應用基于LC—TOF—MS分析的質量虧損過濾方法篩選黃芪注射液中的皂苷類成分

宋慧婷+李長印+萬瑤瑤+丁選勝+譚喜瑩+戴國梁+劉史佳+居文政

[摘要] 采用液相色譜與四極桿飛行時間質譜（LC-TOF-MS）聯用技術分析黃芪注射液（HI）樣品，獲取正負離子模式下HI中化學成分的LC-TOF-MS分析數據。根據前期相關文獻報道，建立黃芪皂苷類化合物的質量虧損過濾（MDF）方法，用于系統篩選HI中所含有的皂苷類成分。每個篩選化合物的存在需由不少于2個準分子離子進行確認。最后依據其母離子和子離子信息對所篩選的化合物進行初步鑒定。最終共從HI中篩選并初步鑒定出62個皂苷類化合物，其中15個為新發現的皂苷類化合物。鑒定結果提示，乙?；?、氫化、去氫化、甲氧基化和水化可能為HI中皂苷所涉及的主要轉化反應。該研究豐富了黃芪化學物質基礎研究內容，同時也表明基于LC-TOF-MS分析的MDF方法，是一種可行且有效的中藥成分系統篩選工具。

[關鍵詞] 黃芪注射液； 黃芪皂苷； 質量虧損過濾； LC-TOF-MS； 轉化反應

[Abstract] The samples of Huangqi injection （HI） were analyzed by liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry （LC-TOF-MS）， and both positive and negative ion modes were employed to obtain the LC-TOF-MS analysis information of chemical compounds in HI. Then the mass defect filtering （MDF） approach， which was developed based on the previously published articles， was utilized to rapidly screen the astragalosides from the obtained LC-TOF-MS data. Each screened astragaloside was confirmed by the presence of no less than 2 quasi-molecular ions. All the screened astragalosides were then tentatively assigned according to the parent ion and daughter ion information. Finally， a total of 62 astragalosides were screened and characterized from the HI samples， including 15 new detected ones. The identification results indicated that acetylation， hydrogenation， dehydrogenation， methoxylation and hydration might be the major conversion reactions involved in the formation of the astragalosides. The LC-TOF-MS-based MDF approach was proved to be a feasible and efficient tool to screen the chemical constituents in complex matrices such as herbal medicines.

[Key words] Huangqi injections； astragalosides； mass defect filter； LC-TOF-MS； conversion reactions.

明確中藥中所含有的化學成分信息，是闡明中藥的藥效物質基礎，評價中藥質量和安全性的前提和基礎。高效液相-飛行時間質譜（LC-TOF-MS）聯用技術非常適用于中藥化學成分定性分析，特別是非目標性系統性定性分析[1-2]。然而，由于中藥成分復雜，其LC-TOF-MS分析數據信息異常豐富，如何對其快速有效解析，以準確全面地提取中藥成分信息一直是研究者的一大挑戰。近年來，質量虧損過濾（mass defect filtering，MDF）方法作為一種TOF-MS等高分辨質譜數據的新型數據處理技術，已被一些研究證明可用于中藥成分的系統分析，并具有一定的獨特優勢[3-4]。然而這些研究均具有一定的局限性，它們或者需要對照品比對[3]，或者沒有考慮到化合物可能的加合離子[4]。黃芪注射液（HI）為已上市的臨床常用黃芪制劑，皂苷類為其主要藥效成分和制劑質量控制指標[5-6]。然而目前還沒有對HI中皂苷類成分系統分析的研究報道?；诖?，本研究結合前期文獻報道和預試驗結果，充分考慮皂苷類化合物可能產生的各種加合離子，建立了改進的黃芪皂苷類化合物的質量虧損過濾（MDF）方法，對HI中的皂苷類成分進行系統篩選和鑒定。

