民族藥燈盞花藥材及其混淆品的指紋圖譜研究*

晏潤文，蒲 芬，2，余 濤，2，黃艷敏，2，徐士奎**，羅艷秋

(1.云南省食品藥品監督檢驗研究院，工業和信息化部產業技術基礎公共服務平臺，云南 昆明 650106；2.大理大學 藥學院，云南 大理 671000；3.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500)

燈盞花為菊科飛蓬屬植物短葶飛蓬(Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.)的干燥全草[1]，又名燈盞細辛，為西南特色民族藥之一。燈盞花用藥歷史悠久，在《滇南本草》 《晶珠本草》 《藏藥志》等文獻均有記載。現代藥理研究表明，燈盞花具有改善心腦血管缺血、抗炎、改善微循環、抑制血小板聚集、神經保護等藥理活性[2-3]。近年來，由于野生資源匱乏，藥農或民族醫生常將形態相似及地理分布區重疊的近緣種混淆燈盞花采挖售賣或在臨床使用。前期對云南、四川等地民間燈盞花使用情況及其混淆品進行調研與文獻研究，發現目前混淆品主要有多舌飛蓬、展苞飛蓬、密毛紫菀、一年蓬等多種植物[4-6]。調研中發現，商品市場與臨床應用的燈盞花藥材規格較多，不僅有全草入藥者，也有地上部分入藥者，甚至出現以燈盞花乙素為主的專屬性栽培藥材；而藏醫藥體系常將多種飛蓬屬和紫菀屬植物不加區分以頭狀花序入藥[7-9]，其中包括燈盞花。這些問題的普遍存在，給燈盞花藥材臨床療效和用藥安全帶來巨大隱患與挑戰。

中藥指紋圖譜基于對中藥多成分協同作用認識及化學成分的系統研究，具有信息量大、專屬性強、整體性等特點，被國內外廣泛認可與使用[10]。近年來，有一些文獻對燈盞花藥材及其近緣種開展了指紋圖譜研究[11-14]，但多基于對全草的分析。為揭示燈盞花藥材及其混淆品不同藥用部位的差異，本研究采用UPLC建立燈盞花質量評價的指紋圖譜，并對正品與混淆品的全草、不同藥用部位等進行比較研究，發現質量變化的內在規律及不同民族用藥經驗差異的內在物質基礎，為燈盞花藥材質量評價、產業發展、監督檢驗等提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ultimate3000超高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器(賽默飛世爾科技有限公司)，SQP型十萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)，CPX5800H-C型超聲清洗機(雅馬拓科技貿易有限公司)，ELGA超純水機(法國威立雅水務公司)。

1.2 材料

野黃芩苷對照品(純度：92.1%，批號：110842-202010)購自中國食品藥品檢定研究院；燈盞花甲素對照品(純度：98.83%，批號：08S-YIM-97-5)購自PANPHY化學品公司。甲醇、乙腈、甲酸等購自德國Merck公司。

共收集燈盞花藥材12批次，野外實地采集混淆品5批次，所有樣品均經云南省食品藥品監督檢驗研究院徐士奎副主任藥師鑒定，實驗材料見表1。所有樣品粉碎，過4號篩，備用。

表1 燈盞花及其混淆品實驗材料信息表

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

精密稱定野黃芩苷、燈盞花甲素對照品適量，加入甲醇溶解，制備質量濃度為0.10499、0.09488 mg/mL 的對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取 0.5 g 的燈盞花藥材粉末于錐形瓶中，加入 50 mL 50%甲醇溶液，常溫超聲 30 min，過濾，于 50 mL 容量瓶中定容，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 色譜條件

采用Agilent ZORBAX Eclipse Plius C18(φ2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱，以0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)為流動相進行梯度洗脫(0～3.5 min，5%B→5%B；3.5～8 min，5%B→8%B；8～13 min，8%B→9%B；13～14 min，9%B→12%B；14～16 min，12%B→14%B；16～27 min，14%B→15%B；27～33 min，15%B→17%B；33～35 min，17%B→17%B；35～38 min，17%B→25%B；38～43 min，25%B→40%B；43～48 min，40%B→90%B；48～52 min，90%B→90%B，均為體積分數)，流速為 0.2 mL/min，柱溫 40 ℃，進樣量為 2 μL，300 nm 波長下檢測。

2.4 方法學考察

1)專屬性試驗。取空白溶液、混合對照品溶液、供試品溶液(S1)依次進樣，進行專屬性考察。結果顯示，空白溶劑無干擾，對照品峰形好，分離度高，專屬性良好。

2)精密度試驗。取供試品溶液(S1)，連續進樣6次，以野黃芩苷色譜峰(9號峰)為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對保留面積。結果顯示，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值分別在0.52%、1.82%以內，表明儀器精密度良好。

3)重復性試驗。取燈盞花藥材粉末(S1)，平行制備6份供試品溶液，分別進樣，以野黃芩苷色譜峰(9號峰)為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對保留面積。結果顯示，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值分別在0.23%、2.76%以內，表明該方法重復性良好。

4)穩定性試驗。取供試品溶液(S1)，于0、2、8、12、16、20、24 h 時分別進樣，以野黃芩苷色譜峰(9號峰)為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對保留面積。結果顯示，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值分別在1.93%、3.02%以內，表明該方法穩定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及相似度評價

