動態高壓微射流對豬胰脂肪酶的影響

尹 曼劉 偉鐘業俊劉成梅黃 波

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學生物質轉化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047）

動態高壓微射流對豬胰脂肪酶的影響

尹 曼1，2劉 偉1，2鐘業俊1，2劉成梅1，2黃 波1，2

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學生物質轉化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047）

以豬胰脂肪酶（PPL）為原料，研究動態高壓微射流（DHPM）對酶活性和構象的影響。結果顯示：DHPM處理對PPL具有鈍化作用，處理壓力越大，鈍化作用越小；4℃下貯存24 h，相對酶活有所回升。通過紫外光譜和圓二色譜分析DHPM對PPL構象的影響，發現經100 MPa DHPM處理后，PPL的紫外吸收強度降低，β－折疊含量減少，但隨著處理壓力增大，紫外吸收強度和β－折疊含量逐漸增大；4℃放置24 h后，紫外吸收強度和β－折疊含量進一步上升。PPL的相對酶活與紫外吸收強度、β－折疊含量呈一定的正相關。

動態高壓微射流技術；豬胰脂肪酶；酶活；構象

脂肪酶（lipase，E.C.3.1.1.3）即甘油酯水解酶，可催化甘油三酯水解為甘油和游離脂肪酸，在食品、化妝品、洗滌劑、造紙、制藥等領域應用廣泛［1］。脂肪酶只能在異相系統即油水的界面上作用［2］。盡管不同來源脂肪酶的氨基酸組成不同，但分子量都在20 000～60 000，且活性中心具有相同或相似的結構，一般由絲氨酸、天冬氨酸／谷氨酸、組氨酸組成三聯體［3］，酶分子空間結構的中央是1個疏水的β－折疊，其周圍包繞著兩親的α－螺旋，3個氨基酸以高度保守的幾何取向位于中央β－折疊一側的“環”中［4］。

酶的催化活性和構象變化之間的關系一直是研究熱點。R W McCabe等［5］研究發現在極端酸和堿性條件下，南極假絲酵母脂肪酶酶活發生鈍化，二級結構發生相應變化。Francesco Secundo等［6］研究了洋蔥假單胞菌脂肪酶和南極假絲酵母脂肪酶在純有機溶劑中活性和構象的變化。

動態高 壓微射流（dynamic high－pressure microfluidization，DHPM）是一種新興高壓技術，該技術建立在高壓微射流均質機基礎上，集輸送、混合、超微粉碎、加壓、膨化等多種單元操作于一體，液體物料在振蕩中，被分成兩股或更多股細流，然后在極小空間進行強烈的垂直撞擊或Y型撞擊，在撞擊的過程中瞬間釋放出大部分能量，產生巨大的壓力降，能對流體混合物料進行強烈剪切、高速撞擊、壓力瞬時釋放、高頻振蕩、膨爆和氣穴作用等一系列的綜合作用［7］。

本課題組前期研究［7－9］發現，DHPM處理對梨汁多酚氧化酶和蘑菇多酚氧化酶有激活作用，對胰蛋白酶的熱穩定性有提升作用。本試驗以豬胰脂肪酶為原料，研究DHPM處理壓力對其活性的影響及低溫放置24 h后活性的變化；采用紫外光譜、圓二色譜研究DHPM對酶構象的影響，分析酶活性與構象變化的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬胰脂肪酶（porcine pancreatic lipase，簡稱 PPL，E.C.3.1.1.3）：Sigma公司；

橄欖油：國藥集團化學試劑有限公司；

聚乙烯醇、氫氧化鈉等：均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

動態高壓微射流均質機（最高處理壓力為200 MPa）：M－110E，美國 Microfluidic公司；

圓二色光譜儀：MOS－450，法國Bio－Logic公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH－4，上海賀德實驗設備有限公司；

離心機：Anke LXJ－ⅡB，上海安亭科學儀器廠；

高速分散機：T25，德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 PPL酶液的配制 將0.1 g豬胰脂肪酶溶于100 m L的磷酸鈉緩沖液（p H 7.7，10 m M）中，5 000 r／min離心15 min，取上清液，考馬斯亮藍染色法測定酶溶液濃度［10］。

1.3.2 處理壓力及貯存時間對脂肪酶活力的影響 酶溶液采用微射流均質機，（20±3）℃下進料，分別在100，150，200 MPa下各處理1次，處理過程中用冷凝水迅速冷卻至室溫。收集樣品后迅速進行測定，或轉移至4℃冰箱中貯存24 h后測定。未經動態高壓微射流處理的PPL酶液設為對照組。

