鳶尾種苗中截獲的草莓滑刃線蟲形態和分子鑒定

王晨 俞祿珍 宋紹禕

摘要 草莓滑刃線蟲是一種重要的葉和芽寄生線蟲，可侵染多種重要花卉、經濟作物，被列入我國檢疫性有害生物名錄。目前，草莓滑刃線蟲的鑒定以形態學鑒定為主，但一線口岸常分離不到雌蟲，鑒定困難。本研究采用形態特征和分子特征相結合的方法對草莓滑刃線蟲進行鑒定：對鳶尾種苗中截獲的滑刃屬線蟲群體雌蟲、雄蟲進行形態觀察和形態測計并與已報道文獻進行比較;PCR擴增該群體的rDNA-ITS區并測序，構建基于ITS序列的系統發育進化樹;采用草莓滑刃線蟲特異引物對該群體DNA樣本進行擴增。結果表明：該群體與草莓滑刃線蟲俄羅斯種群的測量值相接近;系統進化關系分析顯示，該群體與NCBI公布的草莓滑刃線蟲均處于同一進化支;采用草莓滑刃線蟲特異引物PCR擴增可產生片段大小為169 bp的目的條帶。

關鍵詞 草莓滑刃線蟲; 形態學特征; 系統發育分析; 鑒定

中圖分類號： S 436.8 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019039

Abstract Aphelenchoides fragariae is a kind of important leaf and bud parasitic nematode， which can infect a variety of important flowers and cash crops. It was listed as a quarantine pest in China. At present， the identification of A.fragariae is mainly based on morphological characters， but the females are often unobtainable in the ports， which makes the morphological identification difficult. In this study， we identified A.fragariae through the combination of morphological and molecular features： the morphology of females and males were observed and morphometrics was conducted for Aphelenchoides spp. in iris bulbs; the ITS regions of ribosomal DNA were amplified and the PCR products were sequenced， and then a phylogenetic tree was constructed based on the ITS sequences. In addition， the species-specific primers were used to validate the identification. The results showed that the Aphelenchoides spp. were similar to those previously described based on morphological and morphometric comparisons. Phylogenetic analyses revealed that the Aphelenchoides spp. were grouped with A.fragariae from different origins. A single band of 169bp was amplified using species-specific primers.

Key words Aphelenchoides fragariae; morphological character; phylogenetic analysis; identification

草莓滑刃線蟲Aphelenchoides fragariae是一種葉和芽寄生線蟲，可侵染多種重要花卉、經濟作物，造成葉片、幼芽、嫩枝嚴重損傷，是極具破壞性的、具有重要經濟意義的線蟲[1-2]。草莓是該線蟲典型的寄主，感染該線蟲后，植株結果量大大減少且果小、歪曲，嚴重影響草莓的品質及產量[3-5]。該線蟲還可侵染蕨類、百合科、石蒜科、鳶尾科、毛茛科、菊科、報春花科等250 多種植物，其中涉及多種經濟價值較高的觀葉、觀花植物，已成為世界多個國家花卉產業的重要威脅之一[2-5]。該線蟲被我國列入檢疫性有害生物名錄。2017年-2018年，上海口岸多次在進境鈴蘭Convallaria majalis、酢漿草Oxalis corniculata、落新婦Astilbe chinensis、芍藥Paeonia lactiflora等觀賞花卉種苗中截獲草莓滑刃線蟲。目前，草莓滑刃線蟲的鑒定以傳統的形態學鑒定為主，但草莓滑刃線蟲及其近似種的形態特征極其相似，采用傳統的形態學鑒定方法難以區分;且分離不到雌蟲時，僅靠幼蟲或雄蟲無法進行準確鑒定，故該法的使用局限性較大。本實驗室通過查閱國內外文獻并開展試驗摸索，建立了草莓滑刃線蟲形態學與分子生物學相結合的鑒定技術，可供參考使用，現將上海口岸進境一批次鳶尾種苗中草莓滑刃線蟲的檢疫過程報道如下。

1 材料與方法

1.1 線蟲分離

口岸進境的鳶尾種苗為繁殖材料：地下部分根系稍修剪，地上部分修剪后高度僅5 cm左右（含基部莖、葉及芽）。剪取鳶尾種苗的地上部分，采用淺盤法進行線蟲分離。次日，過500目網篩收集線蟲，在體視顯微鏡下鏡檢。

1.2 形態學鑒定

挑取線蟲制成臨時玻片，在光學顯微鏡下進行形態觀察、拍照及測量，并采用de Man公式對線蟲進行測計。

1.3 分子生物學鑒定

1.3.1 線蟲DNA提取

用挑針挑取線蟲若干條，放入去離子水中洗滌3 次，備用。挑取單條經過洗滌的線蟲，用挑針捅破或割成多段，采用DNeasy Blood & Tissue Kits（Qiagen）試劑盒提取DNA。

1.3.2 通用引物PCR擴增

采用線蟲ITS通用引物對線蟲DNA進行PCR擴增：引物為F194（5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′），5368r（5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′）[6-7]。

PCR反應體系包括：10×PCR Buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L Mg2+2 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2 μL，5 μmol/L引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL， 5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.4 μL，ddH2O 15.1 μL，總體積25 μL。擴增程序為：94℃ 3 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，40個循環;72℃ 10 min。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠1×TAE緩沖液中電泳，EB染色后用凝膠成像系統分析。

