異甘草酸鎂改善順鉑誘導的大鼠心肌損傷

摘要：目的 探究異甘草酸鎂（MgIG）對順鉑（CDDP）誘導大鼠心肌損傷的保護作用及機制。方法 將24只Wistar大鼠隨機分為正常對照組（Control組）、順鉑模型組（CDDP組）、順鉑+異甘草酸鎂低劑量組（MgIG-L組）、順鉑+異甘草酸鎂高劑量組（MgIG-H組），每組6只。每日監測大鼠體質量變化。給藥結束后經超聲心動圖檢測心功能指標［左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮窄率（LVFS）、左室收縮末期內徑（LVESD）、左室舒張末期內徑（LVEDD）］；HE染色觀察心肌組織形態；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、肌鈣蛋白I（cTnI）水平；檢測心肌組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、活性氧（ROS）及亞鐵離子（Fe2+）水平；Western blot法檢測心肌組織中核因子E2相關因子2（Nrf2）、長鏈脂酰輔酶A合成酶4（ACSL4）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、鐵蛋白重鏈1（FTH1）蛋白表達。結果 Control組大鼠在飼養期間體質量呈增長趨勢，CDDP組體質量呈降低趨勢；與CDDP組相比，MgGL-L組和MgGL-H組大鼠給藥5 d、9 d、13 d時體質量均增加（P＜0.05）。與Control組相比，CDDP組的LVEF、LVFS降低，LVESD、LVEDD升高，心肌纖維排列紊亂、心肌纖維變形和斷裂，血清CK-MB、cTnI水平升高，心肌組織中MDA、Fe2+、ROS水平升高，SOD、GSH水平降低，心肌組織中Nrf2、GPX4和FTH1蛋白表達水平降低，ACSL4蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與CDDP組相比，MgIG-L組和MgIG-H組上述指標及心肌組織病理改變均明顯改善。結論 異甘草酸鎂通過調節心肌氧化應激水平、抑制心肌細胞鐵死亡，從而改善順鉑引起的大鼠心肌損傷。

關鍵詞：甘草酸；順鉑；心肌；氧化性應激；鐵死亡

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20231833

Study of magnesium isoglycyrrhizinate in ameliorating cisplatin induced myocardial injury in rats

WANG Xinshuang1， 2， AN Yajuan1， 2， GUAN Xiuju1， 2， LI Jiao2， LIU Yue2， WEI Liping2， QI Xin2△

1 Graduate School， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 301617， China;

2 Department of Cardiology， Tianjin Union Medical Center

△Corresponding Author E-mail： qixinx2011@126.com

Abstract： Objective To investigate the protective effect and mechanism of magnesium isoglycyrrhizinate （MgIG） on cisplatin （CDDP）-induced myocardial injury in rats. Methods Twenty-four Wistar rats were randomly divided into the normal control group， the cisplatin model group （CDDP group）， the cisplatin + magnesium isoglycyrrhizinate low-dose group （MgIG-L group） and the cisplatin + magnesium isoglycyrrhizinate high-dose group （MgIG-H group）， with 6 rats in each group. Changes of body mass of rats were monitored daily. At the end of drug administration， cardiac function indexes including left ventricular ejection fraction （LVEF）， left ventricular short-axis narrowing rate （LVFS）， left ventricular end-systolic internal diameter （LVESD） and left ventricular end-diastolic internal diameter （LVEDD） were detected by echocardiography. The morphology of myocardial tissue was observed by HE staining. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect serum levels of creatine kinase isoenzyme MB （CK-MB） and troponin I （cTnI）. Levels of superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA）， glutathione synthase （GSH）， reactive oxygen species （ROS） and ferrous ion （Fe2+） in homogenates of myocardial tissue were measured biochemically. The protein expressions of nuclear factor E2-associated factor 2 （Nrf2）， long-chain fatty acyl coenzyme A synthase 4 （ACSL4）， glutathione peroxidase 4 （GPX4） and ferritin heavy chain 1 （FTH1） protein were detected by Western blot assay. Results The body mass of rats in the control group showed an increasing trend during feeding， and the body mass of rats in the CDDP group showed a decreasing trend. Compared with the CDDP group， the body mass of rats in the MgIG-L group and the MgIG-H group increased after 5 d， 9 d and 13 d of treatment （P＜0.05）. Compared with the control group， the CDDP group showed decreased LVEF and LVFS， increased LVESD and LVEDD， disturbed myocardial fiber alignment， myocardial fiber degeneration and fracture， increased serum CK-MB and cTnI levels， increased levels of MDA， Fe2+ and ROS in myocardial tissue， decreased levels of SOD and GSH， and decreased levels of Nrf2， GPX4， and decreased FTH1 protein expression levels and increased ACSL4 protein expression levels in myocardial tissue （P＜0.05）. Compared with the CDDP group， the above indicators and myocardial histopathological changes were significantly improved in the MgIG-L group and the MgIG-H group. Conclusion Magnesium isoglycyrrhizinate can ameliorate cisplatin-induced myocardial injury by regulating myocardial oxidative stress and inhibiting cardiomyocyte iron death in rats.