1 材料

LC （Agilent）-（AB） Triple TOFTM 5600液質聯用儀，含Pump Agilent 1200G1312A，Column Oven Agilent 1200G1316A，Auto Sampler Agilent 1260G1367B和Triple TOF 5600 Mass spectrometer，LC-MS/MS系統由Analyst 1.6 Software 控制；CPA225D電子天平（德國Sartorius公司）；高速低溫離心機（ThermoSorvall Legend Micro 17R）；WH2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

甲醇、乙腈（HPLC級，德國Merck公司）；甲酸、甲酸銨（質譜級，瑞士Fluka-Sigma-Aldrich公司）；超純水由Millipore Milli-Q Advantage A10超純水機制備；其余試劑為分析純。黃芪注射液為正大青春寶藥業有限公司生產，批號1212053，規格10 mL/支。TOF-MS正負離子調諧液（美國AB Sciex公司，產品編號分別為4460131，4460134）。Oasis@固相萃?。⊿PE）小柱（HLB 3cc，美國Waters公司）。

2 方法

2.1 樣品處理 黃芪注射液經SPE處理后方可進行LC-TOF-MS分析。HLB型SPE小柱使用前需首先用3 mL甲醇活化，而后用3 mL水洗預平衡。將黃芪注射液渦旋30 s混勻，精密吸取600 μL上SPE小柱，而后用2 mL水洗除雜，待水洗完畢后用1 mL甲醇進行洗脫。將甲醇洗脫液渦旋30 s混勻，12 000×g，4 ℃離心5 min，取上清液5 μL進樣分析。

2.2 色譜條件 Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），Agilent Poroshell 120 SB-C18預柱（3.0 mm×5.0 mm，2.7 μm）；流動相A為含2 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸的水相，B為含2 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸的等比混合的甲醇-乙腈；梯度洗脫（0～0.5 min，5% B；0.5～12 min，5%～100% B；12～16 min，100% B；16～16.1 min，100%～5% B；16.1～22 min，5% B）；流速300 μL·min-1；柱溫35 ℃；進樣體積5 μL；進樣室溫度8 ℃。

2.3 質譜條件 離子源為電噴霧離子化（ESI）源，正負離子模式均用于數據采集。TOF-MS掃描模式參數設置如下：掃描范圍 m/z 100～1 000，累積時間 0.250 015 s，離子化溫度（TEM） 550 ℃，霧化氣（GS1） 60 psi（1 psi=6.895 kPa），輔助加熱氣（GS2） 60 psi，氣簾氣（CUR） 35 psi，去簇電壓（DP） 80 V，碰撞能量（CE） 10 eV，正負離子模式下噴霧電壓（ISVF）分別為5 500，4 500 V。采用IDA，DBS和高靈敏度的模式采集數據。主要的IDA轉換標準如下：信號強度大于500 cps，4以內排除同位素，相對分子質量誤差0.05，每個循環最多監測8個候選離子。子離子掃描模式的參數設置如下：掃描范圍 m/z 50～1 000，累積時間0.100 006 s，CE（35±15） eV，其他主要參數同TOF-MS掃描模式。采用AB公司的調諧液傳遞系統（CDS）對相對分子質量準確度進行自動校準。通過AB公司的軟件Analyst TF 1.6 software控制儀器操作和數據采集。

2.4 數據分析 采用AB公司的軟件Peakview Software TM v. 1.2對獲得LC-TOF-MS分析數據進行處理。數據處理過程會用到Peakview軟件的4個功能Mass Defect Filtering （MDF），Formula Finder，XIC manager和IDA Explorer。

首先，采用MDF功能篩選黃芪皂苷相關特征離子，質量虧損和相對分子質量篩選范圍見表1，正負離子模式下離子信號強度下限分別為12 000，7 000 cps。僅在IDA Explorer項下篩選能產生子離子的特征離子，以方便后續鑒定過程。接著，利用Formula Finder功能對篩選所得目標離子的元素組成進行預測，主要參數設置見表1，此外相對分子質量最大允許誤差5，正離子模式下氮、鈉和鉀原子0～1個，負離子模式下氮、氯原子0～1個。采用XICManager功能提取篩選所得的目標離子，以檢驗其

