白術(shù)不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性

曹清華， 杜 瑩， 韋萬麗， 周清娣， 廖莉玲

(1.貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550001； 2.悉尼大學(xué)化學(xué)學(xué)院，澳大利亞悉尼 2006)

從中草藥中提取抗氧化活性成分的研究已被國內(nèi)外學(xué)者青睞，開發(fā)天然抗氧化劑已經(jīng)成為研究的熱點[1-2]。白術(shù)為菊科植物，其有效活性成分主要有白術(shù)內(nèi)酯類、多糖和揮發(fā)油等[3]。目前，已有對白術(shù)黃酮、多糖抗氧化活性的研究[4-5]，但是鮮有對白術(shù)提取物化學(xué)成分含量和抗氧化活性的相關(guān)性報道。為了深入研究白術(shù)抗氧化活性成分，本研究采用清除2，2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基與測定總還原能力的方法，系統(tǒng)地評價白術(shù)粗提物不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性，并探討各萃取物的抗氧化能力及其與總多酚、總黃酮、總多糖含量之間的相關(guān)性，以期為白術(shù)抗氧化活性物質(zhì)的進一步研究及白術(shù)的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白術(shù)，由貴州同濟藥業(yè)有限公司提供；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，分析純，購自貴州迪大科技有限責(zé)任公司；二苯基苦味酰基苯肼，分析純，購自東京化成株式會社；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；ABTS，分析純，購自上海源葉生物有限公司；其余試劑均為分析純。

分光光度計(L5s型，上海儀電分析儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52型，上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(A200S型，德國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備 將白術(shù)粉碎后過40目篩，稱取3 000 g白術(shù)粉末，用87%甲醇按料液比1 g ∶30 mL混勻，于62 ℃水浴提取2次，每次1.5 h，合并2次提取液，抽濾，于55 ℃真空減壓濃縮至粉末狀，得到粗品。取一定量粗品，用蒸餾水溶解，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，萃取3次，旋干各相溶液，分別得到石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相樣品，按照式(1)計算得率：

C=m1/m2×100%。

(1)

式中：C為得率，%；m1為旋干后各部分的樣品質(zhì)量，g；m2為起始加入的白術(shù)樣品質(zhì)量，g。

1.2.2 總多酚含量的測定 參照文獻[6]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，精確配制濃度為0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1、2、3、4、5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次加入2 mL FC試劑(即Folin-Ciocalteu試劑)、7.5 mL 15%碳酸鈉溶液，定容到25 mL容量瓶中，反應(yīng)時間為50 min，反應(yīng)溫度為35 ℃，在最大吸收波長770 nm下測定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度。在同樣條件下測定不同樣品的吸光度，平行測定3次，代入回歸方程，計算白術(shù)各溶劑萃取物樣品的總多酚含量。

1.2.3 總黃酮含量的測定 總黃酮含量的測定采用 NaNO2-Al(NO3)3比色法[7]，以蕓香苷為標(biāo)準(zhǔn)品，精確配制濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，等梯度取不同體積的溶液于 25 mL 容量瓶中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉，反應(yīng)6 min后加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min后再加入4.3%氫氧化鈉溶液，定容，搖勻后靜置20 min，在515 nm處測定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度。在同樣條件下測定不同溶劑萃取物樣品的吸光度，平行測定3次，代入相應(yīng)的回歸方程，計算白術(shù)各溶劑萃取物樣品的總黃酮含量。

1.2.4 總多糖含量測定 采用硫酸苯酚法[8]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，精確配制濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，等梯度取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL具塞試管中，加入1 mL 5%苯酚溶液，再迅速加入5 mL濃硫酸，于沸水中反應(yīng)30 min，冷卻后在490 nm處測定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度，在此條件下測定不同溶劑萃取物樣品的吸光度，平行測定3次，代入回歸方程，計算白術(shù)各溶劑萃取物樣品的總多糖含量。

1.2.5 抗氧化能力測定 (1)清除DPPH自由基能力的測定。測定方法參考文獻[9]，并作適當(dāng)修改：取一定質(zhì)量的樣品，用80%甲醇溶解，配制成不同濃度的樣液，分別向10 mL容量瓶中加入2 mL不同濃度的樣液，再加入5 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，最后用80%甲醇定容到10 mL。搖勻后避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長下測定吸光度。平行測定3次，以維生素C作為陽性對照，按式(2)計算清除率，并計算清除DPPH自由基的IC50。

R=[1-(D517 nm(a)-D517 nm(a))/D517nm(c)]×100%。

(2)

式中：R為自由基清除率，%；D517 nm(a)為待測液的吸光度；D517 nm(b)為不加自由基的吸光度；D517 nm(c)為不加樣液的吸光度。

(2)清除ABTS自由基的測定。測定方法參考文獻[10]，并作適當(dāng)修改：將樣品配制成濃度為0.2 mg/mL的樣液，分別取1、2、3、4、5 mL到10 mL容量瓶中，加入5 mL 0.2 mmol/L ABTS溶液，用無水乙醇定容到10 mL，室溫下反應(yīng)15 min后，在733 nm處測吸光度，平行測定3次，以維生素C作為陽性對照，清除率按式(2)計算，并求出清除ABTS自由基的IC50。