Key words： glycyrrhizic acid; cisplatin; myocardium; oxidative stress; ferroptosis

順鉑（cisplatin，CDDP）作為廣譜的細胞毒性抗腫瘤藥物具有顯著的臨床療效，但隨著劑量增加所引起的心臟毒性反應明顯加大了腫瘤患者心血管疾病的風險。順鉑的臟器毒性與氧化應激［1-2］和炎癥反應誘發組織細胞凋亡［3-4］有關，而抗氧化功能損傷是細胞鐵死亡脂質過氧化發生的關鍵［5］。核因子E2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）是細胞內鐵代謝調節的重要靶點，與氧化應激和細胞死亡過程密切關聯，調控Nrf2和GPX4表達可能抑制心肌損傷。中藥及其制劑可能通過多靶點來防治抗腫瘤藥物引起的心肌損傷［6］。現代藥理學研究發現甘草及其多種單體成分具有抗炎、抗氧化、抗纖維化等作用［7］。甘草酸是甘草中的有效活性成分，甘草酸制劑異甘草酸鎂（MgIG）注射液對肝臟具有保護作用［8］，已在臨床中應用于多種肝臟疾病的治療［9］，但其對心肌損傷是否具有保護作用及相關機制尚未明確。本研究通過構建順鉑致心肌損傷模型，觀察異甘草酸鎂對大鼠心肌損傷的影響，并從調控氧化應激和心肌細胞鐵死亡方面探討其可能的作用機制，旨在為抗腫瘤藥物致心肌損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 7周齡SPF級雄性Wistar大鼠24只，體質量（230±10）g，購自斯貝福（北京）生物科技有限公司，動物生產許可證號SCXK（京）2019-0010，使用許可證號SYXK（津）2010-0005。動物實驗經天津中醫藥大學倫理委員會批準（倫理審查編號：TCM-LAEC2022173）。所有大鼠飼養于天津中醫藥大學醫學動物實驗中心清潔級動物房內，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%，每12 h交替明暗環境，每2 d更換1次墊料。

