超聲引導下導絲損傷主動脈瓣誘導鈣化性主動脈瓣狹窄大鼠動物模型研究

摘要目的：探討直接機械損傷對大鼠主動脈瓣的影響。方法：大鼠適應性飼養1周后隨機分為假手術組、輕度模型組、中度模型組、重度模型組，每組10只。在超聲引導下，將導絲經右頸總動脈置入SD大鼠左心室，造成主動脈瓣損傷。通過超聲檢測各組大鼠左室心功能和主動脈瓣狹窄情況；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察瓣膜厚度變化；茜素紅染色檢測瓣膜鈣鹽沉積情況；免疫組織化學染色方法檢測各組標本中巨噬細胞、骨橋蛋白（OPN）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）陽性細胞表達情況；蛋白免疫印跡法（WestemBlot）檢測各組骨形態發生蛋白-2（BMP-2）表達情況。結果：造模8周后，輕度模型組、中度模型組、重度模型組左室射血分數（LVEF）左室短軸縮短率（LVFS）和主動脈瓣有效瓣口面積（AVA）降低，主動脈瓣峰值流速、主動脈瓣跨瓣壓力梯度（AVPG）增加，以重度模型組最為明顯（ Plt;0.05 ）。與假手術相比，輕度模型組、中度模型組、重度模型組大鼠主動脈瓣膜增厚，鈣鹽沉積增多， CD₆₈ 浸潤增多，OPN和 α -SMA陽性細胞表達增多，BMP2蛋白表達增多，其中以重度模型組變化最為顯著（ Plt;0.05 。結論：導絲損傷大鼠主動脈瓣鈣化模型模擬了人的主動脈瓣狹窄特征，包括動脈瓣峰值流速和AVPG增加、AVA縮小、主動脈瓣膜增厚、纖維化、巨噬細胞浸潤和鈣鹽沉積。

AbstractObjective：Toestablishtheratmodelwithaorticvalvestenosisbydirectmechanicalinjuryontheaorticvalveofrats.ethods： Afteroneweekofadaptiverearing，theratswererandomlydividedintotheshamoperationgroup，themildmodelgroup，themoderate modelgroupandtheseveremodelgroup，with1atsineachgroup.Underutrasoundguidance，theguidewirewasinsertedintotheleft ventricleofSDatstouhtgmmorotidteyausigortialeijulfttriculaadacfutiodle stenosisofratsineachgroupweredetectedbyutrasound.Hematoxylin-eosin（HE）stainingwasusedtoobservethechangesinvalve thicknesslzaridaningasusedttectcalcisatdepositioninles.exprsioofacropagesteooi）， andαsmooth muscleactnamp;-SMA）positivecellinspecimensof eachgroupwasdetected byimmunohistochemical stainingmethod. Theexpressionof bonemorphogeneticprotein-2（BMP-2）ineachgroupwasdetectedbyWestemBlot.Results：Eightweksafter modeling，inthemildmodelgroupmoderatemodelgroupandseveremodelgroup，theleftvenricularejectionfraction（LVF），left ventricularoaisoregate）ndtiotfldcresdiltakortlfoloi andaortic valve cross-valve pressure gradient（AVPG） increased，with severe injury（ Plt;0.05 .Comparedwithshamoperation，theaortic valvesof ratsinthemildmodelgroup，moderatemodelgroup，andseveremodelgroup，thickness，calciumsaltdepostionicreased， CD₆₈ infiltration increased，the expressions of OPN and α -SMA positive cells increased，and the expression of BMP2 protein increased，and the changes insevere injurywere the mostsignificant（ Plt;0.05） .Conclusion：The rat model of aorticvalvecalcification by guidewire injury simulatedtheharacteristisofumanaorticalvestenosis，cludingincreasedpeakveloitandAVGofteaterialveeduced effectiverateofttkftiossoiatdo

Keywordscalcific aortic valve stenosis;Ultrasound; guide wire damage;animal model

