動(dòng)物疫苗生產(chǎn)工藝研究的現(xiàn)狀分析

摘要：動(dòng)物疫苗規(guī)模化生產(chǎn)中受到多種因素影響，通過調(diào)控細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、病毒擴(kuò)增和發(fā)酵工藝等優(yōu)化動(dòng)物疫苗工業(yè)化生產(chǎn)工藝。本文章擬綜述分析動(dòng)物疫苗生產(chǎn)工藝研究現(xiàn)狀。

關(guān)鍵詞：動(dòng)物；疫苗；生產(chǎn)工藝；現(xiàn)狀

近年來(lái)，隨著動(dòng)物疫苗生產(chǎn)工藝的發(fā)展，主要通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和生物發(fā)酵工程技術(shù)獲得動(dòng)物疫苗產(chǎn)品。在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，細(xì)胞密度和病毒擴(kuò)增效率是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)工藝中決定動(dòng)物疫苗產(chǎn)量的兩個(gè)重要因素，而細(xì)胞密度又受到細(xì)胞培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基成分、血清含量、培養(yǎng)環(huán)境等的影響，病毒擴(kuò)增效率主要是由穩(wěn)定高效表達(dá)目的產(chǎn)物的細(xì)胞系、病毒感染復(fù)數(shù)、感染時(shí)間、收獲時(shí)間等決定的，因此可通過調(diào)控動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)供給和生物反應(yīng)器操作參數(shù)，建立滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物疫苗的高效生產(chǎn)工藝[1-3]。而生物發(fā)酵工程技術(shù)中以酵母菌表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為主要的表達(dá)產(chǎn)物系統(tǒng)，通過調(diào)控菌體生長(zhǎng)條件以便收獲高水平的蛋白產(chǎn)物，用于制備動(dòng)物疫苗[4-6]。現(xiàn)從以下幾方面闡述影響動(dòng)物疫苗生產(chǎn)工藝的決定性因素。

1 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)方式

動(dòng)物疫苗規(guī)模化生產(chǎn)的發(fā)展初期，主要以轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的生產(chǎn)工藝收獲病毒，該工藝因存在不同批次產(chǎn)品病毒產(chǎn)量差異大、效率低和成本高、培養(yǎng)工藝難以逐級(jí)放大等問題，在2012年農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第1708號(hào)公告中顯示轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)方式的獸用細(xì)胞苗生產(chǎn)線自公告起停止受理生產(chǎn)線項(xiàng)目獸藥GMP驗(yàn)收申請(qǐng)[7]。而微載體系統(tǒng)懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)基中，使得細(xì)胞生產(chǎn)環(huán)境均一，便于進(jìn)行實(shí)時(shí)控制與檢測(cè)，且表面積/體積比大、培養(yǎng)基利用率高、放大工藝較容易，因此微載體懸浮培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生產(chǎn)反應(yīng)器成為首選驗(yàn)收GMP生產(chǎn)線以及工業(yè)化生產(chǎn)的首選方案。