將所得PCR產物送上海生工生物有限公司進行測序，測得的序列用Clustal X程序比對后進行校對和拼接，并在GenBank中BLAST，進行序列分析，利用MEGA6.0軟件以最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構建系統進化樹。

1.3.3 特異引物PCR擴增

采用草莓滑刃線蟲的特異引物對線蟲DNA進行PCR擴增： 上游引物AFragFl （5′-GCAAGTGCTATGCGATCTTCT-3′），下游引物AFragRl （5′-GCCACATCGGGTCATTATTT-3′）[2]。反應體系同1.3.2，擴增程序參照McCuiston等[2]。預期擴增產物片段大小為169 bp[2]。

2 結果與分析

2.1 形態學描述

雌蟲：蟲體細長，熱殺死后蟲體直到彎;側區窄，側線2條。頭部稍高、光滑，前端平，略縊縮;口針細，口針基部球小而明顯。食道體部呈細長管狀，中食道球明顯，呈長卵圓形。食道腺長葉狀，背覆蓋腸。陰門位于體中后部，陰門唇稍突起，陰門橫裂，陰道向前傾斜，陰道長約為陰門處體寬的1/2。單卵巢，前伸，卵母細胞單行排列。受精囊長卵圓形，通常有精子。后陰子宮囊長囊狀，長度超過肛陰距的1/2，常有精子。尾長圓錐形，末端尖細，中間有一鈍的尾尖突。

雄蟲：熱殺死后蟲體尾部向腹面彎曲，體前部與雌蟲相似。單精巢，前伸，精母細胞單行排列。交合刺玫瑰刺形，有中等發達的基頂和基喙，交合刺背緣長19.2～22.2 μm。尾部具3對尾乳突，分別位于肛門后、尾中部和近尾端處。尾圓錐形，末端有1個鈍的尾尖突。

2.2 測量值

本研究種群草莓滑刃線蟲雌蟲的形態測量值和其他種群比較結果顯示：與Chizhov[9]描述的俄羅斯種群相比，a、b、c、c′、V值基本吻合;其他測量值體長、口針長、尾長較長，但其數值范圍部分重疊。與顧建鋒描述的荷蘭種群相比，b、c、V值及口針長一致性較高;雖本種群體長較長，但在荷蘭種群的范圍內;a值存在一定差異。與國內劉維志描述的種群相比，b、c′、V值、口針長、尾長較一致;L、a、c值較大，但測量值均有重疊范圍。雄蟲測量值體長、口針長較其他種群較長，a、b、c值均與各種群測量值范圍大部分重疊。

2.3 ITS區系統進化分析

采用引物F194/5368r對該種群線蟲的rDNA-ITS區域進行擴增，得到約700 bp的片段，經雙向測序及拼接得到643 bp序列。通過BLAST比對分析，發現該序列（NCBI登錄號為MK077678）與草莓滑刃線蟲（EU186070、AF119049）序列相差2 bp，相似度達99.67%～99.68%。系統發育樹顯示該線蟲與草莓滑刃線蟲位于同一分支，支持率為100%。其中，本線蟲群體與俄羅斯（EU186070）、日本（AF119049）的種群親緣關系更近。

2.4 特異引物檢測

采用草莓滑刃線蟲特異引物擴增本研究種群雌蟲、幼蟲DNA，樣本及陽性對照均獲得169 bp的特異性片段，空白對照未發生特異性擴增（圖4）。

綜合形態學特征及分子鑒定結果，確認鳶尾種苗中截獲的線蟲為草莓滑刃線蟲Aphelenchoides fragariae。

3 討論

近年來，我國花卉產業規模不斷擴大，種球的進口需求量也大幅增加。據統計，我國已成為僅次于美國的荷蘭花卉種球第二大進口國[10]。進口的種球品種繁多，主要有百合、風信子、郁金香、洋水仙等。球根類花卉是多年生草本花卉，可在地下存活多年，因此其根莖攜帶有害線蟲的風險很高。近年來，我國口岸多次在進境種苗中截獲鱗球莖莖線蟲、腐爛莖線蟲、草莓滑刃線蟲、菊花滑刃線蟲等檢疫性線蟲[11]。

草莓滑刃線蟲是重要的檢疫性病原線蟲。該線蟲世界分布范圍廣，歐洲、原蘇聯各成員國、日本、美國、加拿大、新西蘭、澳大利亞等國均有報道，我國局部地區（遼寧、廣東、云南等）有報道發生[1，3-4]。該線蟲的遠距離傳播主要依靠種苗的調運，因此口岸應加強對進境種苗的線蟲檢疫工作，謹防檢疫性線蟲隨種苗在國內種植時擴散，對我國農林業、花卉業生產造成嚴重威脅。

目前對草莓滑刃線蟲的鑒定主要依靠傳統的形態學鑒定。但草莓滑刃線蟲及其近似種的形態特征極其相似，傳統的形態學鑒定方法很難區分。如A.besseyi、A.pseudolesistus、A.oryzae、A.olesistus等都曾在一段時間內被認為是草莓滑刃線蟲的同物異名[12]。本實驗室采用形態學與分子生物學相結合的鑒定方法，可實現對樣品中的幼蟲進行鑒定，且對鑒定人員的專業性要求不高，適合一線口岸進行推廣。

本次鳶尾種苗中截獲的草莓滑刃線蟲種群，其形態測量值與俄羅斯種群最接近;基于ITS區構建的系統發育樹顯示，該種群與俄羅斯種群親緣關系更近。這可能與該批鳶尾種苗來自于荷蘭相關。

參考文獻

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（責任編輯： 田 喆）