峰形完整性，確認其準確保留時間；在0.03 min的 保留時間允許誤差范圍內，匹配、合并源自1個化合物的多個特征準分子離子（如正離子模式下的[M+H]+，[M+Na]+，[M+K]+，[M+NH4]+，及負離子模式下的[M-H]-，[M+Cl]-，[M+HCOOH-H]-，[M+NO3]-等），并對其他可能的上述特征離子進行XIC提取確認，進而綜合各種加合離子信息鎖定目標化合物。同時，對于同一時間點所篩選到的多個目標化合物，仔細考察相互間的分子式/相對分子質量關聯，以去除源于源內裂解離子的假陽性篩選結果。最后，結合IDA Explorer提供的子離子信息對目標化合物進行初步鑒定。

3 結果與討論

3.1 分析條件的選擇 本研究中選擇的Poroshell 120 SB-C18色譜柱為Agilent公司開發的一類新型UPLC色譜柱，與亞2 μm柱具有相似的高柱效，但壓力減少40%～50%，因此適用于Agilent 1200等常壓液相色譜[7]。為了能與后續HI藥效相關非靶標代謝組學研究進行銜接，并證明本文中MDF篩選方法的篩選能力和效率，未對洗脫梯度等分析條件進行系統優化，選擇了代謝組學研究中采用的通用的分析條件（詳見后續研究報道）；流動相中加入甲酸和甲酸銨是為了提高離子化效率、改善色譜峰峰形和產生特征加合離子。正負離子同時檢測以產生豐富的加合離子確證目標化合物的存在，并提供豐富的碎片離子以利化合物的結構鑒定。

3.2 MDF篩選方法的確定 MDF技術最初是用于代謝產物鑒定研究的，用來移除生物樣本中大量的背景干擾離子[8-9]。而中藥成分雖然十分復雜，但常?？蓺w屬為一類或幾類具有相同結構母核的一系列化合物，他們可以看做（實際上也應該是）極少數幾個具有獨特結構母核的化合物的次生代謝產物，這與藥物及其體內代謝產物的關系是類似的，因此MDF技術理應適用于中藥成分的系統定性分析。本研究中，MDF方法的質量虧損和相對分子質量篩選范圍的設定依據為已有文獻報道的黃芪皂苷類化合物。先前研究中，根據24個已有報道的黃芪中皂苷類成分的分子式，借助Peakview軟件的Mass calculator功能計算獲得其5種常見準分子離子包括正離子模式下的[M+H]+，[M+Na]+，[M+NH4]+及負離子模式下的[M-H]-，[M+HCOOH-H]-的精確分子質量；據此得到正負離子模式下質量虧損的最大值和最小值，以及相對分子質量的最大值和最小值，進而設定了MDF的相關參數[10]。然而，由篩選結果可知，[M+HNO3-H]-為此前未見報道的一種出現頻率極高的黃芪皂苷準分子離子，其出現頻率僅次于[M+HCOOH-H]-；此外，[M+K]+和[M+Cl]–也經常出現。更為重要的是，相比[M-H]-和[M+H]+離子，多數情況下，黃芪皂苷的[M+HCOOH-H]-，[M+Na]+和[M+HNO3-H]-等加合離子往往具有更強的離子響應強度。篩選方法設定時不考慮這些準分子離子的存在會影響篩選方法的靈敏度和篩選結果的全面性。因此，根據各個已有報道的皂苷的上述所有8種準分子離子的精確相對分子質量和分子式，對上述MDF方法進行了修正，從而大大提高了化合物篩選的靈敏度。由于CDS自動校準可以實現0.01以內的分子質量自動校準，因此將質量虧損的誤差范圍設定為±0.01；而分子質量誤差范圍則設定為10，以涵蓋可能出現的不可預知的皂苷類化合物。最終MDF方法具體參數設置見表1。

