混料設(shè)計(jì)優(yōu)化生物酶解提取花生油脂體復(fù)合酶配比

魏松麗,張麗霞,蘆 鑫,孫 強(qiáng),孫曉靜,賈 聰,麻 琳

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，鄭州 450002)

油脂體是由磷脂單分子層、嵌插在磷脂層中的膜蛋白和被磷脂層包裹的中性脂組成的簡單細(xì)胞器，是油料作物內(nèi)儲存脂肪的重要亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[1]，具有易提取、乳化性及穩(wěn)定性好的特點(diǎn)[2-3]，在食品、醫(yī)藥、化妝品及飼料等領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)前景[4]。花生作為主要油料作物之一，其油脂體含量高且含有豐富的不飽和脂肪酸和維生素E[5]，但油脂體的釋放通常受纖維素、木質(zhì)素和果膠等成分組成的細(xì)胞壁限制。因此，有效破壞細(xì)胞壁，增加花生油脂體的提取率，對提高植物油料的加工利用水平和產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率具有深遠(yuǎn)意義。

據(jù)Kapchie[6]、徐澤健[7]等報(bào)道機(jī)械研磨或生物酶解破壞細(xì)胞壁組織能夠有效提高油脂體的提取率。其中機(jī)械研磨被廣泛應(yīng)用于大宗油料作物(如大豆[8-9])和特色作物油脂體(玉米胚芽)的提取中，但研究表明[10]機(jī)械研磨在有效破壞細(xì)胞壁的同時(shí)也使貯存蛋白質(zhì)的液泡破裂，導(dǎo)致油脂體表面吸附的外源性蛋白增加?？紤]到機(jī)械研磨對油脂體純度的影響及酶制劑價(jià)格的不斷下降，越來越多的學(xué)者采用生物酶解的方式破壞油料細(xì)胞壁以提高油脂體的提取率。Rujira[11]發(fā)現(xiàn)纖維素酶酶解能顯著提高玉米胚芽油脂體的提取率(23.09%)；Kapchie等[6]應(yīng)用β-葡聚糖酶、纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶處理大豆粉得到油脂體。趙自通等[12]在機(jī)械粉碎的基礎(chǔ)上利用商品化復(fù)合植物水解酶處理花生樣品，花生油脂體的提取率有明顯提高，但相對于后期復(fù)配的復(fù)合植物水解酶，商品化復(fù)合植物水解酶存在成本高且針對性差的問題。因而，研制出一種價(jià)格合理、針對性強(qiáng)且水解效果佳的復(fù)合植物水解酶對增加花生油脂體的提取率及開展花生油脂體的深入研究尤為重要。

本研究采用混料設(shè)計(jì)中的單純形質(zhì)心方法對生物酶解提取花生油脂體的復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶)進(jìn)行配方設(shè)計(jì)，通過分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立回歸模型，考察各組分對生物酶法提取花生油脂體的影響規(guī)律，并以花生粗油脂體提取率為評價(jià)指標(biāo)對復(fù)合酶的配比進(jìn)行優(yōu)化，以期為生物酶解法提取花生油脂體開發(fā)一種成本低的新型高效復(fù)合酶。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

脫紅衣花生(粗蛋白質(zhì)含量25.60%±0.13%，粗脂肪含量46.94%±0.66%，水分含量4.26%±0.20%，灰分含量2.68%±0.04%)，國家油料改良中心河南花生分中心；纖維素酶(酶活2.0×104U/g)、果膠酶(酶活3.0×104U/g)、木聚糖酶(酶活3.0×104U/g)，龐博生物工程有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-6300紫外分光光度計(jì)；DXF-060型手提式中藥粉碎機(jī)；PL203型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SHA-B型水浴恒溫振蕩器；DL-5-B型大容量低速離心機(jī)；D2X-6022B型真空干燥箱；T-18-DS-25型數(shù)顯高速剪切機(jī)；DW-40W380型低溫保存箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物酶法提取花生油脂體