梅建國(guó)等[8]采用Cephodex微載體體系在生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)高密度BHK-21細(xì)胞，接毒后收獲偽狂犬病病毒抗原，結(jié)果顯示，該生產(chǎn)工藝中細(xì)胞密度和病毒濃度均是轉(zhuǎn)瓶工藝中的3倍多。而王麗平[9]等采用流加3%比例的BHK-21細(xì)胞流加培養(yǎng)基培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞擴(kuò)增偽狂犬病病毒，建立的無(wú)血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞工藝獲得的病毒滴度高達(dá)9.25 lg TCID50/mL，比不流加組病毒滴度提高了0.92 lg TCID50/mL，表明采用生物反應(yīng)器無(wú)血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞高效擴(kuò)增病毒是可行的。解長(zhǎng)占等[10]通過生物反應(yīng)器培養(yǎng)HEK293細(xì)胞并接種高致病性豬藍(lán)耳病重組腺病毒，在接毒后36～60 h病毒增殖速率較快，在接毒后60 h病毒滴度最高為1.0×1010 TCID50/mL。而任培森等[11]通過微載體培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)和接毒后結(jié)果顯示，最佳細(xì)胞接種密度為2.6×105/mL，比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞密度高2.1倍，高致病性豬藍(lán)耳病毒滴度比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)高0.46 lg TCID50/mL。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基主要是在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中為細(xì)胞提供物質(zhì)與能力需求，主要含有葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽和維生素等，維持細(xì)胞生長(zhǎng)，其外還需添加為細(xì)胞提供生長(zhǎng)因子的血清，促進(jìn)產(chǎn)物生成。但因血清的添加，易造成外源病原體污染，且由于其成分復(fù)雜，會(huì)增加動(dòng)物疫苗分離純化的負(fù)擔(dān)。針對(duì)血清的諸多問題，人們研究出血清的替代物質(zhì)，如低分子量營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子、擴(kuò)展因子等，因不同細(xì)胞在培養(yǎng)過程中所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類與含量不盡相同，因此在使用前需要對(duì)其進(jìn)行選擇與優(yōu)化以滿足對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的需求[12]。但這樣會(huì)增加時(shí)間成本，因此出現(xiàn)了無(wú)血清培養(yǎng)基，目前開發(fā)出了對(duì)不同細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，幾乎可用于培養(yǎng)普遍使用的細(xì)胞系，其可避免外源性污染、降低純化成本、克服血清批次間的差異性。

盡管如此，以MDCK細(xì)胞、Vero細(xì)胞等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)動(dòng)物疫苗的工藝中，因血清可保護(hù)細(xì)胞免受剪切力損傷，益于貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)，在培養(yǎng)細(xì)胞過程中仍需添加含有2%～10%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至所需密度時(shí)，再更換為無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行病毒擴(kuò)增。

1.3 培養(yǎng)環(huán)境

在生物反應(yīng)器中的細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中，溫度、pH值、二氧化碳含量、溶氧、滲透壓、代謝產(chǎn)物濃度、通氣速率和攪拌速度等決定細(xì)胞生產(chǎn)狀態(tài)與密度，因此，需監(jiān)測(cè)細(xì)胞比生長(zhǎng)速率、營(yíng)養(yǎng)物比消耗速率、代謝產(chǎn)物比生成速率、二氧化碳釋放率、攝氧率等生化指標(biāo)進(jìn)而分析細(xì)胞生產(chǎn)和代謝情況[13]。隨著新興分析儀器的出現(xiàn)，例如生化分析儀、在線成像技術(shù)、介電譜技術(shù)與計(jì)算機(jī)結(jié)合后可模擬細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境，實(shí)時(shí)控制與監(jiān)測(cè)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的各種生物反應(yīng)器參數(shù)，精準(zhǔn)調(diào)整細(xì)胞生理狀態(tài)，使工藝生產(chǎn)、優(yōu)化更加便捷。

1.4 細(xì)胞系

構(gòu)建穩(wěn)定高效表達(dá)目的產(chǎn)物的細(xì)胞系是動(dòng)物疫苗生產(chǎn)工藝的重中之重，不僅可提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本，而且可保證下游產(chǎn)物的穩(wěn)定純化與安全性。可通過構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，隨后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、穩(wěn)定表達(dá)等指標(biāo)通過克隆技術(shù)篩選出可持續(xù)性高效表達(dá)某種蛋白的細(xì)胞系。此外，也可采用細(xì)胞基因工程技術(shù)，通過敲除抑制蛋白表達(dá)的基因、調(diào)控蛋白糖基化、插入誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、敲除細(xì)胞凋亡基因等對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行改造，獲得高產(chǎn)且穩(wěn)定的細(xì)胞株[14]。例如使用Flp/FRT系統(tǒng)在高表達(dá)染色體位點(diǎn)插入相應(yīng)基因，構(gòu)建高產(chǎn)病毒包裝HEK293細(xì)胞系。

