黃菊花組織培養研究進展及不同植物生長調節劑配方對愈傷組織誘導情況的研究

張 冰 楊星宇 駱美雯 于少波

（河北農業大學，河北 保定 071001）

0 引言

菊花（L.）為菊科菊屬多年生宿根草本植物，是我國傳統名花之一。筆者此次所研究的菊花為黃菊花。黃菊花具有極強的觀賞價值和藥用價值，因此得到了廣泛栽培。黃菊花的繁殖方式多為無性繁殖。但是，黃菊花繁殖周期較長、易受到環境變化的影響，而且其基因高度純和、遺傳組成復雜，因此，在常規的育種方法中易受到染色體多倍性和非整倍性的影響，常造成自交不親和及種子生產效率低等問題?，F階段，市場對黃菊花的需求量急劇增加，傳統的培育方式已不能滿足日益增長的消費需要，而利用組織培養技術可實現黃菊花迅速繁殖、大量成苗、脫毒及保持其品種特性等，在短時間內可生產大量黃菊花試管苗。選用組織培養脫毒苗進行黃菊花栽培，不僅可以增強黃菊花的適應性和抗逆性，提高其種苗品質，而且可以減少在栽培生長過程中對農藥的使用，這對于生態環境的保護具有非常重要的意義。目前，黃菊花組織培養技術應用廣泛，但在培養過程中依然存在內生菌、褐變、試管苗玻璃化及生根難等問題，需要相關研究人員進行深入研究。

1 黃菊花組織培養外植體及培養條件的選擇

1.1 外植體的選擇

植物細胞具有全能性，因此，黃菊花各部分組織均有一定的分化能力。現階段，黃菊花組織培養中多選用帶芽的菊花莖段和節間中段作為外植體。因為帶芽的莖段更容易成活且生長速度快，易直接從芽生長成幼苗；而以節間中段為外植體時，則需要先經過脫分化形成愈傷組織，然后再分化形成幼苗。黃菊花莖段上的側芽在組織培養過程中直接發育成愈傷組織再分化形成叢芽，此過程不易觀察，但若使用的植物生長調節劑質量濃度較高，側芽則會明顯分化出細胞團狀愈傷組織；而節間中段在組織培養過程中脫分化、再分化過程明顯，且成功率高。但石虹梅等研究發現，部分莖段在培養14 d后易出現褐化死亡現象。邵冰潔等用小濱菊的莖段為外植體在70%酒精中浸泡15 s，在4%次氯酸鈉溶液中再浸泡5 min，消毒效果較好，無菌率超過85%；同時使用質量濃度為0.5 mg/L的細胞分裂素6-BA加質量濃度為0.5 mg/L的生長素NAA開始外植體啟動培育，啟動率可達到 80%，研究結果與姜桂俠等研究結果相似。菊花葉片同樣可以作為外植體，葉齡是決定組織培養效果的重要因素之一，如果葉齡過老會導致再生困難，葉齡太小則容易在培養后壞死。因此，常選擇植株上端兩三片幼齡壯葉作為培養材料，以利于組織培養的順利進行。丁曉霞選取春季幼嫩莖段或新生葉片為外植體有相似發現；但高亦珂等以地被菊和傳統菊花的葉片和莖段為外植體對比，在相同條件下以莖段為外植體的誘導愈傷率高于葉片作為外植體。同時，裴紅美等也對瓜葉菊小丑系列品種葉片和葉柄為外植體進行對比，發現菊花葉片的再生能力優于葉柄，但在快繁中并不建議采用葉片作為外植體，因為葉片背生絨毛，滅菌消毒效果不好。大量研究者在進行重復試驗中發現，菊花葉片的愈傷組織分化形成叢芽的成功率非常低，并且愈傷組織容易長到一定程度后不再進行分化，甚至不繼續生長，最后死亡。因此，筆者采用黃菊花莖段作為外植體建立無菌培養體系。一般來說，選取黃菊花莖尖頂端圓錐區長度小于0.1 mm的分生組織進行培養效果最好，但目前其實際操作較為困難并且不易成活。

1.2 菊花組織培養條件的選擇

就培養的外部因素來看，溫度、濕度、光照、pH值等均會影響外植體的脫分化及再分化。趙維萍等發現，菊花組織培養在光照時間12 h/d與黑暗培養12 h/d相結合、光照度在2 000～3 000 lx、溫度在25 ℃左右條件下較為適宜；相對濕度在80%左右、培養基pH值為5.8～6.0時較利于組織培養苗的生長；不同菊花外植體用到的原代、繼代、生根培養基不同，但均以MS培養基為基礎，只是植物生長調節劑種類、質量濃度有差異。不同植物生長調節劑配比對愈傷組織的誘導、分化、增殖、生根起著不同的作用。

1.3 原代培養基

利用菊花莖段為外植體時，李翠香等和蘇寶玲等研究所用的細胞分裂素6-BA質量濃度均為2.0 mg/L，但前者所用TK質量濃度為0.5 mg/L，后者所用NAA質量濃度為0.2 mg/L，均為其試驗中最佳的愈傷組織誘導培養基。湯春梅采用菊花滿天星品種的莖段作為外植體，選擇MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培養基作為最佳的誘導培養基。邱美歡等用神馬菊莖段作為外植體時，所用的最佳誘導培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。上述研究中表明，針對不同品種的菊花可能需要不同的植物生長調節劑及質量濃度。