1.1.2 主要試劑與儀器 注射用順鉑（凍干型）購自山東省齊魯制藥集團有限公司（國藥準字H20023461），異甘草酸鎂注射液購自正大天晴藥業集團股份有限公司（國藥準字H20051942）。大鼠肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白I（cTnI）試劑盒購自武漢基因美生物科技有限公司；活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；亞鐵離子（Fe2+）檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；GPX4抗體、長鏈脂酰輔酶A合成酶4（ACSL4）抗體、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體購自AFFINITY公司；Nrf2、鐵蛋白重鏈（ferritin heavy chain 1，FTH1）抗體購自武漢三鷹科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Western blot電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型構建、分組及給藥 7周齡Wistar大鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字表法分為正常對照組（Control組）、順鉑模型組（CDDP組）、順鉑+異甘草酸鎂低劑量組（MgIG-L組）、順鉑+異甘草酸鎂高劑量組（MgIG-H組）4組，每組6只。除Control組外，其余各組均采用順鉑誘導大鼠心肌損傷模型，實驗開始第1、5、9、13天腹腔注射順鉑4 mg/kg，以第14天超聲顯示左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）低于65%為造模成功；MgIG-L組、MgIG-H組大鼠每日分別腹腔注射異甘草酸鎂8.93、17.86 mg/（kg·d），給藥劑量參照臨床慢性、急性治療劑量換算成大鼠干預劑量；Control組和CDDP組每日腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2 大鼠一般情況觀察 每日監測大鼠體質量，觀察大鼠精神狀態、活動、飲食及毛發等情況改變。

1.2.3 超聲心動圖檢測心功能 第14天給藥結束后，各組大鼠經異氟烷氣體麻醉，取仰臥位固定，使用超聲成像系統Vevo 2100進行超聲心動圖檢測大鼠LVEF、左室短軸縮窄率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左室收縮末期內徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、左室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD），以評估心臟功能。

1.2.4 標本采集 第14天給藥結束后，稱量大鼠體質量。大鼠經戊巴妥鈉麻醉后，腹主動脈取血，于冰上靜置1 h后，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液保存于-80 ℃冰箱中備用。取血完成后解剖大鼠，充分暴露胸腔后在右心耳處剪一小口，從心尖處灌流預冷的生理鹽水去除殘留的血液，灌流直至肝臟變白，流出液為透明液體后停止，取出大鼠心臟，用無菌吸水紙吸干水分后分別置于-80 ℃冰箱和4%多聚甲醛中保存備用。

1.2.5 心肌組織病理學染色 心臟浸泡于4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋、切片（厚度3～5 μm）。切片行HE染色，脫水、封片，顯微鏡下觀察心肌組織結構形態學變化。

1.2.6 血清心肌酶檢測 從-80 ℃冰箱中取出大鼠血清樣本，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中CK-MB、cTnI水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 心肌組織SOD、MDA、GSH、ROS及Fe2+水平檢測 取各組大鼠心肌組織，加入預冷的0.9%氯化鈉溶液充分碾磨，4 ℃、3 000 r/min離心15 min；吸取上清液，按照試劑盒說明書分別檢測心肌組織勻漿中SOD、MDA、GSH、ROS及Fe2+水平。

1.2.8 Western blot檢測心肌組織Nrf2、ACSL4、GPX4、FTH1蛋白的表達 心肌組織加入蛋白裂解液進行組織勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液即為總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度，蛋白質變性后進行凝膠電泳，每個泳道上樣蛋白量為30 μg，SDS-PAGE后轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉60 min，TBST洗膜后加入一抗Nrf2（1∶1 000）、FTH1（1∶1 000）、GPX4（1∶1 000）、ACSL4（1∶1 000）、GAPDH（1∶" " 5 000），4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min，加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗（1∶5 000），室溫孵育60 min，TSBT洗膜3次，每次10 min，滴加顯影液對目的蛋白進行可視化處理，并采用Image J 6.0軟件進行蛋白質條帶灰度值半定量分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 27.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以[[x] ±s]表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；多組間不同時點比較采用重復測量資料的方差分析，如不滿足球性假定條件，采用多變量方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 異甘草酸鎂對順鉑損傷大鼠一般情況的影響 Control組大鼠在飼養期間體質量呈增長趨勢（P＜0.05），毛色光亮、進食良好、大小便正常、活動靈敏；與Control組相比，CDDP組大鼠給藥后體質量呈降低趨勢（P＜0.05），伴腹瀉，進食、飲水減少，毛色暗淡，活動遲緩；與CDDP組相比，MgGL-L組和MgGL-H組大鼠給藥5、9、13 d時體質量均增加（P＜0.05），伴輕微腹瀉，進食、飲水減少，毛色無光澤，活動欠靈活，見表1。