(3)總還原能力測定。測定方法參考文獻[11]，并作適當(dāng)修改：取1 mL樣液，加入1 mL 磷酸緩沖鹽溶液(即PBS，濃度為0.1 mol/L，pH值=6.8)、1 mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液混勻，于50 ℃水浴30 min。冷卻后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后在6 000 r/min下離心10 min，取2 mL上清液，加 3 mL 蒸餾水和1 mL 0.1%氯化鐵溶液，靜置10 min后，在700 nm處測定其吸光度，平行測定3次(吸光度越大，說明樣品的總還原能力越強)。

1.2.6 相關(guān)性分析 采用Excel 2007處理數(shù)據(jù)并作圖，通過SPSS 20.0軟件對清除ABTS自由基、DPPH自由基、總還原能力與總多酚、總黃酮、總多糖含量進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮、總多酚和總多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度對濃度作圖，得出總多酚含量的回歸方程為y=115.4x+0.030 4，r2=0.999 6，式中：y為D770 nm；x為多酚含量(mg/mL)。總黃酮的回歸方程為y=11.363x+0.001 9，r2=0.999 9，式中：y為D515 nm；x為總黃酮含量(mg/mL)。總多糖含量的回歸方程為y=0.012 8x+0.038 7，r2=0.999 6，式中：y為D490 nm；x為多糖濃度(mg/mL)。

2.2 白術(shù)不同極性溶劑萃取物的總黃酮、總多酚和總多糖含量

由表1可知，不同極性溶劑萃取的得率以水相最高，為(86.53±1.66)%，說明白術(shù)粗提取物中水溶性物質(zhì)比較多，其次是正丁醇相，得率為(6.25±0.21)%，石油醚相的得率最低，為(1.14±0.11)%，表明白術(shù)粗提取物中極性較小的物質(zhì)比較少。各分段部位中乙酸乙酯相中的總多酚含量最高，為(37.54±0.51)%，其次是正丁醇相、三氯甲烷相，總多酚含量分別是(17.64±0.56)%、(13.42±0.88)%，表明白術(shù)的粗提取物中多酚類物質(zhì)屬于中等極性的較多。各分段部位中總黃酮含量以乙酸乙酯相中最高，為(30.53±0.92)%，正丁醇相、三氯甲烷相中的總黃酮含量相差不大，分別為(18.83±0.02)%、(18.14±0.61)%，水相中總黃酮含量最低，為(4.22±0.79)%，表明白術(shù)的粗提取物中的黃酮類物質(zhì)屬于中等極性的較多，在極性大的溶劑中黃酮類物質(zhì)含量較低。在各分段部位中，水相中的總多糖含量最高，為(22.58±0.34)%，石油醚相中總多糖含量最低，為(1.31±0.13)%。

表1 白術(shù)不同極性溶劑萃取物中的總黃酮、總多糖、總多酚含量及得率

2.3 白術(shù)不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性

2.3.1 清除ABTS自由基能力 由表2、圖1可以看出，白術(shù)粗提取物中不同極性溶劑萃取物清除ABTS自由基的效果最佳的是乙酸乙酯相，IC50為(0.021±0.003)mg/mL，濃度較小時，隨著濃度提高，清除率迅速增加，當(dāng)濃度達(dá)到0.06 mg/mL時，清除能力就趨于平緩，清除率超過80%，比維生素C清除能力略低。此外，正丁醇相清除ABTS自由基能力也比較好，IC50為(0.034±0.005)mg/mL，當(dāng)含量大于0.08 mg/mL時，清除能力變化不大。三氯甲烷相、石油醚相和水相清除ABTS自由基的能力均隨著濃度的增加而增加，IC50分別為(0.048±0.012)、(0.061±0.004)、(0.068±0.006)mg/mL，在相同濃度下，乙酸乙酯相、正丁醇相、三氯甲烷相、石油醚相、水相的清除能力依次減弱。

表2 白術(shù)不同極性溶劑萃取物的IC50值

2.3.2 清除DPPH自由基能力 由表2、圖2可以看出，白術(shù)不同極性溶劑萃取物清除DPPH能力最強的是乙酸乙酯相，IC50為(0.031±0.005)mg/mL，當(dāng)濃度達(dá)到0.08 mg/mL時，清除DPPH自由基的能力與維生素C的清除能力大致相同。在低濃度下，正丁醇相、三氯甲烷相清除DPPH的能力相差不大，IC50也比較接近，分別為(0.040±0.002)、(0.042±0.001)mg/mL；在高濃度下，正丁醇相的清除效果明顯高于三氯甲烷相。石油醚相、水相清除DPPH自由基的能力相對較弱，隨著濃度的增大，其清除效果增強。三氯甲烷相、水相、石油醚相清除DPPH自由基的差異較小，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是同一種多酚類物質(zhì)對不同自由基的清除能力有差異，這與李偉等的報道[12-13]一致。