生物酶法提取花生油脂體的工藝流程見圖1。

圖1 生物酶法提取花生油脂體的工藝流程

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)定生物酶法提取花生油脂體的主要工藝參數(shù)為粉碎目數(shù)100目、液料比5∶1、均質(zhì)速率12 000 r/min、均質(zhì)時(shí)間5 min、復(fù)合酶加酶量500 U/g、酶解時(shí)間2.0 h、酶解溫度50℃、酶解pH 6.0。粗油脂體的提取率按公式(1)計(jì)算。

(1)

式中：m為粗油脂體質(zhì)量，g；M為脫紅衣花生質(zhì)量，g。

1.2.2 油脂體基本成分的測定

水分及揮發(fā)物測定：GB 5009.3—2010；粗脂肪測定：GB/T 1477.2—2008；粗蛋白質(zhì)的測定：GB 5009.5—2010；灰分測定：GB 5009.4—2016。

1.2.3 純度的測定

取一定量1.2.1中制備的粗油脂體均勻分散于PBS-蔗糖緩沖液(PBS質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，料液比1∶5)，高速冷凍離心分離(4℃，10 000 r/min，15 min)，收集上層乳狀物，重復(fù)上述操作3次，得到純油脂體，稱重，按公式(2)計(jì)算粗油脂體純度。

(2)

式中：mp為純油脂體的質(zhì)量，g。

1.2.4 色澤的測定

利用Adobe Photoshop CS6中取色器對固定焦距和曝光度的樣品照片進(jìn)行取色，每個(gè)樣品取色3次，結(jié)果由紅值(R)、綠值(G)和藍(lán)值(B)綜合評定[13]。

1.2.5 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定

參考You等[14]的方法并略作改進(jìn)。取適量粗油脂體均勻分散于0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7.2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%)中。15 mL大豆油與60 mL 1 mg/mL的樣品稀釋液混合，高速剪切機(jī)10 000 r/min均質(zhì)1 min，室溫靜置10 min，取靜置0 min和10 min時(shí)玻璃管底部的乳化液800 μL，加入到10 mL 0.1%SDS溶液中，于500 nm波長下測量吸光值，分別按公式(3)和公式(4)計(jì)算乳化性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)。

(3)

(4)

式中：A0為樣品乳狀液靜置0 min時(shí)在波長500 nm處的吸光值；c為樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL；a為油相體積分?jǐn)?shù)；n為稀釋倍數(shù)；A10為樣品乳狀液靜置10 min時(shí)在波長500 nm處的吸光值。

1.2.6 凍融穩(wěn)定性的測定

參考Ariyaprakai等[15]的方法并略作改進(jìn)。每個(gè)樣品乳液取8 cm至平底玻璃試管中，放置于-20℃ 恒溫冷凍箱中冷凍24 h，然后取出置于恒溫水浴中30℃貯存2 h，室溫靜置1 h后測定乳清層高度，根據(jù)公式(5)計(jì)算乳析指數(shù)CI。

(5)

式中：H1為乳清層高度，cm；H2為乳液總高度，cm。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)平行測定3次，采用Minitab 17和Origin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 混料實(shí)驗(yàn)

2.1.1 混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Minitab 17軟件通過設(shè)置上、下限約束條件進(jìn)行混料設(shè)計(jì)，根據(jù)Minitab 17軟件隨機(jī)化生成的設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Minitab 17提供了單純形質(zhì)心、單純形格點(diǎn)和極端頂點(diǎn)3種混料設(shè)計(jì)，本實(shí)驗(yàn)采用單純形質(zhì)心設(shè)計(jì)，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)模型建立和參數(shù)優(yōu)化。

