人附睪分泌蛋白4在子宮內膜癌組織中的表達及臨床意義*

孫潤蛟　金仙玉　劉桂香　王文建　劉言厚　高言國

人附睪分泌蛋白4在子宮內膜癌組織中的表達及臨床意義*

孫潤蛟①金仙玉②劉桂香①王文建③劉言厚①高言國④

目的：通過檢測人附睪分泌蛋白4（HE4）在子宮內膜癌組織中的表達水平，觀察HE4與不同臨床及病理特征的相關性，探討其在子宮內膜癌診斷、治療及預后中的臨床意義。方法：應用即用型免疫組織化學染色兩步法對32例經病理學證實為子宮內膜癌的石蠟標本進行HE4檢測。分析HE4表達與子宮內膜癌FIGO分期、病理類型、組織學分級、肌層侵犯深度、腫瘤的大小和年齡的關系等各組間的差異，分析其與子宮內膜癌臨床病理特征的關系。結果：（1）HE4陽性顆粒主要定位在細胞膜和細胞質上，在32例子宮內膜癌組織中的HE4的陽性表達率較高，為87.5%。（2）HE4在組織學分級為高分化組的子宮內膜癌組織中的陽性表達率及強度均高于中低分化組（P<0.05）。（3）HE4蛋白在晚期子宮內膜癌組織中陽性表達率及表達強度均高于早期組（P<0.05）。（4）HE4蛋白在子宮內膜癌的陽性表達與年齡、病理分型、肌層侵犯深度及腫瘤大小均無關（P>0.05）；但在HE4強陽性表達程度方面，深肌層浸潤者強陽性表達（61.5%）多于無深肌層浸潤者（36.8%），其直徑≥2 cm的腫瘤強陽性表達（61.1%）高于直徑<2 cm的腫瘤（28.6%），差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：HE4基因的高表達與子宮內膜癌的侵襲、進展等方面關系密切，可以作為腫瘤侵襲進展的標志以及評估子宮內膜癌預后的一個重要指標。

人附睪分泌蛋白4； 子宮內膜癌； 免疫組化法； 預后

First-author’s address：The Central Hospital of Zhuanghe，Zhuanghe 116400，China

眾所周知，子宮內膜癌是原發于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，占女性全身惡性腫瘤的7%。可發生于任何年齡，平均發病年齡為60歲，其中50歲以上女性發病居多。近些年由于生存年齡的增加、外源性雌激素的廣泛使用及內分泌疾病的增加，以及人們保健意識的增強，在世界范圍內發病率有上升趨勢，同時平均發病年齡也有低齡化的趨勢。治療方式總的原則是以手術為主，術后依據手術分期以及高危因素決定是否進一步輔以放化療或內分泌治療等。早期發現，治愈率高，預后良好；但晚期及復發性子宮內膜癌的預后不良，死亡率高。

眾多研究表明，子宮內膜癌是一個復雜的過程，它的病因機制目前尚未完全闡明，分子遺傳學研究支持不同類型的子宮內膜癌在發生發展過程中有不同的遺傳學改變這一假說：Ⅰ型出現DAN錯配修復基因，PTEN，K-ras基因的變化，Ⅱ型則經常出現P53和HER-2基因突變和擴增[1]。所以，免疫組化在子宮內膜癌的診斷中具有愈來愈重要的作用，如判斷預后及影響因素、指導術后內分泌治療或化療等。