鈣化性主動脈瓣狹窄（calcifiedaorticvalvestenosis，CAVS）是老齡化社會面臨的主要健康問題，可導致心力衰竭、心律失常等，嚴重威脅人類健康及生命。我國中老年人群瓣膜鈣化發生率為 12.5% ，其中主動脈瓣鈣化占 94.4%^[1] ，且隨著年齡的增長，其鈣化部位及程度也逐漸增加[2]。CAVS的自然發展是緩慢和漸進的，其特點是經歷了一個漫長的無癥狀期，但一旦病人出現呼吸困難或暈厥等癥狀就會危及生命[3]。目前，尚無能有效改變疾病進展的醫學干預措施。CAVS病人僅在晚期階段出現癥狀或左心室功能不全時采用外科瓣膜置換4，由于存在并發癥的風險，并不是所有病人都適合進行該手術。因此，探明其發病機制，尋找早期干預手段，延緩瓣膜鈣化性病變進展甚至逆轉病變，具有重大的社會意義和經濟價值。

動物模型是研究CAVS病理生理學機制和潛在治療措施的重要工具。最早報道的一種基于飲食的研究CAVS的動物模型為小鼠CAVS模型[5]。最常用的小鼠基因敲除模型為低密度脂蛋白受體（ ∠DLR^-1- 敲除小鼠[。除了飲食和基因敲除小鼠模型之外，還有在超聲心動圖引導下經由右頸總動脈將彈簧導絲插入左心室中，并用導絲損傷瓣膜小葉來誘導CAVS瓣膜損傷模型[7]。這些都有助于了解CAVS的作用機制。然而，這些飲食誘導模型通常存在造模周期長、經濟效益低且誘導模型不一致等問題。且導絲損傷小鼠模型存在操作困難、損傷過程中死亡率高、不易觀察等問題。因此，尋找一種周期較短、可操作性較高、成功率較高的動物模型尤為重要。本研究試圖建立導絲機械損傷誘導的CAVS大鼠模型，并根據損傷程度不同建立輕度、中度和重度模型。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物

10～12 周齡雄性SD大鼠40只，體質量 （250±30）g 購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2019-0008]，在河南中醫藥大學動物實驗中心無特定病原體（SPF）級環境飼養，室內通風、溫度和濕度良好。本研究經河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號：IACUC-202303020）。

1.1.2 試劑與材料

蘇木素-伊紅（HE）染色液（Servicebio），茜素紅染色液（Servicebio），anti-CD68抗體（Servicebio），anti-a-SMA抗體（Servicebio），anti-骨橋蛋白（OPN）抗體（Servicebio），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（Servicebio），骨形態發生蛋白-2（BMP-2）抗體（Servicebio）。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的制備及分組

大鼠適應性飼養1周后隨機分為假手術組、輕度模型組、中度模型組、重度模型組，每組10只。大鼠造模前禁食水12h，用 1% 的戊巴比妥鈉（ 30（9/169） 腹腔注射麻醉。充分麻醉后，固定大鼠四肢，脫掉毛發，碘伏消毒。于右頸部縱向剪約2cm切口，用彎鑷鈍性分離出右頸總動脈，使其充分暴露。分離出的動脈穿3根結扎線，結扎遠心端。右手持留置針先45進針后平行血管推進右頸總動脈，結扎線固定留置針后拔出針芯。將導絲沿留置針在超聲引導下緩慢送入主動脈瓣膜處。對于輕度損傷，使用帶有短且焊接尖端的直導絲（AbbottHI-TORQUE 0.014^′′ ），前后移動100次后再以每秒2次的速度旋轉200次。對于中度和重度的損傷，使用一根尖端為 30^° 角的常規導絲（ASAHIINTECCMIRACLEbros12），中度損傷前后移動200次后再以每秒2次的速度旋轉400次，重度損傷前后移動300次后再以每秒2次的速度旋轉600次。損傷后，立即使用彩色多普勒超聲評估急性主動脈瓣反流。假手術組以同樣的方式進行，但導絲只插入右頸動脈，而沒有穿過主動脈瓣進人左心室。導絲損傷主動脈瓣膜超聲圖見圖1。

A為輕度損傷超聲圖；B為中/重度損傷超聲圖。LV為左心室；Wire為導絲）

1.2.2 主動脈瓣膜組織的制備

造模8周后麻醉下大量失血法處死大鼠，將心臟與部分主動脈取下，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗心臟后，濾紙擦干，固定于 4% 多聚甲醛，經脫水、石蠟包埋， 4μm 連續切片。