1.3.3 脂肪酶活性的測定 采用橄欖油乳化法［11］。

橄欖油乳化液的配制：2%的聚乙烯醇和橄欖油體積比3∶1，混合后用高速分散機隨機攪動6 min，制成橄欖油乳化液，現用現配。

取4 m L橄欖油乳化液底物和5 m L磷酸鈉緩沖液（100 m M，p H 7.7）于錐形瓶中，37℃水浴保溫，加入1 m L酶液，振蕩，保溫15 min后加入15 m L乙醇溶液（95%）終止反應。向錐形瓶中滴加3～5滴酚酞作為指示劑，搖勻，用0.05 mol／L氫氧化鈉標準溶液滴定?？瞻自囼灋橄燃尤?5 m L乙醇溶液（95%），再加入1 m L酶液。在一定條件下，每分鐘釋放出1μmol脂肪酸的酶量定義為1個脂肪酶活力單位（U）。相對活性為經DHPM處理后PPL酶的酶活與對照組酶活之比：

1.3.4 紫外光譜分析 采用法國 Bio－Logic MOS－450儀器進行紫外掃描，在200～360 nm范圍內掃描得到吸收光譜。

1.3.5 圓二色譜（CD譜）分析 試驗所用圓二色譜為Bio－Logic MOS－450型多功能圓二色光譜儀，0.1 cm的石英樣品池。掃描波長范圍為250～190 nm，重復4次。掃描速度為0.1 s／nm，帶寬1.0 nm，測定溫度為（25±1）℃。圓二色性用平均殘基橢圓值［θ］表示，單位為（mdeg·cm2）／dmol或mdeg。利用DichroWeb在線軟件SELCON3計算酶的二級結構構象單元的百分含量［12］。

2 結果與分析

2.1 DHPM不同壓力處理對PPL活力的影響

PPL經100，150，200 MPa的DHPM處理后0 h和4℃貯藏24 h后的相對酶活變化見圖1。由圖1可知，DHPM處理對PPL活力有不同程度的鈍化作用，且處理壓力越大，鈍化作用越??；低溫放置24 h，酶活力有一定回升。

圖1 不同壓力下PPL的相對酶活Figure 1 Relative residual activities of PPL treated under different pressure

PPL酶液經過微射流均質機的反應腔時，受到強烈剪切等一系列作用，分子構象發生變化，進而影響酶活性中心的結構。在不同壓力處理下，酶的催化活性有不同程度的降低［13］，因為壓力對酶空間構象的破壞程度是不同的。在本試驗中，150 MPa和200 MPa下對酶的活性位點的破壞力可能比較小，因此酶活力降低程度較小，圓二色譜的結果也支持了這一結論。處理后隨著保存時間的增加，酶的構象逐漸向低自由能的天然構象回復，不同壓力下PPL酶活都有一定的回升。

2.2 DHPM對PPL紫外光譜的影響

蛋白質的發色基團存在于各種微環境中，微環境的性質決定于蛋白質分子結構，微環境隨構象改變而改變，微環境改變發色基團的紫外可見吸收光譜也隨之改變。因此由發色基團紫外吸收光譜的變化可以了解微環境的變化，從而推斷DHPM作用引起的脂肪酶分子構象的變化。

圖2、3表示DHPM處理對PPL紫外吸收光譜的影響。由于50 MPa下酶的紫外吸收強度與未經處理的酶相比較而言，沒有顯著性差異，因此本試驗未將結果列出。

圖2 DHPM對PPL紫外吸收光譜的影響（0 h）Figure 2 UV absorption spectra of PPL treated under various pressures

對照組PPL的紫外吸收強度和最大吸收峰位置為0.389 88和266 nm；經100，150，200 MPa的 DHPM 處理后，PPL的最大吸收峰位置基本保持不變。經100 MPa和150 MPa DHPM處理，PPL的紫外吸收強度降低，這可能因為PPL酶經100 MPa處理后，PPL分子的內部Trp和Tyr殘基被包埋的更為“緊密”，但隨著處理壓力增大，脂肪酶的紫外吸收強度增大，這可能是因為隨著處理壓力增大，Trp和Tyr殘基逐漸暴露出來。經不同壓力處理后，PPL酶分子由折疊態向去折疊態轉變，酶分子的內部殘基逐漸暴露，其結果與劉偉等之前研究胰蛋白酶的結論相似［9］。低溫放置24 h后，PPL的紫外吸收強度進一步上升，分子內部殘基進一步暴露。

圖3 DHPM處理后4℃貯藏24 h的PPL紫外吸收光譜Figure 3 UV absorption spectra of PPL treated under various pressures after 24 h storage at 4℃