人附睪分泌蛋白4（HE4）作為WAP四硫化核心域2（WFDC2），是人類血清中分泌的小分子糖蛋白。作為血清學指標，經多位學者證實，它對女性卵巢癌、子宮內膜癌及宮頸癌均有診斷意義。可以單獨或結合CA125成為檢測子宮內膜癌的有效生物指標。一項新的研究發現：HE4作為子宮內膜癌的腫瘤標志物，它的敏感性和特異性在診斷預后和疾病的監測中，是迄今為止發現的最敏感最準確的子宮內膜癌標志物[2]。很多證據表明子宮內膜癌組織中HE4 mRNA和蛋白表達顯著增加[3-7]。而研究中也證實HE4在密切關聯的階段組織中的表達與血清中HE4的表達一致，血清中HE4水平能代表子宮內膜癌組織中HE4的表達水平[8-9]，推測這與腫瘤組織局部分泌HE4增加及負荷加重有關。但目前大多數研究集中在血清學檢測的開發和改進及HE4與盆腔良性疾病的鑒別診斷中。

本研究通過免疫組化檢測HE4在子宮內膜癌中的表達。并分析HE4表達與子宮內膜癌FIGO分期，病理類型，組織學分級，肌層侵犯深度，腫瘤的大小和年齡的關系，探討其臨床意義，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 收集大連市中心醫院2011年1月1日-2014年2月18日行子宮切除后經病理學證實為子宮內膜癌的標本蠟塊共32例。排除標準：（1）子宮內膜癌術前行激素治療者；（2）術前行化療或放療；（3）同時合并其他惡性腫瘤者。32例子宮內膜癌，年齡42～80歲，中位年齡56歲；根據世界衛生組織提出的年齡劃分法，青、中年組（<60歲）18例，老年組（≥60歲）14例；組織學分級高分化組病例8例，中-低分化組病例24例；按照FIGO分期（2009）早期（Ⅰ～Ⅱ期）25例，晚期（Ⅲ～Ⅳ期）7例；子宮內膜腺癌23例，特殊類型子宮內膜癌9例，其中包括子宮內膜漿液性腺癌4例，漿乳伴透明細胞癌1例，鱗腺癌2例，腺癌伴部分透明細胞癌2例；肌層侵犯深度<1/2者19例，≥1/2者13例；腫瘤大小<2 cm者14例，≥2 cm者18例。

1.2主要試劑與方法

1.2.1主要試劑 HE4鼠抗人單克隆抗體、免疫組化二步法試劑盒，防脫片劑APES、DAB試劑等分別于北京中山金橋生物科技有限公司購買。

1.2.2免疫組織化學 采用免疫組化兩步法檢測HE4蛋白的表達。嚴格按試劑盒說明書進行操作。石蠟包埋組織以3～4 μm連續切片石蠟包埋組織；常規脫蠟和水化；孵育；高壓抗原修復；滴加1滴或50 μL的I抗（鼠抗人附睪蛋白4單克隆抗體），在室溫下孵育1 h；PBS緩沖液沖洗；滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體，室溫孵育10～15 min。PBS液沖洗后滴加2滴或100 μL新鮮配制的DAB顯色劑；自來水沖洗干凈，過蒸餾水。蘇木素復染2 min。蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明、封片。以PBS代替I抗作陰性對照，上皮性漿液性卵巢惡性腫瘤陽性切片作HE4免疫組化染色的陽性對照。

1.3判定標準 光學顯微鏡400倍下每張切片隨機選取10個視野的癌細胞，根據染色的陽性細胞百分比分為四級：<10%、10%～24%、25%～49%、50%，分別評為0、1、2、3分。根據陽性細胞染色深淺程度，將不顯色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別評為0、1、2、3分，目前多采用積分綜合計量，兩者得分相乘作為該切片的最終結果：<3分為陰性，>4分為陽性，>6分為強陽性。病理切片分別由3位高年資病理醫師輪流讀片評定。

1.4統計學處理 運用SPSS 18.0統計學軟件對HE4在不同子宮內膜癌組織中的表達差異進行相關性分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1HE4在子宮內膜癌組織中的表達 HE4陽性顆粒主要定位在細胞膜及細胞漿上；著色呈棕黃色或棕褐色；視野內陽性細胞呈點、片狀分布，見圖1～5。在32例癌組織中的HE4陽性13例（陽性表達率為40.6%），強陽性15例（陽性表達率為46.9%），總陽性表達率為87.5%。