1.5 病毒感染條件

病毒感染時(shí)期的培養(yǎng)條件、接毒時(shí)細(xì)胞狀態(tài)、病毒感染復(fù)數(shù)、感染時(shí)間以及收毒時(shí)間等都是影響病毒產(chǎn)量的決定性因素。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞不同生理狀態(tài)對(duì)病毒的敏感性不盡相同，而細(xì)胞處于G0/G1時(shí)期的細(xì)胞膜上唾液酸受體含量較多，更有利于病毒的吸附[15]。而偏堿性的培養(yǎng)條件可抑制細(xì)胞膜上唾液酸抵抗病毒的吸附作用，進(jìn)而提高病毒感染效率。病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）過高雖可使更多的病毒粒子去感染宿主細(xì)胞，但也會(huì)過早導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而降低病毒產(chǎn)量。而過低的MOI使得病毒感染周期變長(zhǎng)，影響病毒的復(fù)制速率導(dǎo)致病毒培養(yǎng)周期變長(zhǎng)。

2 生物發(fā)酵工程技術(shù)

在實(shí)驗(yàn)室初級(jí)研發(fā)階段，通常使用搖瓶對(duì)細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)的菌體量較低、目的蛋白表達(dá)量也較低，因此，將其轉(zhuǎn)化至車間進(jìn)行放大生產(chǎn)時(shí)，很難達(dá)到理想的生產(chǎn)量。基于這個(gè)問題，發(fā)酵培養(yǎng)似乎可以解決，然而普通的發(fā)酵罐雖比搖瓶培養(yǎng)收獲的蛋白產(chǎn)量略有增加，但大規(guī)模化生產(chǎn)時(shí)仍較困難，且會(huì)對(duì)生產(chǎn)成本要求較高。因此，需要通過采用一定的培養(yǎng)技術(shù)手段和設(shè)備提高菌體的發(fā)酵密度，進(jìn)而提高產(chǎn)物的生產(chǎn)效率[16]。重組大腸桿菌細(xì)胞高密度培養(yǎng)是大量獲得外源性蛋白的一種重要技術(shù)，該技術(shù)不僅可以減少培養(yǎng)體積，方便下游工藝分離提取，還可以縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投入，從而達(dá)到降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率的目的[17]。通常影響高密度發(fā)酵的因素非常多，例如細(xì)菌培養(yǎng)過程中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、微量元素、代謝產(chǎn)物的濃度、培養(yǎng)液的pH值、培養(yǎng)溫度、溶解氧、誘導(dǎo)表達(dá)條件、接種量、補(bǔ)料方式等，這些因素都直接或間接的影響整個(gè)發(fā)酵過程中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。

劉斌等[18]將豬口蹄疫O型復(fù)合表位蛋白轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示菌體最適培養(yǎng)時(shí)間為8h，誘導(dǎo)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為8h，培養(yǎng)基中最適磷酸鹽濃度為100mmol/L，微量元素溶液為1mL/L，最適接種量為5%，pH為7.0～7.2，裝液量30%，補(bǔ)料液為氨水、甘油，收獲的蛋白加以佐劑后制成的疫苗可產(chǎn)生較高水平的抗體。王樹明等[1]采用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白，發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件分別為種子菌液的接種量1%～2%，誘導(dǎo)前的OD值為0.6～0.8，誘導(dǎo)溫度37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間5 h，使用乳糖作誘導(dǎo)劑，使其終濃度達(dá)20 mmol/L，將此最佳發(fā)酵條件應(yīng)用于30 L發(fā)酵罐進(jìn)行生產(chǎn)試驗(yàn)，菌體表達(dá)蛋白量提高1倍，用其蛋白制備的亞單位疫苗與商品化疫苗安全性和免疫效力一致。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

動(dòng)物疫苗生產(chǎn)工藝中，不同細(xì)胞系具有其特定的生長(zhǎng)條件，不同病毒也具有其自身的感染增殖特性，不同發(fā)酵系統(tǒng)也具有不同培養(yǎng)條件，因此，需選擇適合的生物反應(yīng)器、細(xì)胞生長(zhǎng)工藝、培養(yǎng)條件、病毒擴(kuò)增工藝、發(fā)酵表達(dá)系統(tǒng)，建立符合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)動(dòng)物疫苗的生產(chǎn)工藝。

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