2.3 DHPM對PPL二級結構的影響

蛋白質中α－螺旋構象的CD譜在222 nm處和208 nm處呈負峰，在190 nm附近有一正峰；無規卷曲構象的CD譜在198 nm附近有個負峰，在220 nm附近有一個小而寬的正峰；β－折疊的橢圓值不像α－螺旋那樣恒定，負峰移到220，195 nm的正峰與α－螺旋相似［14］。本試驗得到的CD譜線符合構象出峰特征，且β－折疊的特征峰比較明顯（如圖4和圖5），這與Yao等［15］報道的“脂肪酶是一種以折疊構象為主的蛋白酶”相一致。

圖4 DHPM處理壓力對PPL CD譜的影響（0 h）Figure 4 Effect of DHPM pressure on the CD spectra of PPL

圖5 DHPM處理后4℃貯藏24 h的PPL CD譜Figure 5 Effect of DHPM pressure on the CD spectra of PPL after 24 h storage at 4℃

利用SELCON3軟件計算脂肪酶的二級結構含量，對照組PPL的β－折疊含量為48.9%，經100，150，200 MPa的DHPM 處 理 后，PPL 酶 的 β－折 疊 含 量 分 別 為42.6%，49.2%，50%；4℃貯藏24 h后，PPL酶的β－折疊含量分別為44.2%，51.6%，53.8%，而100 MPa和200 MPa下，DHPM處理后24 h，α－螺旋含量有所增加（見表1）?？梢?，經100 MPa DHPM處理后，β－折疊含量減少，隨著處理壓力的增加，β－折疊含量增大；4℃貯藏24 h后，各組PPL的β－折疊含量均有一定的升高。

表1 DHPM處理壓力對PPL二級結構百分含量的影響Table 1 Effect of DHPM on the percentage content of lipase secondary structures ／%

這些變化趨勢與PPL的相對酶活的變化趨勢一致（見圖6），表明PPL相對活性和β－折疊的含量呈一定的正相關性。該結果與Fu Dayan和楊瑞金等的研究較為一致。Fu Dayan等［11］研究了解脂耶氏酵母脂肪酶熱鈍化和構象變化之間的關系，結果顯示酶鈍化伴隨著分子二級和三級結構的變化和聚合。楊瑞金等［16］研究發現高壓脈沖電場處理導致胃蛋白酶鈍化，而鈍化和酶的β－折疊結構含量的降低密切相關。

圖6 PPLβ－折疊與相對活性隨DHPM處理壓力的變化Figure 6 Changes ofβ－sheet and relative activity of PPL with DHPM pressure

3 結論

（1）100，150，200 MPa的DHPM 處理對PPL活力有不同程度的鈍化作用，且處理壓力越大，鈍化作用越??；低溫放置24 h，酶活力有一定回升。

（2）紫外光譜的變化表明：經100 MPa DHPM處理，PPL的紫外吸收強度降低，PPL分子內部的賴氨酸和色氨酸殘基被包埋的更為“緊密”，但隨著處理壓力增大，脂肪酶的紫外吸收強度逐漸增大，低溫放置24 h后，PPL的紫外吸收強度進一步上升，分子內部的殘基進一步暴露。

（3）CD譜的變化表明：經100 MPa DHPM處理后，β－折疊含量減少，隨著處理壓力的增加，β－折疊含量增大；4℃貯藏24 h后，各組PPL的β－折疊含量均有一定的升高。這些變化趨勢與PPL的相對酶活的變化趨勢一致，兩者變化呈一定的正相關。

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Effect of dynamic high－pressure microfluidization on porcine pancreatic lipase

YIN Man1，2LIU Wei1，2ZHONG Ye－jun1，2LIU Cheng－mei1，2HUANG Bo1，2

（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330047，China；2.Engineering Research Center of Biomass Conversion，Ministry of Education，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330047，China）

The effect was studied of dynamic high－pressure microfluidization（DHPM）treatment on porcine pancreas lipase（PPL）enzyme activity and conformation.PPL was inactivated after DHPM treatment and the higher pressure，the less inactivationis.The relative activity increased during 24 h storage at 4℃.UV and CD spectra analysis showed，after DHPM treatment in 100 MPa，the UV absorption andβ－sheet content reduced.Yet the UV absorption andβ－sheet content increased with the increase of treat pressure.After 24 h storage at 4 ℃，the UV absorption andβ－sheet content was further increased.The results showed that the relative activity was correlated with UV absorption andβ－sheet content positively.

dynamic high－pressure microfluidization；porcine pancreatic lipase；activity；conformation

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.002

國家自然科學基金資助項目（編號：31000209）；食品科學與技術國家重點實驗室目標導向項目（編號：SKLF－MB－201004）

尹曼（1985－），女，南昌大學在讀碩士研究生。E－mail：yindaxianer＠163.com

通迅作者：劉偉

2011－03－09