圖1　HE4在ⅠB1期子宮內膜鱗腺癌中呈陰性表達（×400）

圖2　HE4在ⅠB2期子宮內膜腺癌組織中呈陰性表達（×400）

圖3　HE4在ⅢA3期子宮內膜漿液性乳頭樣腺癌組織中呈陽性表達（×400）

圖4　HE4在ⅢA3期子宮內膜漿液性乳頭狀腺癌伴部分透明細胞癌中呈強陽性表達（×400）

圖5　HE4在ⅡB2-3期子宮內膜腺癌中呈強陽性表達（×400）

2.2HE4在不同臨床病理特征的子宮內膜癌組織中的表達

2.2.1子宮內膜癌組織中HE4表達與組織學分級的關系 HE4在組織學分級分別在高、中-低分化組的子宮內膜癌組織中的陽性表達率為62.5%、95.8%，兩者比較差異有統計學意義（ χ2=8.253，P=0.004）。HE4在分化程度好的高分化中多呈弱陽性表達或陰性表達，隨著組織學分級增加，表達強度也顯著增加。HE4在子宮內膜癌組織中表達強度和組織學分級為正相關關系（r=0.477，P=0.018）。見表1。

2.2.2子宮內膜癌組織中HE4表達與臨床分期的關系 標本按照FIGO 2009手術-病理分期標準進行分期，因Ⅱ期病例少，僅3例，沒有Ⅳ期病例，將早期（Ⅰ～Ⅱ期）和晚期（Ⅲ～Ⅳ期）子宮內膜癌組織HE4水平進行比較分析，總陽性表達率分別為84.0%、100%，兩者比較差異有統計學意義（ χ2=7.515，P=0.009）。而隨著分期的進展，組織中HE4蛋白的表達程度比早期增強，提示HE4的表達程度與臨床分期呈正相關關系（r=0.238，P=0.026）。見表2。

表1　子宮內膜癌組織中HE4表達與組織學分級的關系　例（%）

表2　子宮內膜癌組織中HE4表達與臨床分期的關系 例（%）

2.2.3子宮內膜癌組織中HE4表達與深肌層浸潤的關系 HE4在有深肌層浸潤的子宮內膜癌組織中與無深肌層浸潤者總陽性表達率分別為84.6%、89.5%，兩者比較差異無統計學意義（ χ2=0.441，P=0.802），提示HE4的表達程度與深肌層浸潤無關系（r=0.117，P=0.067）。但在表達程度上，HE4在深肌層浸潤者強表達（61.5%）多于無深肌層浸潤者（36.8%），差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3　子宮內膜癌組織中HE4表達與深肌層浸潤的關系 例（%）

2.2.4子宮內膜癌組織中HE4表達與腫瘤直徑大小的關系 HE4在腫瘤直徑大小≥2 cm者陽性表達率（94.4%）高于腫瘤直徑<2 cm者（78.6%），兩者比較差異無統計學意義（ χ2=3.66，P=0.16），提示HE4的表達程度與腫瘤直徑大小無關系（r=0.125，P=0.13）。但在兩組強表達比較中，HE4在腫瘤直徑大小≥2 cm者（61.1%）高于腫瘤大小<2 cm者（28.6%），差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

表4　子宮內膜癌組織中HE4表達與腫瘤直徑大小的關系 例（%）

2.2.5子宮內膜癌組織中HE4表達與年齡的關系 HE4在<60歲和≥60歲的子宮內膜癌組織中，總陽性率分別為83.3%、92.9%，兩者比較差異無統計學意義（ χ2=3.817，P=0.371），提示HE4的表達程度與年齡無關系（r=0.311，P=0.16），見表5。