1.3主要觀察指標及其檢測方法

1.3.1 超聲心動圖

超聲心動圖（VINNOD6LAB，飛依諾）檢測大鼠造模前、造模8周時的心功能指標。M型超聲心動圖檢測左室心功能指標，彩色多普勒超聲心動圖檢測主動脈瓣狹窄情況。M型超聲在胸骨旁長軸切面測量左室射血分數（leftventricularejectionfraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricularfractional shortening，LVFS）、心排血量（cardiacoutput，CO）。彩色多普勒超聲在主動脈弓切面以及心尖四腔切面測量主動脈瓣峰值流速（aorticvalve peakvelocity，AVpeakvelocity）、主動脈瓣跨瓣壓力梯度（aorticvalvetransvalvularpressuregradient，AVPG）、主動脈瓣有效瓣口面積（aorticvalveorificearea，AVA）。輕度狹窄：峰值流速較基線增加 15%～lt;50% ；中度狹窄：峰值流速較基線增加 50%～75% ；重度狹窄：峰值流速較基線增加 gt; 75% 。

1.3.2 HE染色

取石蠟切片經脫蠟水化后，按照HE試劑盒進行染色，透明后干燥，封片后在倒置熒光顯微鏡下觀察組織形態并拍照。

1.3.3 茜素紅染色

取石蠟切片經脫蠟水化后，用茜素紅染液進行染色，透明后干燥，封片后在倒置熒光顯微鏡下觀察組織形態并拍照。

1.3.4 免疫組化

取石蠟切片經脫蠟脫水后，免疫組化法檢測各組標本中 CD_68?α -SMA和OPN陽性細胞表達情況。采用ImageJ圖像軟件分析切片的陽性染色面積。

1.3.5 蛋白免疫印跡法（WesternBlot）檢測

取凍存的大鼠瓣膜組織 50mg ，經研磨后提取蛋白上清液，蛋白變性后，進行電泳，轉膜，封閉，TrisHCI緩沖鹽溶液（TBST液）搖床沖洗3遍，每遍 10min ，一抗 4^°C 孵育過夜，TBST搖床沖洗3遍，每遍 10min ，沖洗后二抗孵育 30min ，然后TBST搖床沖洗3遍，每遍10min ，曝光。采用ImageJ圖像軟件分析蛋白印跡的灰度值。

1.4 統計學處理

采用SPSS25.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數 ± 標準差 表示，多組間比較采用方差分析，方差分析兩兩比較時選用LSD法。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1超聲心動圖檢測結果

與假手術組比較，造模8周后輕度模型組、中度模型組、重度模型組LVEF、LVFS、AVA降低，AVpeakvelocity、AVPG增加，其中重度模型組變化最為顯著（ Plt; 0.05）。造模8周后與造模前相比，輕度模型組、中度模型組、重度模型組LVEF、LVFS、AVA降低，AVpeakvelocity、AVPG增加，其中重度模型組變化最為顯著 Plt; 0.05）。詳見表1表2、圖2、圖3。

2.2各組大鼠主動脈瓣病理學檢測

2.2.1各組大鼠主動脈瓣大體標本觀察

假手術組主動脈瓣質地柔軟，表面光滑，色澤淺白透亮，組織較薄；輕度模型組與假手術組相比，瓣膜組織質地稍增厚；中度模型組、重度模型組主動脈瓣質地硬且厚，色澤乳白渾濁，其中重度模型組瓣膜組織渾濁更明顯。詳見圖4。

2.2.2 各組大鼠主動脈瓣HE和茜素紅染色

HE染色觀察主動脈瓣瓣膜形態變化，結果顯示， 輕度模型組、中度模型組、重度模型組與假手術組相比，瓣膜內部結構紊亂，有不同程度的瓣膜增厚，其中重度模型組變化較為明顯。詳見圖5。

茜素紅染色觀察鈣鹽沉積情況，結果顯示，假手術 組和輕度模型組未出現鈣鹽沉積，中度模型組出現極少量鈣鹽沉積，重度模型組出現少量鈣鹽沉積。詳 見圖6。

2.3各組大鼠免疫組化檢測分析

anti CD₆₈ 抗體檢測瓣膜炎性巨噬細胞浸潤情況，結果顯示，與假手術組相比，輕度模型組、中度模型組、重度模型組 CD₆₈ 細胞陽性率增加，其中，重度模型組最為顯著（ Plt;0.05 ）。anti-OPN抗體檢測瓣膜鈣化情況，結果顯示，OPN陽性細胞主要分布在瓣膜病變部位，其中，中度模型組、重度模型組OPN細胞陽性率較高 ?Plt;0.05 。anti- ?α -SMA抗體檢測瓣膜肌成纖維的分布，結果顯示， α -SMA陽性細胞主要分布在病變部位，其中，中度模型組、重度模型組陽性率最高（ Plt; 0.05）。詳見圖 7～ 圖10。