2.2 異甘草酸鎂對順鉑損傷大鼠心功能的影響 與Control組相比，CDDP組大鼠LVEF、LVFS降低，LVEDD、LVESD升高（P＜0.05）；與CDDP組相比，MgIG-L組和MgIG-H組大鼠LVEF、LVFS升高，LVEDD、LVESD降低（P＜0.05）；與MgIG-L組比較，MgIG-H組大鼠LVEF、LVFS升高（P＜0.05），LVEDD、LVESD差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.3 異甘草酸鎂對順鉑損傷大鼠心肌組織形態學的影響 HE染色結果顯示，與Control組相比，CDDP組心肌纖維排列紊亂，心肌纖維變形和斷裂，伴細胞核固縮；與CDDP組相比，MgIG-L組和MgIG-H組大鼠心肌纖維排列紊亂及纖維變形、斷裂程度減輕，見圖1。

2.4 異甘草酸鎂對順鉑損傷大鼠心肌酶水平的影響 與Control組相比，CDDP組大鼠血清CK-MB、cTnI水平升高（P＜0.05）；與CDDP組相比，MgIG-L組和MgIG-H組大鼠血清CK-MB、cTnI水平均降低（P＜0.05）；與MgIG-L組相比，MgIG-H組大鼠血清cTnI水平低于MgIG-L組（P＜0.05），CK-MB水平差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

2.5 異甘草酸鎂對順鉑損傷大鼠心肌組織中氧化應激指標及Fe2+水平的影響 與Control組相比，CDDP組大鼠心肌組織GSH、SOD水平降低，MDA、ROS、Fe2+水平升高（P＜0.05）；與CDDP組相比，MgIG-L組和MgIG-H組GSH、SOD水平升高，MDA、ROS、Fe2+水平降低（P＜0.05），其中MgIG-H組上述指標變化更為顯著，見表4。

2.6 異甘草酸鎂對順鉑損傷大鼠Nrf2、GPX4等蛋白表達的影響 與Control組相比，CDDP組大鼠心肌組織中Nrf2、GPX4和FTH1蛋白表達水平降低，ACSL4蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與CDDP組相比，MgIG-L組和MgIG-H組大鼠心肌組織中Nrf2、GPX4和FTH1蛋白表達水平升高，ACSL4蛋白表達水平降低（P＜0.05）；MgIG-H組大鼠心肌組織中Nrf2和FTH1蛋白表達水平高于MgIG-L組（P＜0.05），ACSL4和GPX4蛋白表達水平與MgIG-L組差異無統計學意義（P＞0.05），見表5、圖2。

3 討論

腫瘤患者化療所引發的心血管病癥的中醫辨證主要是氣陰兩虛、毒損心絡，因此其防治應以益氣養陰、清熱解毒為主［10］。甘草是我國傳統中藥材，具有補脾益氣、清熱解毒、緩急止痛及調和諸藥等功效，炙甘草湯［11-12］、通脈養心丸［1，13］等已被證明對這類心血管合并癥具有一定療效。甘草中的三萜皂苷類化合物甘草酸是其主要活性成分［14］。研究發現，甘草酸能夠減少心肌梗死面積、改善室性心律失常、保護心肌細胞免受缺氧缺糖誘導的損傷［15］。課題組前期實驗發現甘草酸的水解產物甘草次酸可減輕順鉑誘導的H9c2細胞凋亡［2］。異甘草酸鎂是第4代甘草酸制劑，臨床已應用于急慢性肝損傷的治療，但其對心臟保護方面的研究較少，其作用靶點和量效關系仍待深入研究。