表5　子宮內膜癌組織中HE4表達與年齡的關系　例（%）

2.2.6子宮內膜癌組織中HE4表達與組織病理類型的關系 32例研究的樣本中，子宮內膜腺癌23例，特殊類型9例，其中包括子宮內膜漿液性腺癌4例，漿乳伴透明細胞癌1例，腺鱗癌2例，腺癌伴部分透明細胞癌2例。HE4在腺癌及特殊類型子宮內膜癌組織中總陽性率分別為87.0%、88.9%，兩者比較差異無統計學意義（ χ2=0.384，P=0.825），提示HE4的表達程度與組織病理類型無關系（r=0.099，P=0.36），見表6。

表6　子宮內膜癌組織中HE4表達與的關系　　例（%）

3　討論

HE4基因又名WFDC2（WAP四二硫化物核心域2），是乳清酸蛋白（WAP）結構域家族蛋白中的一員，位于20q12-q1312，全長約12 kb，有5個外顯子和4個內含子組成，位點包含14個編碼WAP同源蛋白的基因。分子結構中包含特征性WAP結構域。Chhikara等[10]研究證實，HE4是一種新的跨類蛋白酶抑制劑。分析同屬于4-DSC家族中具有WAP結構的蛋白酶抑制劑如SLPI（分泌型白細胞蛋白酶抑制因子），推測HE4可能會有助于抵抗蛋白水解性質的微生物毒力因子、參與免疫防御，發揮免疫調節作用。

有研究認為子宮內膜癌中頻繁基因擴增的熱點是染色體20q、HE4存在區和WAP，提供一個潛在的HE4表達增加的機制[11-12]。Micci等[12]表明，20q的獲得是一個子宮內膜癌中的常見異常。許多癌基因通過基因擴增來實現高水平的表達。人類中HE4、SLPI（分泌型白細胞蛋白酶抑制因子）和其他幾個在20q12-13的WAP成員在人體某個區域經常放大各種癌癥[12-13]。這些結果表明，體細胞遺傳物質的獲得可能是一種機制，通過這種機制HE4在子宮內膜癌細胞中實現高水平表達。

在郭冰沁等[14]的研究中采用小鼠異種移植模型測量體內癌細胞擴散中發現HE4超表達顯著促進細胞增殖、細胞入侵能力、克隆性生長和子宮內膜癌異種移植中的腫瘤生長等惡性表型；同時體內實驗表明，HE4超表達促進子宮內膜癌異種移植在SCID鼠中的增長，這證明HE4超表達直接影響子宮內膜癌腫瘤的進展。因此，該研究認為HE4不是癌細胞的副產品，也不是惡性腫瘤的替代標志，它可能是子宮內膜癌發展的致瘤或腫瘤促進因素[15]。

房青等[16]在卵巢癌的研究中也發現，HE4-siRNA能有效地特異性下調卵巢癌細胞內HE4mRNA和蛋白表達，能顯著抑制侵襲率，但他的研究結果提示HE4能同時抑制細胞的增殖活力下降約40%，提示HE4有可能成為卵巢癌轉移防止的潛在靶點[16]。現在已經有將PHE4-652作為啟動子應用于卵巢癌的靶向性基因治療的研究[17]。但目前還沒有將HE4應用于子宮內膜癌治療方面的報道或研究。

HE4在子宮內膜癌組織中的表達，1991年Kirchhoff對HE4蛋白組織定位，結果顯示正常組織HE4主要分布在生殖系統中的上皮細胞如曲精細管、附睪、輸精管、輸卵管上皮細胞和子宮內膜。除了卵巢漿液性癌中高表達外，其他的惡性腫瘤如子宮內膜癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌也中度表達，而胃腸道和泌尿道腫瘤則表達較低。Drapkin等[18]及Galgano等[19]在子宮內膜癌組織及細胞株中發現HE4 mRNA和HE4蛋白的明顯高表達，文獻[3]研究認為HE4具備成為子宮內膜癌的腫瘤標記物的候選基因。本組應用免疫組化研究子宮內膜癌組織中HE4的表達情況，結果發現HE4陽性顆粒主要定位在細胞膜及細胞漿上；著色呈棕黃色或棕褐色；視野內陽性細胞呈點、片狀分布。32例子宮內膜癌組織中表達率均較高，總陽性表達率為87.5%，與文獻[19]報道的90%基本一致，這也證實HE4可以作為子宮內膜癌的高敏感性的腫瘤標記物。