3.3 篩選結果 經MDF過濾后的LC-TOF-MS總離子流色譜圖（TIC）的基線噪音水平顯著降低，而黃芪皂苷類化合物對應的色譜峰也在TIC圖譜中更加清晰明顯，見圖1。理論上來講，凡是質量虧損落在設定范圍內的信號離子均應作為皂苷相關離子被篩選出來進一步研究。而在本研究中，僅對能產生子離子且信號強度在12 000 cps（正離子模式）或7 000 cps（負離子模式）以上的皂苷相關離子進行篩選，以發現相對含量較高的黃芪皂苷類成分。最終根據1.2.4中所述方法，共從黃芪注射液中鎖定62個皂苷類化合物。

a.正離子模式下未過濾的TIC；b.負離子模式下未過濾的TIC；c.正離子模式下經皂苷類MDF方法濾過的TIC；d.負離子模式下經皂苷類MDF方法濾過的TIC。

為了進一步確證62個皂苷類成分的存在，采用XIC manager重新提取了每個成分的8種準分子離子的XIC圖譜，以確證各種準分子離子的存在。結果表明，大多數皂苷類成分均存在3個以上的準分子離子，進一步證明了篩選結果的可靠性。各種離子類型出現的頻率從高到低依次為：[M+HCOOH-H]->[M+Na]+>[M+NO3]->[M-H]->[M+H]+>[M+Cl]->[M+K]+>[M+NH4]+。由此可見，在當前LC-MS條件下，[M+HCOOH-H]-是負離子模式下黃芪皂苷類化合物最常見的離子形式，而[M+Na]+則是正離子模式下黃芪皂苷的主要離子形式。此結果進一步證明了化合物篩選方法時考慮各種類型加合離子的重要性和必要性?？偨Y62個化合物的詳細信息，見表2，包括保留時間，分子式，不飽和度，5類主要準分子離子的分子質量測定值及其與理論值間的誤差值，[M+HCOOH-H]-的信號強度，以及各化合物與已知黃芪皂苷的元素組成的關聯性。

3.4 篩選化合物的鑒定 化合物的鑒定主要依據其元素組成與已報道的黃芪皂苷類化合物間的聯系，子離子色譜圖的特征診斷離子以及chemspider等已知化合物數據庫。由前期研究[11]可知，在全掃描（TOF-MS scan type）模式下，皂苷類在正離子狀態下極易產生苷元診斷碎片離子離子m/z 473.362 0 （C30H49O4），和一系列進一步脫水離子峰m/z 455.352 0 （C30H47O3），437.341 0 （C30H45O2），419.331 0 （C30H43O），以及C-17和C-20鍵裂解產生的25-hydroxy-20，24-epoxy殘基離子m/z 143.106 0 （C8H15O2），這些離子的大量出現可為皂苷類化合物的存在提供依據，但是也會導致其相應準分子離子峰的信號大幅度減弱乃至缺失，從而無法獲取針對某一離子的準確子離子信息。相反，在負離子狀態下，黃芪皂苷類化合物在全掃描模式下往往僅產生豐度較強的[M-H]-或[M+HCOOH-H]-等準分子離子峰。這些準分子離子峰在子離子模式（product ion scan type）下則可產生源自此指定母離子的系列特征子離子，用于皂苷類化合物的結構鑒定。研究發現[10]，黃芪甲苷（AGIV）在負離子TOF-MS模式下主要以m/z 829.459 8[M+HCOOH-H]-存在，此離子可在子離子模式產生m/z 783.456 4，651.410 4，621.398 1，489.357 0，179.056 1，161.045 6，149.045 8，143.034 1，131.034 1，119.035 6，113.024 7，101.024 9，89.0252，71.015 2，59.015 1等一系列特征離子，對應皂苷結構母核中的不同結構特征，見圖2a。類似地，所有皂苷類化合物均可產生類似的特征碎片離子，見表3，據此可以初步描述化合物的化學結構，對其進行合理歸屬。以A13為例，見圖2b，其[M+HCOOH-H]-可產生一系列特征碎片離子用于化學結構的解析。與黃芪甲苷一樣，碎片離子179.06和149.05的出現表明A13結構中含有葡萄糖殘基和木糖殘基，而59.02和71.02的存在則表明A13結構中25-hydroxy-20，24-epoxy殘基離子；離子505.4，637.4，667.4和黃芪甲苷的苷元特征離子489，621，651均相差1個氧原子的相對分子質量，提示羥基應存在于皂苷元母核上，而非其他3個環上。離子799的出現進一步證明845為A13的[M+HCOOH-H]-，且A13應為黃芪甲苷的羥基化產物。據此，給出A13的可能化學結構，見圖2c。類似地，對所有62個化合物的結構進行了合理歸屬，見圖3。其中共有47個已有報道的黃芪皂苷成分及其同分異構體，其中包含8個AGIV同分異構體（A15，A18，A22，A26，A37，A41，A48，A49），9個AGII同分異構體（A31，A35，A45，A50，A51，A53，A56，A57，A60），3個AGI同分異構體（A58，A61，A62），6個AGV同分異構體（A16，A17，A20，A34，A39，A44），乙酰AGI（A63），大豆皂苷（A40），以及19個先前黃芪口服液中首次發現的黃芪皂苷類化合物[10]；包括A13在內的剩余15個化合物則為黃芪注射液中新發現的黃芪皂苷類化合物。歸屬所有62個新化合物的可能化學結構所需的子離子信息見表3。