2.4 各組大鼠WestemBlot檢測比較

與假手術相比，中度模型組、重度模型組的BMP-2蛋白表達增加（ Plt;0.05 。詳見圖11、圖12。

圖11各組大鼠主動脈瓣膜組織BMP-2蛋白表達條帶圖

3討論

本研究建立并修改了Honda等7提出的導絲誘導的主動脈瓣損傷模型，實施了3種不同強度的主動脈瓣損傷，建立了大鼠輕度、中度或重度CAVS模型方法。與中度損傷相比，嚴重損傷導致主動脈瓣AVpeakvelocity、AVPG和AVA有了更明顯的變化。HE染色顯示，輕度模型組、中度模型組、重度模型組的主動脈瓣膜增厚，重度模型組增加更為明顯。茜素紅染色顯示，輕度模型組、中度模型組、重度模型組的瓣膜出現不同程度的鈣鹽沉積，重度模型組更為顯著。免疫組化顯示，輕度模型組、中度模型組、重度模型組的瓣膜出現不同程度的巨噬細胞浸潤、纖維化和鈣化，重度模型組更為顯著。WesternBlot顯示，輕度模型組、中度模型組、重度模型組的BMP-2表達增強，重度模型組增加更為明顯。同時，輕度模型組、中度模型組、重度模型組大鼠也出現LVEF降低。該大鼠模型模擬了人的主動脈瓣狹窄特征，包括AVpeakvelocity和AVPG增加、AVA減少、主動脈瓣膜增厚、纖維化、巨噬細胞浸潤和鈣鹽沉積。

目前，已經發表的常見的關于CAVS的大鼠動物模型是基于靜脈注射華法林。然而，這些大鼠不會發生血液動力學顯著的主動脈狹窄[8，并且華法林誘導的主動脈瓣鈣化不同于自然發生的鈣化[9]。由腎切除術或高腺嘌呤飲食誘導的幾種尿毒癥大鼠模型出現主動脈瓣鈣化反映了腎衰竭與CAVS的相關性[\"。此外，注射維生素D在大鼠中能夠引起血管和主動脈瓣鈣化，但無主動脈瓣狹窄[1]。這些模型表明大鼠也可以作為CAVS模型的一種選擇。然而，這些模型在治療干預的測試中的用途有限，也不能模擬一般的人類病理。為此，需要一個在野生型大鼠中具有可變遺傳背景和適用性的CAVS模型。但是，如果沒有干預，手術或飲食野生型大鼠不會發生CAVS。Honda等描述的導絲誘導CAVS損傷模型，促進了野生型小鼠CAVS的快速和有效發展。本研究實施了Honda等[7]描述的方案，誘發輕度、中度和重度CAVS。該模型在體內生理變化（心肌性能）和組織病理學（瓣膜增厚、巨噬細胞浸潤和鈣鹽沉積）方面模擬了人類疾病。此外，本研究中建立的導絲損傷誘導的大鼠CAVS方案提供了一個較為簡單、可操作性強的主動脈瓣狹窄模型。輕度到中度或重度CAVS的分級損傷可以提供對疾病發展的各個階段的研究。

該模型與大鼠體內的所有疾病模型一樣，也存在一定的局限性。首先，通過冠狀動脈導絲引起的急性損傷與人類疾病形成對比，在人類疾病中，CAVS的發展需要經過幾十年的慢性機械應力。其次，大鼠的生理學一般不同于人類的生理學。因此，所有使用該模型的發現最終都必須在人類環境中進行探索。然而，該模型可以用來測試對可能導致CAVS的選定機制的假設。由于不需要基因改變、飲食或藥物來誘導CAVS，因此可以較容易地應用于研究某個特定的基因、特定的信號通路。此外，還能應用于干預措施的有效性研究，如飲食或藥物治療。

綜上所述，在超聲引導下導絲損傷主動脈瓣誘導的CAVS大鼠模型可能是有助于理解CAVS病理機制的可行性工具。

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（收稿日期：2023-12-17）（本文編輯鄒麗）