1.4 繼代培養基

袁成志等用菊花葉片作為外植體，最佳叢生芽繼代培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；李曉亮等用盆栽菊花香草水晶的莖尖作為外植體，最佳培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L；齊向英等用含有腋芽的莖段作為外植體，所用的最佳繼代培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L+TDZ 0.01 mg/L。由于菊花品種不同、外植體不同，培養過程中所用植物生長調節劑種類和質量濃度配比也會隨之改變，繼代培養會使外植體的叢芽進一步壯大。

1.5 生根培養基

龔明霞等用黃繡球菊花莖段作為外植體時所用最佳生根培養基為1/2 MS+NAA 0.2 mg/L。大量文獻顯示，生根培養均未用到6-BA，NAA生長素更易誘導不定根生成且大部分用到的MS均為1/2。綜上所述，生根培養基以1/2 MS+NAA 0.5 mg/L效果最佳。

筆者此試驗研究以黃菊花莖段作為外植體進行組織培養時，其在不同濃度6-BA條件下愈傷組織的生長情況。

2 不同質量濃度植物生長調節劑配比對愈傷組織的誘導試驗

2.1 材料與方法

2.1.1 材料與設備。試驗材料為黃菊花幼嫩莖段，取自保定市花鳥魚蟲花卉市場。試驗器具主要有高壓蒸汽滅菌鍋、光照培養箱、無菌操作臺、培養瓶、量筒、燒杯、酒精燈、培養皿、pH試紙等。

2.1.2 試驗過程

2.1.2.1 外植體準備。將獲取的菊花幼苗在清水中清洗數次，剪去葉片截取幼嫩莖段，再沖洗三四次后晾干。在超凈工作臺上，用75%乙醇浸泡30～60 s，再用無菌水沖洗1～3次，放入0.15%升汞（84消毒液）溶液中消毒5 min，用無菌水沖洗3～5次（每次3 min），滅菌濾紙上濾干水分。將菊花莖段切成長度約為0.5 cm的小段，無菌水再次沖洗一兩次，取出放置在滅菌的4層紗布或濾紙上濾干水分，準備接種。

2.1.2.2 培養基準備。試驗所用叢芽誘導培養基共有3種，分別為A：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L，B：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L，C：MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L。

叢芽繼代培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，生根培養基為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L。外界環境：光照度2 000～3 000 lx，光照培養時間為12 h/d，黑暗培養為12 h/d，溫度為24～26 ℃，pH值為 5.6～ 5.8。

2.1.2.3 接種試驗。接種A、B、C原代培養基各72瓶。將長度為0.5 cm的菊花莖段外植體在無菌條件下接種到培養基上，并給予誘導分化培養。外植體在誘導培養基中培養10 d、15 d、30 d，觀察愈傷組織形態、生長狀況，并記錄匯總數據。

2.2 結果與分析

接種A、B、C原代培養基各72瓶接種后，除去褐化、玻璃化、內生菌污染，補救后得到A種培養基40瓶，B種培養基長勢很好得到48瓶，C種培養基補救后得到24瓶。用黃菊花莖段作為外植體進行組織培養時，其在不同質量濃度6-BA條件下愈傷組織的生長情況見表1。其中，接種培養數是成功誘導出愈傷組織的外植體數。

表1 黃菊花不同質量濃度6-BA條件下愈傷組織誘導情況

由表1數據可知，試驗中MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L培養基對黃菊花莖段愈傷組織的誘導狀況最佳。

2.3 結論與討論

試驗中發現，黃菊花莖段在培養中褐化問題較嚴重，外植體在生長過程中會產生褐化物并向外擴散，使培養基產生褐變造成培養失敗，嚴重影響外植體的脫分化和再分化。究其原因，可能是黃菊花體內含有較多的酚類化合物，在多酚氧化酶的作用下，酚類化合物會氧化形成棕褐色的醌類和水酚類物質，并且會在酪氨酸酶等酶的作用下使外植體的蛋白質聚合導致生長停頓，繼而走向死亡。

目前，種植者可通過以下方法進行改善：①選擇適宜外植體，菊花莖尖有較強的分生能力，處于旺盛生長狀態，可減少褐變；②縮短轉瓶時間；③在培養基中加入抗氧化劑，如維生素C、檸檬酸、硫代硫酸鈉、二硫蘇糖醇及谷胱甘肽等；④試驗中常用0.01%～0.10%活性炭吸附酚類氧化物，可減緩培養物褐變程度。

3 菊花培養目前存在的問題及展望

目前，菊花轉基因育種多致力于改變花色、花形、花期、株形和抗病蟲等方面，但外源目的基因在黃菊花中的表達不穩定、轉化效率低，還有待深入研究。菊花的有性雜交和芽變選種已經獲得了較好的效果，但是方法尚不夠成熟。不同菊花品種對胚性愈傷組織誘導的影響較大，如玉人面、鋪地金、紫妍、杭白菊等黃綠色菊花品種胚性愈傷組織的誘導和間接體細胞胚發生的能力較強，花朵繁密的茶用菊花品種次之，植株較大的切花菊花品種間接體細胞胚發生的能力最弱。筆者采取的菊花組織培養技術由于染色體發生顯著改變和染色體反常，直接或間接地導致組織培養中出現變異問題，會降低黃菊花原有價值，這也是未來需要關注的問題之一。

在眾多方式中，若想短時間內獲得成千上萬數量的菊花苗，組織培養是最優的方式之一，同時可結合脫毒技術解決病蟲害問題。還可通過加強高校、研究院、企業之間的合作，使菊花組織培養技術得到進一步的改進，提高試驗的脫毒效果、繁殖效率及可重復性，從而實現菊花苗木快速高效優質的大量繁殖。