a.負離子模式下黃芪甲苷（AGIV）的主要裂解途徑及特征子離子；b.A13的母離子 [M+HCOOH-H]-m/z 845.5的子離子圖譜；c.A13可能的化學結構。

3.5 篩選結果分析 根據篩選鑒定出的62個皂苷類化合物，可以對黃芪注射液中皂苷類成分的轉化反應進行總結歸納。假設黃芪皂苷的轉化始于AGIV，其他化合物則可看作是AGIV通過某些轉化反應而生成的產物。事實上，已知的主要皂苷類成分AGII，AGI和AGV也可以分別看作是AGIV發生1，2，3次乙?；蟮玫降南盗修D化產物。結果表明，共有乙?；?、（去）甲氧基化、（去）氫化、水合反應等9種轉化反應參與黃芪皂苷類化合物的生成，見圖3。結合各化合物[M+HCOOH-H]-的離子強度，可以初步認為，乙?；?、甲氧基化、氫化、去氫化和水合反應是黃芪注射液中黃芪皂苷類成分的主要轉化途徑。參考已知的主要皂苷類成分AGII，AGI和AGV的化學結構[11-13]，以及ChemSpider數據庫中結構類似的化合物，結合常規轉化反應規律，初步推斷可能的主要反應位點如下：AGIV結構中的A環被認為是乙?；图籽趸目赡芊磻稽c，而氫化反應可能發生于C9-C19位開環，去氫化則可能是C16位羥基羰基化，水合反應最有可能發生于C20-C24環氧基團。需要指出的是，并無確切證據證實AGIV為所有黃芪皂苷的母體化合物，因此上述轉化反應在實際情況下有可能是逆向發生的。此外，本研究中未檢測到丙二酸鹽類皂苷成分，AGI的同分異構體及先前研究中未鑒定的1種皂苷成分，這些化合物的缺失可能與黃芪注射液的制備工藝有關。

1.乙?；?；2.去氫化；3.氫化；4.水合；5.甲氧基化；6.去羥基化；7.糖基化；8.羥基化；9.去甲氧基化。

4 結論

本研究在對HI進行LC-TOF-MS分析獲取分析數據的基礎上，采用MDF篩選方法共從HI中篩選出62個皂苷類化合物，其中15個為新發現化合物。

研究結果充分證明了基于LC-TOF-MS分析的MDF篩選方法應用于中藥化學成分的系統定性分析的可行性和獨特優勢；同時，篩選出的62個皂苷類化合物間接闡明了HI中的黃芪皂苷次生代謝產物種類，豐富了對于黃芪皂苷類成分多樣性的認識，對于科學評價黃芪制劑質量、促進制劑合理開發均具有一定的指導意義。

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