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶聯(lián)合作用的最佳酶解條件下，通過混料設(shè)計(jì)對3種酶的配比進(jìn)行優(yōu)化。以纖維素酶復(fù)合比例(A)、果膠酶復(fù)合比例(B)和木聚糖酶復(fù)合比例(C)為自變量，以花生粗油脂體提取率為因變量，每個(gè)因素設(shè)定6個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(每組設(shè)立3個(gè)平行)，對生物酶法提取花生油脂體的復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶)進(jìn)行配方設(shè)計(jì)，利用選取的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)組成11個(gè)實(shí)驗(yàn)組合，確定3種酶的最佳復(fù)合比例。混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.1.2 混料實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒓帮@著性檢驗(yàn)

通過Minitab 17進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，建立回歸方程：R=46.60A+44.27B+43.82C+5.77AB+4.77AC-1.86BC+18.10ABC。

混料實(shí)驗(yàn)方差分析見表2。

表2 混料實(shí)驗(yàn)方差分析

由回歸方程可知，3個(gè)一次項(xiàng)的系數(shù)均為正數(shù)，表明該3種酶單一使用時(shí)對花生粗油脂體提取率的提高均起到促進(jìn)作用，且貢獻(xiàn)大小依次為A>B>C，表明在復(fù)合酶中纖維素酶起著較為主要的作用。3個(gè)二次項(xiàng)的系數(shù)中，2個(gè)系數(shù)為正，1個(gè)系數(shù)為負(fù)，表明纖維素酶與果膠酶、纖維素酶與木聚糖酶2個(gè)交互項(xiàng)對花生粗油脂體提取率的提高起到促進(jìn)作用，而果膠酶與木聚糖酶交互項(xiàng)則不利于花生細(xì)胞內(nèi)油脂體的釋放。這主要是由于纖維素是細(xì)胞壁的主要骨架物質(zhì)，在纖維素未被破壞的情況下，果膠酶與木聚糖酶水解細(xì)胞壁的程度有限，不利于花生油脂體的提取。

為分析復(fù)合酶中各成分復(fù)合比例與花生中油脂體釋放量的關(guān)系，采用Cox響應(yīng)跟蹤曲線反映各因素對花生粗油脂體提取率的影響，見圖1。

圖1 復(fù)合酶成分的Cox響應(yīng)跟蹤曲線

以3種酶的配比為1∶1∶1(即每種酶的復(fù)合比例均為0.33)時(shí)為參考混料基準(zhǔn)。由圖1可知，當(dāng)纖維素酶復(fù)合比例從0.33增加到0.65左右，同時(shí)適當(dāng)減少其他兩種酶的復(fù)合比例，花生粗油脂體的提取率上升；繼續(xù)增加纖維素酶的復(fù)合比例，花生粗油脂體的提取率下降。分析原因?yàn)椋寒?dāng)與果膠酶等多糖酶共同作用時(shí)，纖維素酶能有效降解花生細(xì)胞壁的主要骨架[17]，促進(jìn)花生油脂體的溶出；但當(dāng)纖維素酶的相對添加量過大時(shí)，其他多糖酶的水解作用受到抑制，從而不利于細(xì)胞壁的降解和油脂體的析出。果膠酶和木聚糖酶對花生粗油脂體提取率影響相似，都是先上升后下降，這可能與花生細(xì)胞壁的鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)[18]，說明細(xì)胞壁多糖酶的配比影響花生油脂體的提取效果，且在多糖酶配比適當(dāng)時(shí)，纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶具有良好的協(xié)同作用。

為進(jìn)一步分析各因素及其交互項(xiàng)對花生粗油脂體提取率的影響并得出最佳的配比，在分析Cox響應(yīng)跟蹤圖的基礎(chǔ)上，采用Minitab 17混合等值線分析纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶的復(fù)合比例對花生粗油脂體提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 混料設(shè)計(jì)因素交互項(xiàng)對花生粗油脂體提取率的等值線圖