順鉑造成的心臟損傷可能是由心膜脂質過氧化增加后引起心肌損傷相關標志物的釋放，導致心臟結構和功能的不可逆變化。本研究結果顯示，CDDP組大鼠血清中CK-MB、cTnI水平顯著高于Control組；超聲心動圖檢測結果顯示，與Control組相比，CDDP組大鼠心功能指標LVEF、LVFS水平降低，LVEDD、LVESD水平升高，提示順鉑可導致心肌損傷和心功能障礙；與CDDP組相比，MgIG-L組和MgIG-H組大鼠血清CK-MB、cTnI水平均降低；心功能指標LVEF、LVFS均升高，LVEDD、LVESD均降低；提示異甘草酸鎂干預可以改善順鉑引起的心肌損傷和心功能障礙，具有一定的心臟保護作用。

氧化應激和炎癥在動脈粥樣硬化、心力衰竭、缺血再灌注損傷等多種心血管疾病的發病機制中發揮著重要作用［16］。ROS的過度產生和氧化應激被認為是順鉑致心肌損傷的主要機制［17］。過多的ROS誘導氧化應激，消耗細胞內抗氧化劑，進一步引起細胞損傷。氧化應激和ROS水平與順鉑誘導的心肌損傷密切相關。SOD和GSH是細胞內抗氧化損傷的關鍵酶，MDA作為細胞膜脂質過氧化的終產物，是氧化應激的標志物。本研究結果顯示，與Control組相比，CDDP組大鼠心肌組織GSH、SOD水平降低，MDA、ROS水平升高；與CDDP組相比，MgIG-L組和MgIG-H組GSH、SOD水平升高，MDA、ROS水平降低，提示異甘草酸鎂可通過抑制氧化應激水平來減輕順鉑引起的心肌損傷，發揮心肌保護作用。

氧化應激誘導的鐵死亡廣泛參與心血管疾病的發生與發展［18］。鐵代謝、谷氨酰胺代謝和脂質過氧化等在心肌細胞鐵死亡中發揮重要作用［19］。鐵離子是誘導鐵死亡的關鍵，可誘導ROS增加和脂質過氧化。本研究結果顯示，與CDDP組相比，異甘草酸鎂干預能夠降低心肌組織中Fe2+水平。Nrf2是氧化應激和鐵死亡的關鍵調節因子，可調控鐵死亡關鍵靶點GPX4［20］。有研究表明，抑制GPX4活性可導致脂質過氧化物積累，從而引起鐵死亡［21］；激活Nrf2/GPX4通路可抑制心肌細胞鐵死亡，從而發揮心肌保護作用［22］。ACSL4亦是細胞鐵死亡中的關鍵因子，下調ACSL4表達可減少細胞中脂質過氧化底物的積累，從而抑制鐵死亡［20］。FTH1調控的鐵代謝穩態是鐵死亡的重要調節點。研究表明，可通過調節FTH1水平來增強細胞抵抗脂質過氧化損傷的能力，加速對受損心肌過氧化產物的清除，抑制缺血心肌組織脂質過氧化損傷，起到保護心肌的作用［23］。本研究結果顯示，與Control組相比，CDDP組大鼠心肌組織中Nrf2、GPX4和FTH1蛋白表達水平降低，ACSL4蛋白表達水平升高，提示順鉑可引起大鼠心肌細胞鐵死亡；與CDDP組相比，MgIG-L組和MgIG-H組大鼠心肌組織中Nrf2、GPX4和FTH1蛋白表達水平升高，ACSL4蛋白表達水平降低，提示異甘草酸鎂可能通過激活Nrf2/GPX4通路抑制心肌細胞鐵死亡，改善順鉑引起的心肌損傷。

本研究通過腹腔注射順鉑構建大鼠心肌損傷模型發現，異甘草酸鎂可通過降低心肌氧化應激水平、抑制心肌細胞鐵死亡，減輕順鉑引起的大鼠心功能損傷，達到保護心臟的作用，為抗腫瘤藥物致心肌損傷治療藥物的選擇提供了實驗依據。

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（2023-11-29收稿 2024-02-05修回）

（本文編輯 陳麗潔）