HE4表達與子宮內膜癌臨床病理因素的關系，目前各家學者對HE4在子宮內膜癌中的表達研究大致相同，認為血清HE4水平與手術病理分期、淋巴轉移、肌層浸潤、宮頸轉移呈正相關，并在術前預測、評估及術后監測等方面具有良好的價值。報道結果不一致的是在HE4在子宮內膜癌中的表達水平的相關因素中，大多數認為與年齡、分化程度無關；但少數研究認為，HE4的表達程度與年齡及分化程度有關。楊彩虹等[4]用免疫組化方法的研究中發現：HE4的表達水平在子宮內膜癌組織中的增加與手術-病理分期為正相關關系，和患者的年齡，組織學分級和病理類型是不相關的。而Bignotti等[20]用實時定量PCR及免疫組化方法檢測HE4基因mRNA和組織中HE4蛋白的表達，酶聯免疫吸附法測定血清HE4蛋白的表達，檢測結果在子宮內膜癌組織中，HE4 mRNA表達和HE4蛋白表達高于正常子宮內膜組及子宮內膜良性病變組，且血清HE4水平與高齡、FIGO分期、絕經狀態、病理分級、肌層浸潤深度、腹水陽性、淋巴結陽性等呈正相關。

在筆者的研究發現中，隨著組織學分級、臨床分期增加HE4表達陽性率增加，且差異有統計學意義（P<0.05）。HE4與組織學分級和臨床分期呈正相關。HE4在分化程度較好的高-中分化多呈弱陽性或陰性表達，隨著組織學分級的增加，它的表達程度也顯著增強；晚期病例組中HE4表達的明顯強于早期病例組。本研究中深肌層浸潤和原發腫瘤大小在HE4的總表達率方面差異無統計學意義（P>0.05）。但在表達程度方面，深肌層浸潤的癌組織的HE4的表達強度明顯高于浸潤深度小于1/2層。而腫瘤直徑≥2 cm的表達也明顯高于腫瘤直徑小者，提示腫瘤越大，肌層侵犯越深，HE4的表達越強。子宮內膜癌的預后危險因素有：非子宮內膜樣癌或低分化腺癌、深肌層浸潤、脈管間隙受累、腫瘤體積大、宮頸轉移、淋巴結轉移和子宮外轉移等[21]。研究中發現HE4高表達與組織FIGO分期、分化程度、及深肌層浸潤及癌灶大小有關，這表明隨著病情的發展和惡性程度的增高，HE4在子宮內膜癌組織中明顯過度表達，提示HE4的高表達參與了子宮內膜癌的進展，同時HE4與子宮內膜癌的預后密切相關，HE4可以作為侵襲進展的標志以及決定預后的重要指標。在本研究中HE4血清水平與晚期子宮內膜癌以及子宮肌層的深部入侵和原發腫瘤直徑密切相關，血清HE4水平的增加和較差的預后因素相關。

有研究顯示：子宮內膜受到激素水平的嚴格控制，或其受體的變化影響，而這也可能導致子宮內膜癌細胞中的高HE4水平[22]。應用組織微陣列和實時PCR研究證實子宮內膜腺癌和漿液性類型的子宮內膜癌中的HE4高水平表達，筆者的研究結果與既往一致，HE4的表達不論是在雌孕激素受體表達陽性的子宮內膜腺癌或惡性程度高的特殊類型的子宮內膜癌中都有較高表達率，其差異無統計學意義（P>0.05）。這與Galgano等[19]應用寡核苷酸芯片mRNA雜交和組織芯片免疫組化法檢測結果相同：即16例子宮內膜癌組織中90%的HE4為陽性，并且與組織病理類型無關。