由圖2可知，A(纖維素酶復(fù)合比例)、B(果膠酶復(fù)合比例)、C(木聚糖酶復(fù)合比例)交互作用對花生粗油脂體的提取率影響顯著，其中纖維素酶與果膠酶、纖維素酶與木聚糖酶共同水解作用對粗油脂體提取率的提高均明顯，而果膠酶與木聚糖酶的共同水解作用對粗油脂體提取率的提高作用不顯著。在固定酶解條件的情況下，3種多糖酶以一定比例混合花生粗油脂體的提取率可得最大值，其中3個(gè)因素對花生粗油脂體提取率的影響大小依次為A>B>C，與方差分析結(jié)果一致。

進(jìn)一步采用Minitab 17軟件的相應(yīng)優(yōu)化器分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在纖維素酶復(fù)合比例為0.63、果膠酶復(fù)合比例為0.24、木聚糖復(fù)合比例為0.13時(shí)，即纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶配比為0.63∶0.24∶0.13時(shí)，花生粗油脂體的提取率得到最大值，為47.24%±0.26%。

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶配比為0.63∶0.24∶0.13條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，取平均值，花生粗油脂體提取率驗(yàn)證值為47.08%±0.13%，花生粗油脂體提取率的驗(yàn)證值與預(yù)測值間的標(biāo)準(zhǔn)偏差在合理范圍內(nèi)，即響應(yīng)值的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測值吻合良好，這表明利用混料設(shè)計(jì)得到復(fù)合酶的最佳配比切實(shí)可行且重復(fù)性好。

2.3 花生粗油脂體品質(zhì)

為了考察上述復(fù)合酶酶解提取的花生粗油脂體的品質(zhì)，測定了花生粗油脂體的基本組成和理化性質(zhì)，結(jié)果分別見表3和表4。

表3 花生粗油脂體的基本成分(濕基)

表4 花生粗油脂體的基本理化性質(zhì)

由表3可以看出，花生粗油脂體中主要成分為粗脂肪和粗蛋白質(zhì)，含量分別為60.14%±3.75%和8.06%±0.63%?？挡╗19]生物酶法提取花生油脂體的結(jié)果為：花生油脂體中脂肪含量為69.94%±0.06%，蛋白質(zhì)含量為1.96%±0.03%?？梢园l(fā)現(xiàn)本文提取油脂體的基本成分與康波酶法提取油脂體的成分接近，差異可能是由于本實(shí)驗(yàn)對提取的花生粗油脂體清洗不完全，致使很多吸附于油脂體表面的外源性蛋白未被洗脫[20]，從而增加了蛋白質(zhì)含量，降低了脂肪含量。

由表4可知，該復(fù)合酶提取的花生油脂體純度較高，色澤均一清淺，乳化性及乳化穩(wěn)定性良好，凍融穩(wěn)定性較差，原因可能是油脂體經(jīng)過低溫冷凍和加熱融化處理后，表面膜上的內(nèi)源性蛋白及吸附的外源性蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[21]，致使油脂體的持水性和持油性降低。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用混料設(shè)計(jì)，以花生粗油脂體提取率為指標(biāo)，對纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶配比進(jìn)行優(yōu)化。通過建立回歸模型和交互項(xiàng)分析確定各因素對花生粗油脂體提取率的影響程度依次為纖維素酶復(fù)合比例>果膠酶復(fù)合比例>木聚糖酶復(fù)合比例，纖維素酶、果膠酶、木棸糖酶最佳配比為0.63∶0.24∶0.13，在此復(fù)配比例下花生粗油脂體的提取率預(yù)測值為47.24%±0.26%。根據(jù)預(yù)測配比進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，花生粗油脂體提取率為47.08%±0.13%，與回歸方程預(yù)測值吻合良好，表明利用混料設(shè)計(jì)得到復(fù)合酶的最佳配比切實(shí)可行且重復(fù)性好。所提取的花生油脂體純度較高，色澤清淺，加工性能較佳，具有良好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。