 attenuates I/

R-induced renal injury in male mice by promoting CCL28 m6A

modification and increasing Treg recruitment［J］. Nat Commun，

2023，14（1）：1161-1172. doi：10.1038/s41467-023-36747-y.

［4］ QU J，YAN H，HOU Y，et al. RNA demethylase ALKBH5 in

cancer：from mechanisms to therapeutic potential［J］. J Hematol

Oncol，2022，15（1）：8-16. doi：10.1186/s13045-022-01224-4.

［5］ PAN X，LIU D，YING M，et al. PAK5 is a potential target in

myelodysplastic syndrome through interacting with LMO2 and

GATA1［J］. Cell Mol Biol （Noisy-le-grand），2022，68（9）：77-85.

doi：10.14715/cmb/2022.68.9.12.

［6］ BAO Z，JI W，YANG Y，et al. PAK5 promotes the cell stemness

ability by phosphorylating SOX2 in lung squamous cell carcinomas

［J］. Exp Cell Res，2020，395（2）：1121-1137. doi：10.1016/j.

yexcr.2020.112187.

［7］ HUO F C，ZHU Z M，DU W Q，et al. HPV E7-drived ALKBH5

promotes cervical cancer progression by modulating m6A

modification of PAK5［J］. Pharmacol Res，2023，195（9）：1068-

1083. doi：10.1016/j.phrs.2023.106863.

［8］ SU X，LIU P，ZHAO H，et al. Impact of HR-HPV infection on

oncological outcomes in early cervical cancer［J］. Front Oncol，

2023，13（7）：1264-1274. doi：10.3389/fonc.2023.1264114.

［9］ 陸璐，余慧萍，成建. HPV mRNA、DNA 檢測對宮頸細胞學

ASCUS分流診斷價值的Meta分析［J］. 天津醫藥，2020，48（12）：

1223-1229. LU L，YU H P，CHENG J. The value of HPV E6/E7

mRNA test and HPV DNA test in triage of patients with atypical

squamous cells：a systematic review and Meta-analysis［J］. Tianjin

Med J，2020，48（12）：1223-1229. doi：10.11958/20200653.

［10］WEI G. RNA m6A modification，signals for degradation or

stabilisation？［J］. Biochem Soc Trans，2024，52（2）：707-717. doi：

10.1042/BST20230574.

［11］WEI C，WANG B，PENG D，et al. Pan-cancer analysis shows that

ALKBH5 is a potential prognostic and immunotherapeutic biomarker

for multiple cancer types including gliomas［J］. Front Immunol，2022，

13（7）：8495-8506. doi：10.3389/fimmu.2022.944740.

［12］LIANG L，ZHU Y，LI J， et al. ALKBH5-mediated m6A

modification of circCCDC134 facilitates cervical cancer metastasis

by enhancing HIF1A transcription［J］. J Exp Clin Cancer Res，

2022，41（1）：261-278. doi：10.1186/s13046-022-02462-7.

［13］WU S，LIU L，XU H，et al. The involvement of MALAT1-ALKBH5

signaling axis into proliferation and metastasis of human

papillomavirus-positive cervical cancer［J］. Cancer Biol Ther，

2023，24（1）：2249-2264. doi：10.1080/15384047.2023.2249174.

［14］JI H，ZHANG J A，LIU H，et al. Comprehensive characterization of

tumor microenvironment and m6A RNA methylation regulators and its

effects on PD-L1 and immune infiltrates in cervical cancer［J］. Front

Immunol，2022，13（9）：9761-9777. doi：10.3389/fimmu.2022.976107.

eCollection 2022.

［15］NIE S，ZHANG L，LIU J，et al. ALKBH5-HOXA10 loop-mediated

JAK2 m6A demethylation and cisplatin resistance in epithelial

ovarian cancer［J］. J Exp Clin Cancer Res，2021，40（1）：284-293.

doi：10.1186/s13046-021-02088-1.

［16］劉杰，劉樹青，梁鳳，等. LncRNA SNHG15/miR-123/PAK5 軸通

過自噬對胃癌細胞活性及血管生成的影響［J］. 解剖學研究，

2023，45（3）：242-250. LIU J， LIU S Q，LIANG F， et al.

Mechanism of LncRNA SNHG15/miR-123/PAK5 axis regulating

autophagy on gastric cancer cell activity and angiogenesis［J］.

Anatomy Research，2023，45（3）：242-250. doi：10.20021/j.

cnki.1671-0770.2023.03.09.

［17］HUO F C，PAN Y J，LI T T，et al. PAK5 promotes the migration

and invasion of cervical cancer cells by phosphorylating SATB1［J］.

Cell Death Differ，2019，26（6）：994-1006. doi：10.1038/s41418-

018-0178-4.

［18］XING Y，LI Y，HU B，et al. PAK5-mediated AIF phosphorylation

inhibits its nuclear translocation and promotes breast cancer

tumorigenesis［J］. Int J Biol Sci，2021，17（5）：1315-1327. doi：

10.7150/ijbs.58102.

［19］LI T T，MOU J，PAN Y J，et al. MicroRNA-138-1-3p sensitizes

sorafenib to hepatocellular carcinoma by targeting PAK5 mediated

beta-catenin/ABCB1 signaling pathway［J］. J Biomed Sci，2021，28

（1）：56-68. doi：10.1186/s12929-021-00752-4.

（2024-12-24收稿 2025-02-11修回）

（本文編輯 胡小寧）