2.3.3 總還原能力 由圖3可知，白術(shù)不同溶劑萃取物總還原能力最好的是乙酸乙酯相，比其他相要好很多，當(dāng)濃度達(dá)到0.10 mg/mL時，與維生素C的總還原能力接近。當(dāng)濃度為 0.02 mg/mL 時，三氯甲烷相、水相、正丁醇相、石油醚相的總還原能力基本一致，隨著濃度增加，正丁醇相、三氯甲烷相的總還原能力的增加幅度明顯大于石油醚相、水相，總還原能力排序依次是維生素C>乙酸乙酯相>正丁醇相>三氯甲烷相>石油醚相>水相。

2.4 總多酚、總黃酮、總多糖含量與抗氧化活性的相關(guān)性

由表3可知，清除DPPH自由基與清除ABTS自由基IC50、清除DPPH自由基IC50與總還原能力、清除ABTS自由基IC50與總還原能力測試方法之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.929、-0.871、-0.899，清除ABTS自由基IC50與清除DPPH自由基IC50、總還原能力呈顯著相關(guān)(P<0.05)。總多酚含量與清除ABTS自由基IC50呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.901，P<0.05)，即總多酚含量越高，IC50越小，清除ABTS自由基能力較強，總多酚含量與清除DPPH自由基IC50呈中等相關(guān)(r=-0.870)，總多酚含量與總還原能力呈極顯著正相關(guān)(r=1.000，P<0.01)，即總多酚含量越高，總還原能力越強。總黃酮含量與清除ABTS自由基的IC50呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.912，P<0.05)，總黃酮含量與清除DPPH自由基的IC50呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.976，P<0.01)，總黃酮含量與總還原能力呈顯著正相關(guān)(r=0.913，P<0.05)。總多糖含量與清除ABTS自由基的IC50呈中等正相關(guān)(r=0.836)，總多糖含量與清除DPPH自由基的IC50呈顯著正相關(guān)(r=0.913，P<0.05)，即總多糖含量越高，IC50越大，清除ABTS自由基、DPPH自由基的能力越小，總多糖含量與總還原能力呈負(fù)相關(guān)(r=-0.676)。

表3 總多酚含量、總黃酮含量、總多糖含量、清除ABTS IC50、清除DPPH IC50、總還原能力間的相關(guān)性

綜上所述，白術(shù)不同極性溶劑萃取物中的總多酚、總黃酮含量排序為乙酸乙酯相>正丁醇相>三氯甲烷相>石油醚相>水相，說明白術(shù)多酚、黃酮主要為中等極性物質(zhì)，各萃取物中總多糖含量排序為水相>正丁醇相>乙酸乙酯相>三氯甲烷相>石油醚相。各萃取物清除ABTS自由基、DPPH自由基的能力及總還原能力的排序均為維生素C>乙酸乙酯相>正丁醇相>三氯甲烷相>石油醚相>水相，表明各極性部位的抗氧化能力排序為乙酸乙酯相>正丁醇>三氯甲烷>石油醚>水相，與樣品中總黃酮、總多酚的含量排序相同，存在顯著相關(guān)性，而總多糖含量越高，樣品清除ABTS、DPPH自由基的能力越弱，說明黃酮類、多酚類可能是白術(shù)的主要抗氧化物質(zhì)，多糖不是白術(shù)的主要抗氧化物質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用清除DPPH自由基、ABTS自由基法與總還原力法對白術(shù)不同極性溶劑萃取物的抗氧化能力進行了系統(tǒng)評價。結(jié)果表明，白術(shù)不同極性溶劑萃取物清除ABTS自由基、DPPH自由基能力與總還原能力的排序相同。乙酸乙酯相清除ABTS自由基、DPPH自由基的效果最好，IC50分別為(0.021±0.003)、(0.031±0.005)mg/mL，總還原能力也最強，同時，乙酸乙酯相中總多酚、總黃酮含量最高，分別是(37.54±0.51)%、(30.53±0.92)%。其他萃取物的總黃酮、總多酚含量與抗氧化活性強弱排序一致，總多酚、總黃酮含量與清除自由基能力呈負(fù)相關(guān)，與總還原能力呈顯著或極顯著正相關(guān)，而總多糖含量與清除自由基能力呈正相關(guān)，提取物中黃酮類、多酚類可能是主要抗氧化物質(zhì)，可以通過進一步的分離提純活性較好、多酚黃酮含量高的乙酸乙酯相、正丁醇相，得到抗氧化活性物質(zhì)。

本研究綜合評價了白術(shù)提物不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性，并探討了抗氧化能力與總多酚、總黃酮和多糖含量之間的相關(guān)關(guān)系，可以為白術(shù)抗氧化活性物質(zhì)的分離研究提供科學(xué)依據(jù)。