文獻[23-25]報道血清HE4水平和年齡有關，蔡斌等[24]檢測健康婦女血清HE4水平，分析913例不同年齡層次中，血清HE4水平在<60歲組和≥60歲組比較，差異有統計學意義（P<0.01）。但在<60歲各年齡組血清HE4水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。根據ROC曲線，老年組曲線下面積最小，提示HE4診斷青中年卵巢癌的能力優于老年卵巢癌。國外也有報道指出在1591例受試人群中年齡是影響血清HE4濃度的重要因素。本研究中HE4在老年組子宮內膜癌組織中的陽性表達率略高于中青年組，可能與多數老年組患者細胞分化程度差和肌層浸潤發生率高有關，但不同年齡組比較差異無統計學意義（P>0.05），提示HE4在組織中的表達與年齡無關。這與楊彩虹等[4]的研究結果一致。分析血清中分泌的HE4的水平增高可能是老年人腎小球濾過率低的原因。但是，本研究的研究對象只討論惡性子宮內膜組織中HE4表達水平與年齡的關系，由于病例資料收集的局限性及試驗方法的單一，以后可能需要擴大樣本并輔以血清學的診斷方法聯合試驗以進一步證實。

綜上所述，HE4基因的高表達在子宮內膜癌的侵襲、進展等方面關系密切。但目前除了將血清學HE4用于臨床診斷及監測外，從分子機制水平探索HE4在子宮內膜癌的發病機制有更大的意義，從而為子宮內膜癌治療的尋找新思路。

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SUN Run-jiao，JIN Xian-yu，LIU Gui-xiang，et al.//
Medical Innovation of China，2016，13（30）：001-007

Objective：Through the detection of human epididymis secretory protein 4（HE4） expression in endometrial carcinoma and correlation study of HE4 and different clinical and pathological features，explore the diagnosis of endometrial cancer，the clinical significance of the treatment and prognosis.Method：The paraffin embedded specimens of 32 cases of endometrial carcinoma were confirmed by pathological examination，they were detected by using the two step method of immunohistochemical staining for HE4.The relations of the expression of HE4 in endometrial carcinoma and FIGO staging，pathological type，histological grade，myometrial invasion，tumor size and age differences between groups were analyzed，and its relationship with clinicopathological features of endometrial carcinoma was analyzed.Result：（1）HE4 positive particles were mainly localized in the cell membrane and cytoplasm，and the positive expression rate of HE4 in 32 cases of endometrial carcinoma was higher，which was 87.5%.（2）The positive expression rate and intensity of HE4 in the endometrial carcinoma tissues of the high differentiation group were higher than those in the low and middle differentiation group（P<0.05）.（3）The positive expression rate and the expression intensity of HE4 protein in advanced endometrial carcinoma were higher than those in the early stage（P<0.05）.（4）The positive expression of HE4 protein in endometrial carcinoma was not related to the age，pathological type， depth of invasion and tumor size（P>0.05），but in the HE4 positive expression level，deep myometrial invasion strong positive expression（61.5%） than no deep myometrial invasion（36.8%），the diameter of the tumor was greater than 2 cm strong positive expression（61.1%）is higher than the diameter <2 cm tumor（28.6%），the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion：The high expression of HE4 gene is closely related with the invasion and progression of endometrial carcinoma，it can be used as a marker for the progression of tumor invasion and an important index of evaluating the prognosis of endometrial carcinoma.

Human epididymis secretory protein 4； Endometrial carcinoma； Immunohistochemical method； Prognosis

遼寧省大連市醫學研究科研課題（WSJ/KJC-01-JL-01）

①遼寧省莊河市中心醫院 遼寧 莊河 116400

②遼寧省大連市中心醫院

③遼寧省莊河市婦幼保健醫院

④大連大學附屬新華醫院

高言國

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.30.001

（2016-06-22） （本文編輯：郎威）