1)燈盞花指紋圖譜建立。12批栽培燈盞花藥材按“2.2”項方法制備供試品溶液，以2.3節色譜條件進樣測定。將各批次燈盞花色譜數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2012版)，通過多點校正和自動峰匹配，建立共有峰指紋圖譜，生成燈盞花對照圖譜。以S1為參照圖譜，建立了燈盞花指紋圖譜疊加圖和對照圖譜(圖1、圖2)。共標定19個共有峰，通過與對照品圖譜對照，確認9號峰為野黃芩苷，13號峰為燈盞花甲素。12批燈盞花藥材相似度較高，均大于0.893，說明燈盞花藥材質量較穩定，其化學成分具有良好的一致性(表2)。

圖1 12批燈盞花UPLC指紋圖譜疊加圖

表2 12批燈盞花與對照圖譜的相似度

2)燈盞花不同藥用部位指紋圖譜建立。分別選擇10批藥材構建燈盞花不同藥用部位(葉、莖、花)指紋圖譜，莖、葉、花不同藥用部位指紋圖譜疊加圖和對照圖譜見圖3。莖、葉、花分別標定17、20、19個共有峰，將燈盞花不同藥用部位對照品圖譜與全草對照圖譜比較，結果發現，莖、葉與全草對照圖譜無明顯差異，化學成分組成類似?；ㄅc全草對照圖譜有一定差異，41～47 min 內的色譜峰可將花與其他藥用部位有效區分。相似度結果顯示，燈盞花藥材莖、葉、花的相似度分別大于等于0.945、0.876、0.948，表明同部位各批次間化學組成相似(表3)。

(a)莖部指紋圖譜疊加圖 (b)葉部指紋圖譜疊加圖

表3 不同藥用部位與對照圖譜的相似度

3)混淆品不同藥用部位UPLC指紋圖譜研究。按“2.2”項方法制備5種混淆品的供試品溶液，以2.3節色譜條件進樣測定，采集的色譜數據與燈盞花對照圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2012版)，進行相似度評價。通過比較混淆品與燈盞花的對照圖譜可知，狹苞紫菀、一年蓬、石生紫菀與燈盞花的整體峰形具有較大差異，展苞飛蓬、多舌飛蓬與燈盞花的整體峰形較為相似，但燈盞花存在其特有的色譜峰(圖4)。因此，該指紋圖譜方法可對燈盞花及其混淆品加以鑒別。從相似度結果來看，展苞飛蓬、多舌飛蓬與燈盞花的相似度較高，多舌飛蓬、展苞飛蓬、狹苞紫菀、一年蓬和燈盞花花部的相似度較高(表4)，這在一定程度上解釋了在藏醫藥體系中多種飛蓬屬與紫菀屬植物混用的情況(以頭狀花序入藥)。

a：燈盞花；b：多舌飛蓬；c：展苞飛蓬；d：狹苞紫菀；e：一年蓬；f：石生紫菀。

表4 混淆品與燈盞花對照圖譜相似度分析

3 討論

試驗比較了流動相水-乙腈中不同甲酸體積分數(0、0.05%、0.1%)、不同流速(0.1、0.2、0.3 mL/min)、不同檢測波長(290、300、325、335 nm)下各色譜峰的峰形、峰數、響應值和分離度，結果表明，以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈為流動相，在 0.2 mL/min 的流速和 300 nm 波長下進行分析所得色譜峰的整體分離效果和峰形較佳。通過比較不同的提取方法(冷浸 2 d、65 ℃ 加熱回流 2 h、常溫超聲 30 min)、不同提取時間(超聲20、30、40、50 min)、不同提取溶劑(40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、甲醇)對提取效率和提取效果的影響，結果表明，以50%甲醇、常溫超聲 30 min 的提取效率和效果較佳。

12批燈盞花UPLC指紋圖譜共標定19個共有峰，相似度均大于0.893，可知其藥材質量較為穩定。該方法可用于燈盞花藥材質量控制。通過對不同藥用部位對照圖譜比較，發現莖、葉與燈盞花全草對照圖譜無明顯差異，化學成分組成類似，但與花部對照圖譜差異較為顯著。建立的指紋圖譜通過比較特征色譜峰，可有效鑒別燈盞花及其混淆品。展苞飛蓬、多舌飛蓬的整體峰形與燈盞花較為相似，且相似度較高。與肖琳婧等[11]研究結果不同，說明不同產地、生長環境、采收時間等因素對混淆品質量影響較大，應增加樣本數量、充分考慮不同因素對混淆品質量的影響，才能全面評估混淆品的利用價值。多舌飛蓬、展苞飛蓬、狹苞紫菀、一年蓬與燈盞花藥材花部相似度較高，化學成分較為相近，揭示了藏醫藥體系中多種飛蓬屬與紫菀屬植物以頭狀花序入藥混用的物質基礎。

本研究運用指紋圖譜對燈盞花藥材和混淆品化學成分組成進行分析，并比較不同藥用部位化學成分差異，可為燈盞花藥材質量控制、鑒別和使用提供參考。